Disrupcion celular

DISRUPCIÓN CELULAR
Operaciones y Procesos Biotecnológicos II
DISRUPCIÓN CELULAR

1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en la
industria para separar y/o purificar productos de
interés.
Objetivos de Operaciones y Procesos Biotecnológicos II:
2) Evaluar las variables que permiten optimizar los
procesos habitualmente involucrados en la separación
de residuos insolubles, el aislamiento y la purificación
de un determinado producto.
DISRUPCIÓN CELULAR

Productos de interés liberados
naturalmente al medio
Disrupción celular Lípidos
Proteínas recombinantes
Enzimas
Antibióticos
?
ADN,ARNMicroorganismo
Productor
DISRUPCIÓN CELULAR

Proceso General
Que clase de célula
se quiere destruir?
Cuál es el producto
que queremos
extraer?
Selección del
método de
disrupción celular
a emplear
Puesta a punto
del método
seleccionado
Evaluación
acerca de los
rendimientos
obtenidos
Conclusiones
DISRUPCIÓN CELULAR

¿Qué es lo que debemos
conocer de la célula a la
hora de diagramar una
disrupción?
DISRUPCIÓN CELULAR

Estructura de la Membrana Plasmática
Membrana Plasmática
- Actualmente el modelo que describe la membrana plasmática es el del
“mosaico fluido”.
DISRUPCIÓN CELULAR

Las principales funciones de la membrana plasmática son:
Membrana Plasmática
 Servir de sitio estable para la catálisis enzimática.
 Servir de receptores que reconocen señales de determinadas moléculas
y transducir la señal al citoplasma.
 Ayudar a la compartimentalización sub-celular .
 Protección.
 Comunicación intercelular.
 Regular el intercambio de sustancias entre el interior y exterior celular
(lo que entra y sale de la célula).
 Aislar selectivamente el contenido de la célula del ambiente externo.
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o El tipo de célula con el que se vaya a trabajar es importante:
o La pared celular es una estructura rígida y compleja que
protege a la célula del ambiente, manteniendo su forma y
presión osmótica.
Pared Celular
- células vegetales (plantas y algas)
- hongos y levaduras
- bacterias (Gram positivas y Gram negativas)
DISRUPCIÓN CELULAR

- La red de mureína (peptidoglicano) esta
muy desarrollada (puede presentar hasta
50 capas).
- Es frecuente la presencia de los
aminoácidos L-diaminopimélico o de
lisina.
- En ella se encuentran ácidos teicoicos y
lipoteicoicos.
- No presentan lipo-polisacáridos.
- Presentan una sola bicapa lipídica.
Pared Gram Positiva
- Presentan bajo contenido proteico.
- Alto contenido de lípidos.
Staphylococcus
DISRUPCIÓN CELULAR

- La red de mureína presenta una sola
capa.
- Contiene únicamente meso-
diaminopimélico y nunca contiene lisina.
- Hasta ahora no han podido
encontrarse ácidos teicoicos o lipo-
teicoicos.
- Se encuentran grandes cantidades de
lipoproteínas y lipo-polisacáridos que
representan hasta el 80 % del peso seco
de la pared celular.
- Tienen dos bicapas lipídicas.
- Presentan porinas en la membranas
externa.
Pared Gram Negativa
E. Coli Operaciones y Procesos Biotecnológicos II
DISRUPCIÓN CELULAR

Pared celular de Hongos y Levaduras
- Es una estructura muy gruesa (100-200 nm)
- La pared celular esta compuesta por dos capas de polisacáridos, una
capa interna transparente y amorfa, constituida principalmente de β-
1,3 y β-1,6-glucanos. En la capa externa se encuentran ubicadas las
mano-proteínas, ancladas a la capa interna de β-glucanos o bien
atravesándola.
- Representa del 15-25% del peso celular en base seca.
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Pared celular CélulasVegetales
- Pared primaria: mide entre
100 y 200 nm de espesor,
compuesta entre un 9 y un
25% de celulosa
- Laminilla media: Es el lugar
que une las paredes primarias
de dos células contiguas.
- Pared secundaria: (cuando existe) se
relaciona con la especialización de cada tipo
celular. A diferencia de la pared primaria,
contiene una alta proporción de celulosa,
lignina y/o suberina. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II
DISRUPCIÓN CELULAR

DISRUPCIÓN CELULAR
Células Animales
Micelios
Bacilos Gram (-)
Bacilos Gram (+)
CélulasVegetales
Levaduras
Cocos Gram (-)
Esporas
Dificultad Para la Disrupción Celular

Métodos de Disrupción Celular
Métodos mecánicos:
- Son inespecíficos.-Suelen ser mas efectivos
que los métodos químicos.
Se basan en fuerzas de corte (shear stress) que deforman las células
hasta el rompimiento de sus cubiertas.
- Generalmente son mas
fáciles de escalar que los
métodos no-mecánicos .
- La separación del producto
deseado de otros materiales (ac.
nucleicos, proteínas, trozos de la
pared celular, etc.) puede llegar a
ser dificultosa.
- Pueden llegar a dañar productos
lábiles.
- Requieren mucha energía.
- Generan elevadas temperaturas.
DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos de Disrupción Celular
Métodos no mecánicos:
- Por sí mismos, estos métodos
no suelen ser muy eficientes.
- Por lo general son menos
severos que los mecánicos.
Rompen las cubiertas celulares induciendo la lisis celular, a través
de medios químicos, físicos o enzimáticos.
- No generan grandes daños
a las célula, facilitando la
posterior purificación del
producto de interés.
- Son mas específicos.
- Pocos métodos no mecánicos
pueden llegar a ser escalados
exitosamente.
DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos
Homogenizadores de alta presión
Se aplica una elevada presión a una
suspensión de células forzándolas a
través de una válvula, sometiendo a las
células a un alto estrés de corte,
rompiendo las membranas.
Es uno de los mas utilizados para disrupción celular a gran escala.
DISRUPCIÓN CELULAR
El mecanismo de disrupción se
daría por fuerzas de corte en la
región de la válvula, cavitación
(debido a las regiones de baja
presión generadas) y al impacto
contra el anillo.

Métodos mecánicos
Homogenizadores Microfluidizadores (microfluidizer homogenizer)
El mecanismo de disrupción
realizado por este equipo
genera partículas de mayor
tamaño que el homogenizador
de alta presión.
En los microfluidizadores, el líquido se divide en dos o más corrientes que se
bombean a elevadas presiones (en algunos equipos más de 270 MPa) y
grandes velocidades, unas contra otras en un ángulo de 180° cayendo
repentinamente la presión tras chocar ambas corrientes.
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Métodos mecánicos
Bead mills (molinos a esferas)
- Aspectos a considerar al trabajar con estos equipos: tamaño de las
esferas (0,2-15mm), cantidad y material de las esferas; velocidad de
agitación; temperatura de trabajo; velocidad de flujo y concentración de
la suspensión a tratar.
- Básicamente consiste en un agitador a
discos montado sobre un motor central
que gira en una cámara central, la cual
es cargada con esferas de vidrio, metal
u otro material.
- Son de los mas utilizados a gran escala.
DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos
- Las ondas de ultrasonido crean muchas micro-
burbujas en muchos sitios de nucleación
dentro de la suspensión celular. Estas micro-
burbujas luego colapsan implosionando durante
el período de rarefacción (compresión) de la
onda.
- Este fenómeno, denominado cavitación,
produce un shock de ondas muy intenso,
generando un fuerte estrés local, deformando
al límite las células y produciendo así su
consecuente ruptura.
- El ultrasonido utiliza frecuencias entre 20 y 50
kHz.
Sonicadores (ultrasonido)
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Métodos no-mecánicos
Dentro de estos tipos de métodos podemos clasificar tres
sub-clases principales:
3) Métodos enzimáticos
2) Métodos físicos
1) Métodos químicos
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1) Métodos Químicos
Agentes Caotrópicos (urea, clohidrato de guanidina)
Interfieren con los enlaces no covalentes (puentes de hidrógeno,
fuerzas de van der Walls) desorganizando la estructura del agua
haciéndola menos hidrofílica, debilitando las interacciones soluto-
soluto.
Tratamiento con álcalis (hidróxido de sodio e hipoclirito)
Se produce la saponificación de los lípidos de las membranas. Es una
técnica muy severa pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando el
producto de interés sea resistente a la degradación a pH elevados.
Tratamiento con solventes orgánicos (cloroformo, tolueno)
Los solventes orgánicos permeabilizan las membranas celulares
disolviendo componentes hidrofóbicos de la pared, como los
fosfolípidos de la membrana interna en bacterias Gram (-).
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Agentes Quelantes (EDTA):
Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen los LPS adyacentes
haciendo que se liberen parte de los LPS conteniendo proteínas y
fosfolípidos de la membrana (Gram -).
Antibióticos:
Son efectivos contra bacterias Gram (-) (β-lactámicos) . Distintos
antibióticos causan la lisis por distintos mecanismos. No se utilizan a
gran escala.
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Tratamiento con detergentes
La efectividad del método radica en la
química del detergente, ya que son
anfipáticos.
Se clasifican en tres tipos: catiónicos
(sales de tetra-alquil-amonio, pH
básico), aniónicos (SDS, pH ácido) y
no-iónicos (Triton-X,).
DISRUPCIÓN CELULAR
Forman micelas con los lípidos de las
membranas, desestabilizándolas.

Shock osmótico
- Las células con paredes celulares son mas difíciles de romper.
- El estrés osmótico es generado cuando las células son situadas en
medios hiper/hipotónicos.
- Es el método químico mas simple.
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2) Métodos Físicos

Congelamiento/descongelamiento:
Los cristales de hielo que se forman y crecen durante el
congelamiento, rompen mecánicamente la integridad del interior de
la membrana celular, haciéndola mas permeable.
Enfriamiento lento Enfriamiento rápido
Se ha visto que la congelación lenta no funciona tan bien como la
rápida. La congelación rápida lesiona más específicamente las
membranas celulares produciendo lisis celular.
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Descompresión:
- Es un proceso por el cual las células se mezclan con un gas
presurizado por un tiempo específico. El gas entra en las células y
luego al liberar la presión aplicada el mismo se expande causando
la disrupción.
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Termólisis:
- Es un proceso bastante común a gran escala. Las células son
llevadas a mayores temperaturas con el fin de romper o debilitar la
membrana externa.

Disrupción Enzimática:
Lisozima
(muramidasa)
- La principal limitación de este método es su elevado costo. La
inmovilización puede ser una herramienta útil para la reducción de
costos
- La lisis enzimática es un método muy
preciso, pero que requiere de una
comprensión precisa de la estructura de
las paredes celulares que se desean
destruir.
DISRUPCIÓN CELULAR
3) Métodos Enzimáticos

Auto-lisis:
- Por sí mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace es
transformar cepas a fin de hacer estos sistemas auto-líticos mucho
mas activos, introduciendo genes que codifican antibióticos y
enzimas que degraden mas rápidamente las distintas organelas y
membranas celulares.
- Es un proceso por el cual las células inducen su propia destrucción.
Se produce la activación de señales que activan la liberación de
enzimas que degradan las organelas y membranas de las mismas
células.
DISRUPCIÓN CELULAR
3) Métodos Enzimáticos

Métodos Combinados
Puede verse que los distintos métodos de disrupción poseen diversos
principios de acción, lo que hace factible su combinación de forma
sinérgica para aumentar el rendimiento del proceso en un solo
método combinado.
Métodos no-mecánicos combinados
Disrupción mecánica con pre-tratamientos no mecánicos

Evaluación de la eficiencia de los métodos de disrupción
Métodos directos: Consisten en contar el número total de células
destruidas e intactas.
- Recuentos en cámara.
- Contadores electrónicos.
- Recuentos en placa.
- Utilización de centrífugas analíticas.
Métodos indirectos: Consisten en determinar el grado de
liberación al medio externo de algún metabolito celular luego de
que las membranas celulares son destruidas (determinación de
proteínas solubles, actividades enzimáticas, etc.).
Se determina el rendimiento alcanzado en función de la eficiencia de los
métodos realizados, teniendo en cuenta no solo la disrupción celular o
el porcentaje de producto recuperado, sino también las condiciones
operativas que se necesitaron para llevarlo a cabo.
Cálculo del Rendimiento Alcanzado
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Conclusiones
- Existen una gran diversidad de métodos de disrupción.
- Necesidad de desarrollar y poner a punto técnicas que permitan
la determinación de la eficiencia de los métodos utilizados.
- Cada método posee diferentes principios de acción, por lo que
presentan una serie de ventajas y desventajas frente a los demás.
- Existen distintas clases de microorganismos productores con una
gran diversidad de metabolitos de interés.
DISRUPCIÓN CELULAR
- No existen protocolos universales de disrupción celular.
¿CUÁL ES EL MEJOR MÉTODO?

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