1. ESTABILIDAD DE POLIGALACTURONASA
DE Aspergillus níger A LA
ULTRAFILTRACIÓN Y LIOFILIZACIÓN.
IDENTIFICACIÓN ELECTROFORÉTICA
Memoria del período de investigación de Cursos
de Doctorado presentada por: Javier Álvarez
Díaz

2. SUSTANCIAS PÉCTICAS
Heteropolisacáridos complejos compuestos principalmente
de unidades de ácido D-galacturónico, parcialmente
metoxiladas.
Clasificación:
• Pectinas: ácidos poligalacturónicos con grupos metil-
éster.
• Ácidos pécticos: ácidos poligalacturónicos libres de
grupos metil-éster.

3. CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
PECTINOLÍTICAS
ENZIMAS ENZIMAS
DESESTERIFICANTES DESPOLIMERIZANTES
• Pectinesterasa (PE) • Polimetilgalacturonasas
(PMG)
• Poligalacturonasas (PG)
• Polimetilgalacturonato
liasas (PMGL)
• Poligalacturonato liasas
(PGL)

4. POLIGALACTURONASA

5. ENDOPOLIGALACTURONASA EXOPOLIGALACTURONASA
•Plantas, bacterias, •Plantas, hongos,
levaduras y hongos bacterias, insectos
•pM (36-60 Kda) •pM (47-68 Kda)
•pH óptimo (4-5,5) •pH óptimo (4,6)
•pI (3,2-5,4) •pI (6,2-8,3)

6. APLICACIONES DE ENZIMAS
PECTINOLÍTICAS
• Clarificación de zumos de frutas
• Maceración
• Licuefacción
• Conservación de la madera
• Producción de oligogalacturónidos OGAs

7. JUSTIFICACIÓN
•La producción de PG está afectada por las
condiciones de crecimiento del microorganismo
productor
•Las preparaciones comerciales de enzimas
pécticas contienen niveles reducidos de
concentración de enzimas. Se necesita el desarrollo
de concentrados con alta actividad
•El seguimiento de PG a lo largo de procesos de
purificación requiere de técnicas de identificación
de la enzima

8. OBJETIVOS
•Comprobar como influyen distintas
condiciones de crecimiento de A. niger en la
producción de PG
•Evaluar los efectos de la ultrafiltración y la
liofilización sobre la actividad de PG y la
concentración de proteínas
•Optimizar la técnica de revelado de PG con
rojo de rutenio en geles de poliacrilamida
NATIVE-PAGE y SDS-PAGE

9. ULTRAFILTRACIÓN
•Método de concentración y purificación
enzimática
•Ultrafiltración tangencial o flujo cruzado.
Sistema Minitan (Millipore)
•4 Membranas de polisulfonato, 10.000
NMW
•Muestras concentradas 2 y 10 veces

10. LIOFILIZACIÓN
•Concentración proteica en forma de polvo
seco
•Congelación a –20 ºC
•Liofilización a –40 ºC, 24 horas.
Liofilizador “CRYODOS” (Telstar)
•Liofilizado resuspendido en tampón
acético-acetato pH 4,2
•Muestra concentrada 20 veces

11. CULTIVO DE A. NIGER
•Cepa Aspergillus niger CECT Nº 2088
•Medio de cultivo Czapex-Dox
•Concentración de esporas inoculadas 6,62 × 105
esporas/ml
•Inductor, pectina de cítrico al 1%
•Incubación:
•Estática a 30ºC, 72 horas
•Estática a 30ºC, 96 horas
•Estatica a 30ºC (72 h) + Agitación (24 h)

12. ZIMOGRAMA
Método de detección enzimática en geles de poliacrilamida
basado en el revelado de los geles en función de la actividad
enzimática de las enzimas a separar
Revelado de PG con rojo rutenio
Tipos:
•Sustrato incorporado en el gel de separación
•Técnica cup-plate
•Contacto enzima-sustrato después de la separación
electroforética:
•Inmersión del gel en una solución de sustrato
•Transferencia a geles con sustrato incorporado

13. NATIVE-PAGE
•Geles planos al 10 % de poliacrilamida. Método
de Davis
•El TEMED actúa sobre el PSA formando
radicales libres que inician la polimerización de
los monómeros de acrilamida
•Las cadenas de poliacrilamida se unen
mediante la bisacrilamida
•Zimogramas:
•gel con ácido poligalacturónico
•gel sin ácido poligalacturónico

14. SDS - PAGE
•Técnica descrita por Laemli: sistema de tampón
discontinuo Ornstein-Davis
•Agentes desnaturalizantes:
•SDS los polipéptidos se rodean de cargas – y migran
en el gel en función del tamaño
•Ditiotreitol ruptura de puentes disulfuro
•Zimograma
•Los geles incorporan ácido poligalacturónico al 0,1%
•Renaturalización de PG con Tritón X-100

15. ACTIVIDAD PG EN FUNCIÓN DE LAS CONDICIONES DE
CRECIMIENTO DE A. NIGER
1600
1400
1200
(ug ácido galacturónico/ml h)
1000
Actividad enzimática
800
600
400
200
0
72 h estático 96 horas estático 72 h estático+24 h
agitación

16. ESTABILIDAD DE PG FRENTE A LA
ULTRAFILTRACIÓN
Actividad Concentración Actividad Proteínas
Muestras Actividad totale Rendimiento
enzimáticaa proteínasb específicac totalesd
Extracto. crudo 1308,346 991 1404,365 495,5 654173,278 100%
Ultrafiltrado * 2 2242,88 1108 2024,26 306,916 621277,76 94,97%
Ultrafiltrado. *10 929,588 3714 250,293 186 46479,4 7,11%
a
µg ácido galacturónico ml-1 h-1
b
ppm
c
Unidades mg-1 de proteína
d
mg
e
Unidades

17. Actividad total del extracto crudo y de las Concentración de proteína para el
muestras concentradas por ultrafiltración extracto crudo y las muestras
concentradas por ultrafiltración
700000
600000 4000
3500
500000
3000
400000
Proteínas (ppm)
Actividad total (U)
2500
300000 2000
200000 1500
1000
100000
500
0
Extracto crudo Ultrafiltrado * 2 Ultrafiltrado *10 0
Extracto crudo Ultrafiltrado * 2 Ultrafiltrado *10

18. ESTABILIDAD PG FRENTE A LA
LIOFILIZACIÓN
Actividad Concentración Actividad Proeínas
Muestras Actividad total Rendimiento
enzimáticaa proteínasb específicac totalesd
Extracto crudo 1308,346 991 1404,365 495,5 654173,278 100%
Liofilizado *20 2931,17 15315 191,034 382,875 73279,25 11,20%
a
µg ácido galacturónico ml-1 h-1
b
ppm
c
Unidades mg-1 de proteína
d
mg
e
Unidades

19. Actividad total del extracto crudo y de la Valores de concentración de proteína para
muestra concentrada por liofilización. el extracto crudo y la muestra concentrada
por liofilización.
700000 18000
600000 16000
14000
500000
12000
Proteínas (ppm)
400000 10000
Actividad total (U)
8000
300000
6000
200000
4000
100000 2000
0
0
Extracto crudo Liofilizado *20
Extracto crudo Liofilizado *20

20. IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA NATIVE-PAGE
Con ácido Sin ácido
poligalacturónico poligalacturónico

21. IDENTIFICACIÓN DE PG EN GELES DE PAA SDS-PAGE
CON ÁCIDO POLIGALACTURÓNICO

22. PROTOCOLO OPTIMIZADO DE IDENTIFICACIÓN DE PG
EN GELES DE PAA NATIVE-PAGE CON ÁCIDO
POLIGALACTURÓNICO
•Solución de ácido málico 0,1M: 1 hora
en agitación. Crea un cambio gradual de
pH
•Solución de incubación acetato de Na 20
mM pH 5,5: 40´en agitación
•Agua destilada: 5´
•Rojo de rutenio 0,03% en agua: 1 h en
agitación

23. PROTOCOLO OPTIMIZADO DE IDENTIFICACIÓN DE PG
EN GELES DE PAA SDS-PAGE CON ÁCIDO
POLIGALACTURÓNICO
•Solución de Triton X-100 al 2,5% en tampón
acetato de Na 20 mM pH 5,5: 2 horas.
Renaturalización enzimática
•Solución de ácido málico 0,1M: 1 h en agitación
•Solución de incubación acetato de Na 20 mM
pH 5,5: toda la noche
•Agua destilada: 5´
•Rojo de rutenio 0,03% en agua: 1 h en
agitación

24. CONCLUSIONES
•La agitación del medio de crecimiento de A.
niger mantiene los niveles de producción de PG
•La ultrafiltración es una técnica adecuada para
concentrar el extracto crudo al 50% sin que se
observe una disminución de la actividad de PG.
La concentración al 10% del volumen original
resultó en una pérdida de actividad enzimática
del 92,9%

25. CONCLUSIONES
•La incubación de los geles de poliacrilamida,
tanto en condiciones nativas como
desnaturalizantes con SDS, con ácido málico, es
necesaria para la resolución de las bandas
indicativas de actividad PG.
•El detergente Tritón X-100 provoca una
renaturalización incompleta de la
poligalacturonasa.