6. Añadir 20 ml de proteinasa K y mezclar con vortex. Incubar a 55 ºC. Mezclar con vortex ocasionalmente durante la incubación para mezclar. Incubación 1-3 horas.
40. Como no depende de sistemas enzimáticos no se afectan por la presencia de inhibidores enzimáticos en las muestras clínicas y el proceso de extracción de DNA puede ser más simple.
44. La detección se realiza por incubar el complejo con dioxetano, enzima que activa el sustrato y mide la emisión de luz con un luminometro. La señal resultante es directamente proporcional a la cantidad de diana en la muestra
45. Para reducir ruido de fondo por la hibridación inespecífica se emplea isocitidina e isoguanosina en las sondas marcadas y preamplificador de la señal. Forman parejas de base uno con otro pero no con ninguna de las cuatro bases naturales. Así se incrementa la amplificación de la señal específica de la diana sin incrementarse la señal de fondo.
49. Los hibridos DNA-RNA son capturados por anticuerpos antihíbridos que son usados para para cubrir la superficie de un tubo
50. Luego se añaden anticuerpos antihibridos conjugados con fosfatasa alcalina.
51. El anticuerpo conjugado es detectado con un sustrato quimioluminiscente y la luz emitida es medida en un luminometros.
52. Son multiples conjugados de fosfatasa alcalina los que se unen a cada molécula de híbrido lo que amplifica la señal y la luz emitida es proporcional a la cantidad de DNA diana.
57. Proclive a la contaminación cruzada con material de otras muestras pudiendo dar falsos positivos
58.
59.
60. Realizado por la acción de una enzima, la DNA polimerasa , que bajo ciertas condiciones adecuadas puede copiar DNA
61. La PCR se realiza en el laboratorio por un coctel de sustancias: DNA diana, un exceso de dos oligonucleotidos cebadores (primers), una DNA polimerasa estable al calor, una mezcla equimolecular de desoxiribonucleotido trifosfatos (dATP, DCTP, DGTP, DTTP), MgCl2, KCl y tampón Tris-HCl
62. Cada primer se une a una cadena de DNA flanqueando un segmento de la doble cadena menor de 100 pares de nucletidos
63. Para iniciar la PCR, la mezcla se calienta para separar las dos cadenas de DNA diana y luego enfriado para permitir al primer alinearse con el DNA diana.
64.
65. Los productos de la extensión de los primers son disociados del DNA diana por calor y cada producto de la extensión así como el DNA diana sirve como modelo para ciclos posteriores de alienación de los primers y extensión.
66. Al final de cada ciclo el producto de la PCR es doblado.
67. Todo el proceso es realizado en un termociclador que controla de manera precisa la temperatura de cada paso, el tiempo de cada pasoy el número de ciclos.
68.
69.
70. Primero se produce DNA complementario del RNA diana por transcripción inversa y luego el DNAc es amplificado mediante PCR
71. Para ello se usa una DNA polimerasa del Thermus thermophilus que funciona tanto como retrotranscriptasa y como DNA polimerasa y es termoestable.
72. Esto es importante porque antes se empleaba una retrotranscriptasa del virus de la mieloblastosis aviar que no era termoestable y la formación del DNAc se tenía que hacer a temperatura muy baja, por debajo de la temperatura óptima de alineación, dando a alineamiento inespecíficos y provocando resultados ineficientes.
73.
74. Los primers a emplear tienen que tener igual temperatura de alienamiento y carecer de complementariedad.
77. Usando cocientes muy precisos de estos dos fluorocromos se ha creado hasta 100 grupos de microesferas diferentes cada con unas características espectrales distintas.
78. Cada grupo de microesfera puede poseer un reactante diferente sobre su superficie. Para estudio de ácidos nucleicos se unen las sondas de oligonucleotidos a la superficie de las microesferas. Como cada esfera puede distinguirse con su diferente longitud de onda pudiendo medirse hasta 100 parámetros distintos
79. Estas microesferas se miden medinate un citometros de flujo específico y como cientos de esferas pueden ser analizadas por segundo pueden medirse hasta 100 diferentes reacciones en un único tubo de reacción en pocos segundos.
80.
81. El software registra la emisión de fluorescencia en cada ciclo y genera una curva de amplificación para cada reacción
82. La cantidad de diana en una muestra desconocida es determinada por medir el ciclo en que la muestra sobrepasa un umbral y usar una curva estandard con una diana a concentración conocida.
86. Análisis en gel También puede luego transferirse a una membrana de nitrocelulosa o nylon y hibridarse a una sonda específica para aumentar la sensibilidad y especificidad de la detección
87.
88. El producto unido se detecta por un cambio de color que aparece tras añadir un conjugado enzimático y el sustrato adecuado.
93. Line probe assay Producto de PCR marcado con biotina se hibrida de manera específica con sondas inmobilizadas sobre una tira Tras hibridación estreptavidina cojugada con fosfatasa alcalina reacciona con el sustrato añadido en ultimo lugar.
103. El tiempo del análisis viene dado por el tiempo que dura la amplificación y este depende de la velocidad en que el termociclador cambie de temperatura, habiendo alguno que cambia hasta 20 ºC por segundo.
124. En la PCR se reemplaza dUTP por DTTP, así que DUTP es incorporado en la cadena de DNA que se sintetiza
125. Si el producto conteniendo UTP está presente como contaminante, la adición de UNG a la reacción en la retirada de residuos de desoxiuracilo destruyendo el DNA contaminante.
