Seminario

1. 

2. Introduction
 The human skin is a complex organ composed of multiple cell
types, which plays a key role in the detection and defense
against pathogens.
 Keratinocytes are the most abundant cells of this organ, are
important because they play a key role in the detection and
control of pathogens, their promotion by some virus (CHIKV)
stimulates an intense antiviral program which differs from
some other virus, that on the contrary are aimed these cells.

3. CHICUNGUNYAVIRUS
Vector
•Aedes albopictus
•Aedes aegypti
Virus
•Alphavirus with a positive sense
single stranded RNA genome of
about 11.6kb
Symptoms
•sudden onset
•biphasic fever
•strong joint pain or stiffness
•Rash (usually maculopapular)
•muscle pain,
•headache,
•fatigue
•nausea or vomiting
•iridocyclitis or uveitis
•retina lesions

4. QUERATINOCITOS
• Son las células predominantes de la
epidermis (90% APROX)
¿QUE SON?
• Barrera contra daños ambientales
(patógenos, perdida de calor, rayos UV,
perdida de agua)
• Inductores de respuesta inmune
FUNCIÓN

5. 
Replicación viral

6. 
Relación
CHIKV the particles
are endocytosed by
keratinocytes
Expression of non-
structural proteins
CHIKV activates an
innate immune
response in human
keratinocytes
transcriptional
induction of innate
antiviral genes upon
CHIKV challenge
keratinocytes are
unable to replicate
the virus
In these cells,
expression of non-
structural proteins
and synthesis of
genomic RNA are
impaired

7. 
General Objective

8. 
Materiales y Metodos
Celulas
• Aedes albopictus
• Queratinocitos
epidérmicos primarios
• HaCaT
• HEK293T
Virus
• pCHIKV-LR-3′GFP
• CHIKV(mCherry)
Anticuerpos y
reactivos
• Inhibidores de
BX795 y AG490
• C42 mAbs
• Anti-Rab5 mAbs
• Anti-mouse Ig
• Alexa 647-labeled
• Anti-human
IFNα/β
neutralizing
serum

9. 
Materiales y Métodos
RT-PCR
Monitoriza la
producción de nuevas
partículas virales
cuantifica ARN
genómico viral en las
células
Examina la inducción
transcripcional de
genes antivirales
Amplificación
enzimática de una
secuencia de RNA

10. 
Materiales y Métodos
Inmunofluorescencia
la capacidad de CHIKV para
ser endocitado por los
queratinocitos
detección de proteínas
estructurales virales
Unión de anticuerpos a una
sustancia fluorescente para
demostrar la presencia de
una molécula determinada

11. 
Materiales y Métodos
PCR en tiempo real
Cuantifica cantidad de ADN
en la muestra
Producto de amplificación
monitorizado conforme
avanza la reacción
Detecta de manera muy
sensible los niveles de
ARNm
Detectar y cuantificar las
secuencias especificas de
ácidos nucleicos mediante
el uso de reporteros
fluorescentes en la reacción

12. 
Materiales y Métodos
Transfección
Usada para infectar
las células
Producción de
pseudotipos virales
Permite la
introducción de
material genético en
las células

13. Primary and immortalized human
keratinocytes are poorly permissive for
CHIKV replication
Células
• NHEK
• HaCaT
• 293T
Proceso
• Se uso GFP para el
control de la
replicación
Tiempo
• 24 horas
• 48 horas

14. Resultados
Figura 1A

15. CHIKV particles are endocyted by HaCaT
cells
Células
• HaCaT.
Proceso
• Se incubaron con
CHIKV. MOI=100
• Por 1hora a 37C.
Tinción
• Anti-capsid
mAbs
• Alexa 647
marcado con
aglutinina de
germen de trigo
(WGA)

16. Resultados
Figura 2A

17. CHIKV particles are endocyted by HaCaT
cells
Células HaCaT.
Sometidas a
CHIKV por
10minutos
MOI=500
Para aumentar la
probabilidad de
detectar CHIKV
en el citoplasma.
Micrografía
Presencia de
partículas virales
en el citoplasma.

18. Resultados
Figura 2B
15% de antígenos
asociados a CHIKV

19. CHIKV particles are endocyted by HaCaT
cells
Se evaluó
•En HaCaT
•La capacidad el CHIKV de
colonizar endosomas
Rab5
Qué se uso
•Antígenos específicos de
proteínas de caspide :
VERDE
•Antígeno Rab5: ROJO
Qué se obtuvo
•Presencia de gránulos
amarillos/naranja.
•En el citoplasma expuesto
a CHIKV por 30 minutos

20. Resultados
Figura 2C

21. Resultados
Figura 3A

22. Keratinocytes membranes support fusion
with CHIKV envelope glycoproteins
 pCMV: Promotor de Citomegalovirus.
 Transporta los genes E3/E2/E1. Codón optimizado del CHIKV.

23. Keratinocytes membranes support fusion
with CHIKV envelope glycoproteins
 EF1a: Factor de elongación junto con un potenciador.
 Facilita los procesos de transcripción.
 VSV-G (estomatosis vesicular)

24. Keratinocytes membranes support fusion
with CHIKV envelope glycoproteins
 pHR: péptido de señalización especifica.
 Transportar el GFP (proteína verde fluorescente).
 HIV: necesario para la incorporación de LTR Y VLPS.
 VLPS (pseudoparticulas retrovirales).
 LTR (reparación terminal larga)

25. Keratinocytes membranes support fusion
with CHIKV envelope glycoproteins

26. Keratinocytes membranes support fusion
with CHIKV envelope glycoproteins
Las células
infectadas con CHIKV
liberaron
pseudoparticulas de
100-120nm.
Presentaban una
caspide crónica
característica del
VIH1 maduro.
Pseudotipos de
control: vectores que
codificaban la
glicoproteína P del
VSV-G

27. Resultados
Figura 3B

28. Keratinocytes membranes support fusion
with CHIKV envelope glycoproteins
Análisis de
Western blot.
Lisis celular
Proteínas retrovirales en
estado inmaduro
Células libres
Proteínas retrovirales
que se dividieron de
manera eficaz en
caspsidas maduras

29. Resultados
Figura 3C
Env: glicoproteínas de envoltura

30. Keratinocytes membranes support fusion
with CHIKV envelope glycoproteins
•VLPs de CHIKV y de VSV-G
•Células 293T y HaCaT
Incubación
•Demostrar la
funcionalidad de los
reactivos (VLPs).
Para •La capacidad de las
glicoproteínas virales de
fusionarse con la
membrana de las células
•Dirigieron la expresión de
GFP
Se demostró

31. Resultados
Figura 3D
Expresión del plásmido reportero pHR-CMV-GFP

32. Analysis of early CHIKV replication events
in human keratinocytes
Pasos de replicación del CHIKV en:
293T.
HaCaT.
MOI=10.
Por 9, 14 y 48 horas.
CHIKV
Se marco con
mCherry (rojo) que
marca proteínas no
estructurales nsP3.
Se hizo QRT-PCR
Para evaluar la
acumulación de
CHIKV RNA en las
células.
Por 6, 9 y 14 horas.

33. Resultados
Figura 4A

34. Resultados
Figura 4B
HaCaT NO hay síntesis de CHIKV RNA

35. CHIKV replication in keratinocytes with
perturbation of the IFN signalling
pathway
Células
HaCaT.
Infectadas
con siRNA.
Para IRF3 y
IRF7.
Se incubo
por 72 horas.
Prueba de
western blot.

36. Resultados
Figura 7A

37. Discussion
PERSON WHAT HE SAID? YES NO
Beglin
Here, we report that CHIKV poorly
replicates in cultures of primary
and immortalized keratinocytes
and despite differentiation status
of these cells may be crucial for
infection/replication of some
viruses (e.g. human papillomavirus)
CHIKV behaved independently
from the maturation stage of
keratinocytes used in this study.
✔

38. Discussion
PERSON WHAT HE SAID? YES NO
Bernard
Despite internalizing viral particles
that colocalized with Rab5-positive
endosomal compartments
competent for CHIKV entry in
permissive cells and while supporting
fusion with viral membranes,
keratinocytes are unable to replicate
the virus. In these cells, expression of
non-structural proteins and synthesis
of genomic RNA are impaired.
✔

39. Discussion
PERSON WHAT HE SAID? YES NO
Surasombatpattana
keratinocytes were proposed as key
players of early arboviral infection
capable to produce high levels of
infectious viruses in the skin favoring
viral dissemination to the entire
body.
✔

40. Discussion
PERSON WHAT HE SAID? YES NO
Salvador
It is well known that alphaviruses
display a wide spectrum of target
cells. Regarding CHIKV, a large
variety of in vitro susceptible cells
has been identified, including
fibroblasts, hepatocytes, neurons,
astrocytes, microglial cells,
neuroblastoma cells, skeletal
muscle progenitor cells, epithelial
and endothelial cells
✔

41. Conclusions
 keratinocytes represents a primary barrier against
infection of CHIKV.
 keratinocytes prevent the replication of CHIKV.
 Keratinocytes membranes stimulate the fusion with
CHIKV.
 Other cells are permissive to replication and
propagation of chikunguya such as kidney cells.