1. ENZİM KİNETİĞİ
ve
REGÜLASYONU
Uzm.Dr. Gülsen YILMAZ
ŞUBAT 2007
2. ENZİMLER
s Enzimler protein yapıda biyolojik
katalizörlerdir.
s In vitro koşullarda bağ kırılma reaksiyonları
yüksek enerjiye ihtiyaç duyar. (aşırı pH,
yüksek ısı ve diğer ölümcül koşullara)
s İşte enzimler bu reaksiyonların vücut
koşullarında oluşumuna izin verir.
3. ENZİMLER
s Enzimler ilk keşfedildiklerinde enzimlerin
canlı hücrelerin yapılarından ayırt
edilemeyeceği savunuluyordu.
s 1897’de Eduarde Buchner’in canlı maya
hücrelerinden şekeri alkole
fermentasyonunu katalize eden bir seri
enzimleri aktif solüsyon halinde elde etmesi
biyokimya tarihinde dönüm noktası oldu.
4. NEDEN ENZİM KİNETİĞİ?
s Bugün enzimler saflaştırılabilmektedir. Ancak
enzim katalizli reaksiyonların mekanizmalarını
çalışılmasındaki genel yaklaşım hala
reaksiyonun hızını belirlemek ve
belirlenen hızın deneysel
parametrelerdeki değişimlere nasıl
cevap verdiğini göstermek üzerine kuruludur
5. Reaksiyon mekanizmalarının
bilinmesinin faydaları :
s Bir reaksiyonun mekanizmalarının çözülmesi
benzer diğer reaksiyonların mekanizmalarını
çözmede yardımcı olur.
s Reaksiyonu denetleme olasılığının olması ve
reaksiyon şartlarını değiştirmek veya başka bir
madde katarak reaksiyon oluşumunu hızlandırmak
veya yavaşlatmaktır.
7. ENZİM KİNETİĞİ
s Enzim kinetiği, enzimle katalizlenen bir
reaksiyonun hızını ve mekanizmasını inceleme
anlamına gelmektedir.
s Bir kinetik analizin esas amacı kimyasal
reaksiyonun nasıl ve ne gibi bir hızla oluştuğunu
anlamaktır.
s Yani SUBSTRATLARIN ÜRÜNE DÖNÜŞÜNDE
İZLENEN YOLUN VE HIZIN BİLİNMESİDİR.
10. Reaksiyon Hızı
Kimyasal reaksiyonların hızı, reaksiyona katılan
maddelerin konsantrasyonlarıyla orantılıdır ve hız
eşitliği diye adlandırılan bir eşitlikle ifade edilir.
A B
n
HIZ
Hız eşitliğindeki n üsleri, bir tepkimenin
derecesini de ifade eder.
22. M-M denklemine
alternatif denklemler
s Lineweaver-Burk denklemi
s Eadie-Hofstee denklemi
s Hanes-Woolf denklemi
s Eisenthal-Cornish-Bowden denklemi
23. Lineweaver-Burk
(çift ters grafik)
s M-M eşitliğinin her iki tarafı 1/ şeklinde yazılırsa:
1 / Vm ax [S]
1/vo =
Km + [S]
sBu ilişki, y = mx + b şeklindedir.
sBu şekilde grafik haline aktarılırsa düz bir eğri elde edilir.
25. Enzim Kinetiği için bir örnek
1) Önceden bilinen miktarda Enzim → E
2) Farklı konsantrasyonlarda substrat ekle → S (x 軸 )
3) Sabit zamanda oluşan Ürünü ölç(P/t) → vo (y 軸 )
4) (x, y) eksenindeki hiperbolik eğriden, hesapla→Vmax
5) y = 1/2 Vmax olduğunda x ([S]) → Km
1 Vmax
vo vo
1/2
-1
Km 1
Vmax
Çift resiprokal (ters) 1/S Km S
26. Enzim Kinetiği için Gerçek Bir Örnek
Substrat Ürün Hız Çift Resiprokal
Veri
no [S] Absorbance v (( mole/min) 1/S 1/v
1 0.25 0.21 → 0.42 4 2.08
2 0.50 0.36 → 0.72 2 1.56
3 1.0 0.40 → 0.80 1 1.35
4 2.0 0.46 → 0.92 0.5 1.16
(1) Ürün oluşumu 600 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülmüştür
(2) Reaksiyon zamanı 10 dakikadır
1.0 2.0
Çift Resiprokal
v 1/v 1.0
Direk
1.0
Juang RH (2004) BCbasics
0.5
-3.8
0 0
0 1 2 -4 -2 0 2 4
[S] 1/[S]
27. Enzim Kinetiğindeki Önemli
Kavramlar
s Km
s Turnover sayısı (kcat)
s Kcat /Km oranı
s Enzim aktivite ünitesi
s Enzim İnhibisyonu
28. Km: Substrat Afinitesi
Vm ax [S] Vm ax
vo = Eğer vo=
Km + [S] 2
Farklı substratların kullanımı Vm ax Vm ax [S]
Vmax =
S2 2 Km + [S]
S1 S3
1/2
Km + [S] = 2 [S]
S1 S2 S3
Km = [S]
Km Afinite değişimi
29. Km: Hexokinaz Örneği
Glukoz + ATP → Glc-6-P + ADP
Glukoz Alloz Mannoz Substrat
sayı
1 CHO CHO CHO
2 H-C-OH H-C-OH HO-C-H
3 HO-C-H H-C-OH HO-C-H
4 H-C-OH H-C-OH H-C-OH
5 H-C-OH H-C-OH H-C-OH
6 H2-C-OH H2-C-OH H2-C-OH
Km = 8 8,000 5 M
31. Km nedir?
s Km enzimin bir karekteristiğidir. Bir sıvının
kaynama noktası gibi. Ancak birden fazla
enzim aynı Km' e sahip olabilir.
s Km bize substrat için enzim afiinitesi
hakkında fikir verir. Bir enzim düşük Km' e
sahip ise substrat için yüksek afiniteye
sahiptir. Çünkü düşük substrat
konsantrasyonunda maksimim hıza ulaşılmış
yani doymuştur.
32. Km nedir?
s Metabolizmada düşük Km' e sahip (yüksek
affinitedeki) enzimler büyük önem taşır. Düşük Km
değerleri (1/1.000.000) 10-6 M olarak verilir. Veya
hatta daha da küçük 10-7,10-8 M olabilir.
s Düşük affinitedeki yüksek Km e sahip enzimler ise
metabolizma için az önemlidir. Bu Km değerleri
1/100 M-> 10-2 veya 10-1 M olarak verilir.
s Enzim üzerine bir inhibitör etki ediyorsa Km etki
tarzı hakkında bilgi verir.
33. Turn Over Sayısı, kcat ve kcat / Km oranı
k1 k2
E+ S ES (vo) E+ P
k-1
kcat: Bir saniyede bir enzim molekülünün substrattan
oluşturduğu ürün sayısı. Enzim substrata bağlandıktan
sonraki dönemde enzim aktivitesini gösterir. [S]>>Km
koşullarında kullanılır.
kcat / Km oranı: Enzim molekülünün total aktivitesini
gösterir. Enzimin substrata bağlanmadan önceki dönemide
içerir. [S]<<Km koşullarında kullanılır.
34. Enzimlerin Turn Over Sayıları
Enzim Substrat kcat (s-1)
Katalaz H2O2 40,000,000
Karbonik anhidraz HCO3- 400,000
Asetilkolinesteraz Asetilkolin 140,000
1-Laktamaz Benzilpenisilin 2,000
Fumaraz Fumarat 800
RecA protein (ATPaz) ATP 0.4
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263
35. Kimotripsin farklı substratlara karşı
farklı kcat / Km oranına sahiptir
O R O
=
=
– –
H3C–C–N–C–C–O–CH3
–
H H
R= kcat / Km
Glisin –H 1.3 ╳ 10-1
Norvalin –CH2–CH2–CH3 3.6 ╳ 102
Norlösin –CH2–CH2–CH2–CH3 3.0 ╳ 103
Fenilalanin –CH2– 1.0 ╳ 105
(M-1 s-1)
Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379
36. Enzim Aktivite Ünitesi
S→P mol
Ürün [P]
t
vo = [P] / dak Slope
tan
Ünite = mol /dak 0 10 20 30 40
Reaksiyon zamanı (dak)
Spesifik Aktivite Unitesi y
Aktivite = Protein (mg) y = tan
x x
37. Enzim Aktivitesi İnhibisyonu
Enzimlerin katalitik etkileri, bazı
kimyasal bileşiklerle değişikliğe uğrar
veya tamamiyle yok edilebilir.
Enzim Aktivitesi İnhibisyonu enzimlerin
katalitik etkilerinin bazı kimyasal
bileşiklerle durdurulması veya
sınırlandırılması demektir.
38. Enzim Aktivitesi
İnhibisyonunun Önemi:
s Aktiviteleri düzenlenerek kontrol
sisteminde etkili olurlar.
s Enzim fonksiyonlarını inhibe eden ilaç ve
zehirli bileşiklerin fonksiyon
mekanizmalarının anlaşılması.
s Substrat analogları kullanarak önemli
araştırma olanakları sağlanması.
39. s İNHİBİSYON TİPLERİ:
x Yarışmalı inhibisyon (Kompetetif)
x Yarışmasız inhibisyon (Nonkompetetif)
x Bağımlı inhibisyon (Unkompetetif)
40. Enzim İnhibisyonu (Mekanizma)
I Kompetetif I Non-kompetetif I Unkompetetif
Substrat E
S S E I
S X
E S I I
I
Aktif bölge için S I
inhibitör yarışırlar Farklı bağlanma bölgesi
E + S ← ES → E + P
→ E + S ← ES → E + P
→ E + S ← ES → E + P
→
+ + + +
I I I I
↓↑ ↓↑ ↓ ↑ ↓↑
EI EI + S →EIS EIS
[I] sadece serbest [E]’e [I] serbest [E] ya da [ES] [I] sadece [ES] kompleksine
bağlanır ve [S] ile yarışır;
Kompleksine bağlanabilir; Bağlanır, [S]’ı arttırmak
[S]’ı arttırmak [I] etkisini
engeller. [S]’ı arttırmak etkiyi kaldırmaz. [I] etkisini arttırır.
Juang RH (2004) BCbasics
41. Enzim İnhibisyonu
I Kompetetif I Non-kompetetif I Unkompetetif
Vmax Vmax Vmax
vo vo
Vmax’ Vmax’
I I I
Direk
Km Km’ [S], mM Km = Km’ [S], mM Km’ Km [S], mM
Vmax değişmez Vmax azalır
Km artar Km değişmez Vmax & Km azalır
1/vo 1/vo 1/vo
Çift resiprokal
I I I
Paralel çizgi
kesişim
y ekseni 1/ Vmax Kesişim 1/ Vmax 1/ Vmax
x ekseni
1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S]
43. Sulfanilamid Kompetitif İnhibitördür
Para-aminobenzoik acid (PABA)
Bakteriler folik asit sentezi için
H2N- -COOH PABA’ya ihtiyaç duyarlar
Folik Tetrahidro-
Prekürsör asit folik asit
Sulfanilamid PABA ile benzer
H2N- -SONH2 Yapıya sahiptirler ve
Bakteriyal büyümeyi
İnhibe ederler.
Sulfanilamid
Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197
44. Enzim Kinetiğinin Özeti
Direk Önem
kcat / Km Vmax [S] O. derece
vo=
Km + [S] 1. derece
kcat Farklı [S] koşullarında,
vo değişikliklerini izle ve E3
Turn over E2
sayısı Vmax and Km E1
elde etmek için
işaretle
k2 [Et] Vmax & Km
Competitive
Aktivite Unitesi Maksimum Substrat Çift Resiprokal
1 1mol Hız Afinitesi
İnhibisyon
dak
Non-competitive
Spesifik Aktivite Bi-substrat reaksiyonlarda
unit Aktivite M-M denklemine uyar
mg Ancak bir substratla
çalışırken Uncompetitive
diğeri satüre edilmelidir.
45. Enzimlerin Laboratuvarda
kullanımı
s Enzimler laboratuvarda;
1. Reaktif olarak (enzimatik madde analizi)
Hexokinazla glukoz tayini vb.
2. Biyokimyasal marker (enzim analizi)
ALT, AST, LDH vb.
olarak kullanılmaktadır.
46. s Enzimler yardımıyla madde ölçümü (enzimatik
madde analizi) yöntemleri ile enzim aktivitesini
gösterme (enzim analizi) ve ölçme yöntemlerini
karıştırmamak gerekir.
s Bu iki grupta yer alan yöntemler aslında aynı
deney sistemini ve koşullarını içermekle
birlikte, enzim ve substrat derişimleri ve
deneylerin tasarımı açısından oldukça
farklıdırlar.
s Her iki ölçümde uygun koşullara
karar vermek için enzimatik
tepkimenin M-M grafiğini
incelemek yararlı olur.
48. k1 k2
E+ S ES (vo) E+ P
k-1
[S]< < Km vo = [S]
Substrat düşük iken Fazla miktarda
Vm ax [S] k2 [E][S] k2
vo = = = [E][S]
Km + [S] Km + [S] Km
[substrat] ihmal edilir Sabit
50. k1 k2
E+ S ES (vo) E+ P
k-1
[S]> > Km vo = [E]
Substrat yüksek iken
Vm ax [S] Vmax [S] k2
vo = = = [E]
Km + [S] Km + [S] Km
[Km] ihmal edilir Sabit
52. Enzimlerin lab.’da kullanımları yüksek
spesifiteleri, kısa reaksiyon zamanı
gibi nedenlerle kullanımı giderek
artmaktadır. Bu durum enzim
kinetiğinin anlaşılması gereğini de
artırmaktadır.
56. Glikolizin ilk basamağı
PFK-1
Fructose-6-P + ATP -----> Fructose-1,6-bisphosphate + ADP
s Hücredeki enzim miktarını düzenlenmesi
Yeni enzim moleküllerinin sentezi
Enzim molekülü sayısında azalma
s Var olan enzimin aktivitesinin düzenlenmesi
Non-kovalent modifikasyon
Kovalent modifikasyon
57. Mekanizmalar
s Enzim miktarının düzenlenmesi
Yeni enzim moleküllerinin sentezi
Enzim molekülü sayısında azalma
s Enzim aktivitesinin düzenlenmesi
Non-kovalent modifikasyon
Kovalent modifikasyon
58. Yeni enzim molekülü sentezi
(Indüksiyon)
DNA Replikasyon
Transkripsiyon
DNA
RNA
Gen
Translasyon Expresyonu
Protein
(Bizim enzimimiz)
59. Mekanizmalar
s Enzim miktarının düzenlenmesi
Yeni enzim moleküllerinin sentezi
Enzim molekül sayısında azalma
s Enzim aktivitesinin düzenlenmesi
Non-kovalent modifikasyon
Kovalent modifikasyon
72. Polipeptid zincirlerin parçalanması
s Proenzimler (zimojenler)
Bir enzimin etkin olmayan öncüsüne denir.
Zimojenler diğer bir enzim, asid veya diğer
etkenlerle etkin şekillerine dönüşür.
80. Kompartmentasyon
glucose
cytosol
glycolysis malic enzyme**
mitochondrion CO2 NADPH NADP+
pyruvate pyruvate malate
PC PDH*
malate NAD+
OAA acetyl CoA dehydrogenase
NADH
ATP ADP + Pi
citrate citrate OAA
CoASH
acetyl CoA
citrate lyase**
fatty acid
synthesis
81. İzoenzimler
İzoenzimler aynı kimyasal reaksiyonu
katalizleyen farklı kimyasal kompozisyona
sahip enzimlerdir
İzoenzimlere örnek:
laktat dehidrogenaz (LDH),
hexokinaz/glukokinaz,
kreatin fosfokinaz (CPK).
82. REGÜLASYON SONUÇ ZAMAN
MEKANİZMASI
Substrat miktarı Hızda değişiklik Hemen
Ürün inhibisyonu Vmax ve/veya Hemen
Km’de değişiklik
Allosterik kontrol Vmax ve/veya Hemen
Km’de değişiklik
Kovalent Vmax ve/veya Hemen-dakikalar
modifikasyon Km’de değişiklik içinde
Hormonal kontrol Enzim miktarında Saatler-günler
değişiklik içinde
05/02/12 由 上面公式推導，可知我們所設定出來的 K m 常數，居然正是要達到一半最高速率 V max 時的基質濃度。因此 K m 越高，若要達到最高速率時，所添加基質的濃度也要越高，表示該基質與酵素的親和力並不是很好 ( 上面左下圖 ) 。 一般酵素不可能在細胞內以最高速率進行催化反應，若以二分之一的最高速率進行，則此基質濃度剛好是 K m ，因此推測細胞內酵素的基質濃度可能是其 K m 。
05/02/12 Hexokinase 可以催化數種六碳糖 ( 如 glucose, allose, mannose 等 ) ，但三者的 K m 相差甚大。 Hexokinase 對 glucose 及 mannose 有較大的親和力 ( 因 K m 低 ) ，而對 allose 親和力很差 ( K m 為 8,000 M) 。 檢查比對這三種單糖的分子構造，發現三號碳上面 -OH 基的立體構形有很大的影響； hexokinase 偏好類似 glucose 的構形。 由此結果反推回去想像 hexokinase 的構造，可以推測 hexokinase 與基質結合的活性區，一定有相當專一的空間排列，其空間排列形狀可以與葡萄糖的形狀互補；而且對葡萄糖分子上的三號碳特別挑剔，但對二號碳則較為寬容。
05/02/12 回來 看 M-M 公式，當基質量 [S] 極大時， K m 可以忽略，則 v o = V max ；代入四條基本觀察中的 (III) v o = k 3 [ES] 以及 (IV) V max = k 3 [Et] ，可推得 [ES] = [Et] 。表示當基質很大時，所有的酵素全部轉成 [ES] ，在此種狀況下，酵素的反應事實上只要看後半段，即 ES → E + P ，而此段反應是受到 k 3 的控制；此時可以表現出一個酵素的最大催化能力，就特別把 k 3 稱為 k cat ，即為 turn over number (t.o.n.) 或稱為 molecular activity ，是表示一個酵素活性速率的絕對指標。 若基質量遠小於 K m 時，則可如上圖推演，得到 v o = ( k 3 / K m ) [E][S] ；此時的反應速率受到 [E] 及 [S] 兩者的控制，是一種二級反應；而其常數 k 3 / K m (k cat / K m ) 是酵素對某基質催化能力的指標 ( k 3 以及代表親和力的 K m ) 。 以上兩種表示法，我們各舉了數種例子。
05/02/12 常數 k 3 控制的是生成物的產生速率，因此也可看作一個酵素最後轉換出生成物的速率，特稱之為 turn over number (t.o.n) ，也是一個重要指標。 注意其單位為 s -1 ，亦即每秒鐘能夠轉換得到生成物的分子數目；例如上面 RecA 的 t.o.n. 為 0.4 ，表示此酵素要 2.5 秒才能使用一分子 ATP 生成 ADP (DNA 重組時需要此酵素 ) 。
05/02/12 用 k cat / K m 可以同時兼顧前半與後半反應，也就是說同時監視酵素對基質的親和力，以及該酵素的 V max ( k cat ) ，是一個比較理想的酵素行為指標； 此一比值越大者，有越好的催化力。由上例可以看出，酵素對不同基質會有不同的表現， chymotrypsin 顯然偏好較大的胺基酸基團，且最好有芳香基團。 酵素的成功催化首先需與基質碰撞，而兩者的碰撞率決定在細胞內的擴散率，但是細胞內的擴散率有其極限；有人由此算出若在最高的擴散速率下，且每次碰撞都完成催化，則一個酵素最高的催化極限，其 k cat / K m 將在 10 8 ~10 9 (M -1 s -1 ) 之間；的確最有效的酵素催化也都趨近此一範圍，目前最高的記錄是 triose phosphate isomerase 的 2.4×10 8 。
05/02/12 用 k cat / K m 可以同時兼顧前半與後半反應，也就是說同時監視酵素對基質的親和力，以及該酵素的 V max ( k cat ) ，是一個比較理想的酵素行為指標； 此一比值越大者，有越好的催化力。由上例可以看出，酵素對不同基質會有不同的表現， chymotrypsin 顯然偏好較大的胺基酸基團，且最好有芳香基團。 酵素的成功催化首先需與基質碰撞，而兩者的碰撞率決定在細胞內的擴散率，但是細胞內的擴散率有其極限；有人由此算出若在最高的擴散速率下，且每次碰撞都完成催化，則一個酵素最高的催化極限，其 k cat / K m 將在 10 8 ~10 9 (M -1 s -1 ) 之間；的確最有效的酵素催化也都趨近此一範圍，目前最高的記錄是 triose phosphate isomerase 的 2.4×10 8 。
05/02/12 回來 看 M-M 公式，當基質量 [S] 極大時， K m 可以忽略，則 v o = V max ；代入四條基本觀察中的 (III) v o = k 3 [ES] 以及 (IV) V max = k 3 [Et] ，可推得 [ES] = [Et] 。表示當基質很大時，所有的酵素全部轉成 [ES] ，在此種狀況下，酵素的反應事實上只要看後半段，即 ES → E + P ，而此段反應是受到 k 3 的控制；此時可以表現出一個酵素的最大催化能力，就特別把 k 3 稱為 k cat ，即為 turn over number (t.o.n.) 或稱為 molecular activity ，是表示一個酵素活性速率的絕對指標。 若基質量遠小於 K m 時，則可如上圖推演，得到 v o = ( k 3 / K m ) [E][S] ；此時的反應速率受到 [E] 及 [S] 兩者的控制，是一種二級反應；而其常數 k 3 / K m (k cat / K m ) 是酵素對某基質催化能力的指標 ( k 3 以及代表親和力的 K m ) 。 以上兩種表示法，我們各舉了數種例子。
05/02/12 回來 看 M-M 公式，當基質量 [S] 極大時， K m 可以忽略，則 v o = V max ；代入四條基本觀察中的 (III) v o = k 3 [ES] 以及 (IV) V max = k 3 [Et] ，可推得 [ES] = [Et] 。表示當基質很大時，所有的酵素全部轉成 [ES] ，在此種狀況下，酵素的反應事實上只要看後半段，即 ES → E + P ，而此段反應是受到 k 3 的控制；此時可以表現出一個酵素的最大催化能力，就特別把 k 3 稱為 k cat ，即為 turn over number (t.o.n.) 或稱為 molecular activity ，是表示一個酵素活性速率的絕對指標。 若基質量遠小於 K m 時，則可如上圖推演，得到 v o = ( k 3 / K m ) [E][S] ；此時的反應速率受到 [E] 及 [S] 兩者的控制，是一種二級反應；而其常數 k 3 / K m (k cat / K m ) 是酵素對某基質催化能力的指標 ( k 3 以及代表親和力的 K m ) 。 以上兩種表示法，我們各舉了數種例子。
