SlideShare uma empresa Scribd logo

Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh

•
•
https://www.facebook.com/garmentspace
https://www.facebook.com/garmentspace

Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

Educação
1 de 113
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN THANH LONG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÁC NHÂN GÂY BỆNH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Võ Thị Lan Thanh MSSV: 1051110144 Lớp: 10DSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2014
Số: 328/2014/DVVS KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM THÔNG TIN VỀ MẪU THỬ Nơi gởi mẫu: VÕ THỊ LAN THANH Mẫu thử: TL Yêu cầu: Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28S PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN  Giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH Kết quả SAB Kết quả giải trình tự gen 28S CACACCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTG GTGTTGGGCGTTTTGTCTTTGCATCAAAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCGGCCTA CTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAGAGGTCGGCAATCCATC AAGTCCATTTCTCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGG CAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGGCG CTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCC CGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC PHOØNG XEÙT NGHIEÄM NK-BIOTEK 793/58 TRAÀN XUAÂN SOÏAN, P. TAÂN HÖNG, Q.7, TP. HCM ÑT: (08) 37715818, (08) 37752252 Fax: (08) 37750583, ( 08) 37752250 Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com, namkhoa.biotek@gmail.com GP soá: 41G8005341 Theo ñònh höôùng ISO 15189
Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH Cochliobolus lunatus internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|JF798505.1|Length: 929Number of Matches: 1 Related Information Range 1: 77 to 716GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1083 bits(586) 0.0 623/640(97%) 6/640(0%) Plus/Plus Query 1 CACACCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT 60 |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 77 CACATCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT 136 Query 61 TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 137 TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC 196 Query 121 GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 197 GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC 256 Query 181 CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 257 CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT 316 Query 241 GGTGTTGGGCGTTTT--GTCTTTGCAT--CAAAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCG 296 ||||||||||||||| ||||||| | |||||||||||||||||| |||||||||||| Sbjct 317 GGTGTTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCG 376 Query 297 GCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGC--AAGAGGTCGGCA 354 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||||| Sbjct 377 GCCTACTGGTTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCA 436
Query 355 ATCCATCAAGTCCATTTCTCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT 414 |||||||||| | ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 437 ATCCATCAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT 496 Query 415 AAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTG 474 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 497 AAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTG 556 Query 475 AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAG 534 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 557 AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAG 616 Query 535 AGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGA 594 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 617 AGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGA 676 Query 595 GAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC 634 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 677 GAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC 716 KẾT LUẬN Cochliobolus lunatus TP. Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 06 năm 2014 TRƯỞNG PHÒNG TS.BS.Phạm Hùng Vân
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin “CAM ĐOAN”, luận văn tốt nghiệp này đƣợc tôi thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Tôi cam đoan những nội dung, các số liệu và trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 9 tháng 8 năm 2014 Sinh viên thực hiện Võ Thị Lan Thanh
LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nổ lực hết sức của bản thân, em còn nhận đƣợc sự hổ trợ, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, gia đình và bạn bè, em xin chân thành gửi lời “CÁM ƠN” tới: Em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể thầy cô trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng đã truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng để em thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn, lời tri ân sâu sắc đến TS.Nguyễn Thị Hai, Cô đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm để em hoàn thành khóa luận thật tốt. Con xin gửi lời cảm ơn, lòng biết ơn sâu sắc đến ba, mẹ, gia đình, ngƣời thân đã luôn bên cạnh con, cổ vũ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cám ơn đến quý thầy, cô và các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp một cách tốt nhất. Trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp, khó tránh khỏi sai sót; đồng thời, do trình độ cũng nhƣ kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của quý Thầy, Cô để em có thêm nhiều kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm trong công việc sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn ! Tp. Hồ Chí Minh, ngày 9 tháng 8 năm 2014 Sinh viên thực hiện Võ Thị Lan Thanh
Đồ án tốt nghiệp i MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu đề tài...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN............................................................................................ 3 1.1. Giới thiệu về cây thanh long ................................................................................. 3 1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 3 1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm phân bố.............................................................................................. 5 1.1.4. Đặc điểm chung của cây thanh long .................................................................. 5 1.2. Thành phần bệnh hại trong sản xuất thanh long .................................................... 6 1.2.1. Tình hình dịch hại trên thanh long..................................................................... 6 1.2.2. Các bệnh thường gặp trên cây thanh long.........................................................10 1.2.2.1. Bệnh thối đầu cành ........................................................................................10 1.2.2.2. Bệnh đốm nâu trên cành ................................................................................10 1.2.2.3. Bệnh rám cành...............................................................................................10 1.2.3. Côn trùng gây hại trên cây thanh long..............................................................10 1.2.3.1. Kiến...............................................................................................................10 1.2.3.2. Bọ xít .............................................................................................................11 1.2.3.3. Ruồi vàng hay ruồi trái cây............................................................................11 1.2.4. Các hiện tượng sinh lý thường gặp trên cây thanh long ....................................11 1.2.4.1. Hiện tượng rụng nụ........................................................................................11
Đồ án tốt nghiệp ii 1.2.4.2. Hiện tượng nứt vỏ trái....................................................................................11 1.3. Một số bệnh hại chính..........................................................................................11 1.3.1. Bệnh thán thư ...................................................................................................12 1.3.1.1. Đặc điểm gây hại...........................................................................................12 1.3.1.2. Phổ ký chủ .....................................................................................................13 1.3.1.3. Phương pháp phòng trừ.................................................................................14 1.3.2. Bệnh đốm trắng ................................................................................................16 1.3.2.1. Thời gian xuất hiện........................................................................................17 1.3.2.2. Tác hại...........................................................................................................17 1.3.2.3. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên thanh long .......................................18 1.3.2.4. Một số biện pháp phòng trừ bệnh đốm trắng..................................................20 1.4. Giới thiệu về nấm Cochliobolus lunatus ..............................................................22 1.4.1. Phân loại ..........................................................................................................22 1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa ............................................................................23 1.4.3. Phổ ký chủ........................................................................................................23 1.4.4. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh...........................................................................24 1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus........................................................................................................................24 1.4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ.................................................................................24 1.4.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon........................................................................25 1.4.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại.....................................................................25 1.4.5.4. Ảnh hưởng của pH.........................................................................................25 1.4.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ.............................................................................26 1.5. Sử dụng nấm Trichoderma trong phòng trừ bệnh đốm trắng................................26 1.5.1. Giới thiệu về nấm đối kháng Trichoderma........................................................26 1.5.1.1. Đặc điểm phân loại........................................................................................26 1.5.1.2. Nguồn gốc......................................................................................................26
Đồ án tốt nghiệp iii 1.5.1.3. Đặc điểm hình thái nấm.................................................................................26 1.5.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .............................................................................27 1.5.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma...........................................................28 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................... 34 2.1. Địa điểm và thời gian...........................................................................................34 2.1.1. Địa điểm...........................................................................................................34 2.1.2. Thời gian ..........................................................................................................34 2.2. Vật liệu................................................................................................................34 2.2.1. Nguyên liệu.......................................................................................................34 2.2.1.1. Trái và cành thanh long.................................................................................34 2.2.1.2. Chủng nấm mốc.............................................................................................35 2.2.2. Hóa chất...........................................................................................................35 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị............................................................................................35 2.2.3.1. Dụng cụ.........................................................................................................35 2.2.3.2. Thiết bị ..........................................................................................................35 2.2.3.3. Môi trường nuôi cấy ......................................................................................36 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. ....................................................................................37 2.3.1. Phương pháp vi sinh .........................................................................................37 2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh....................37 2.3.1.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến tốc độ phát triển kích thước khuẩn lạc..........................................................................................................42 2.3.1.3. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh với các chủng Trichoderma ..............................................................................................................43 2.3.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu.................................................................................46 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 48 3.1. Kết quả nhận dạng, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long...................................................................................................................48
Đồ án tốt nghiệp iv 3.1.1. Kết quả phân lập...............................................................................................48 3.1.1.1. Chủng nấm N1................................................................................................48 3.1.2.2. Chủng nấm N2................................................................................................51 3.1.1.3. Chủng nấm N3................................................................................................53 3.1.2. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ...................................................55 3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến kích thƣớc tăng trƣởng của nấm Cochliobolus lunatus..................................................................................................60 3.2.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến kích thước tăng trưởng của nấm Cochliobolus lunatus........................................................................................................................60 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus ...................................................................................................................................62 3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus........................................................................................................................64 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm Cochliobolus lunatus..................................................................................................67 3.3.1. Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma virens với nấm Cochliobolus lunatus........................................................................................................................67 3.3.2.Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus..................................................................................................69 3.3.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus ..........................................................................................70 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................. 73 4.1. Kết luận...............................................................................................................73 4.2. Kiến nghị.............................................................................................................73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................74
Đồ án tốt nghiệp v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật Ctv: Cộng tác viên GĐ: Giám đốc PDA: Potato D – Glucose Agar TL: Thanh long
Đồ án tốt nghiệp vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại các loài xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) khác nhau dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và ruột thịt của trái........................................................................... 4 Bảng 1.2. Điều kiện phát triển thích hợp của cây thanh long........................................ 6 Bảng 1.3. Thành phần dịch hại quan trọng trên thanh long .......................................... 8 Bảng 3.1. Thành phần nấm phân lập đƣợc trên cành thanh long bị bệnh đốm trắng ....48 Bảng 3.2. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N1 trƣớc Koch...........................50 Bảng 3.3. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N2 .............................................53 Bảng 3.4. Đƣờng kính trung bình (mm) tản nấm N3....................................................55 Bảng 3.5. Tỷ lệ bệnh của 3 loại nấm trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo..... ...................................................................................................................................56 Bảng 3.6. Hình thái chủng nấm N1 trƣớc Koch và sau Koch.......................................58 Bảng 3.7. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA với các điều kiện chiếu sáng khác nhau khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng...61 Bảng 3.8. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA ở các mức pH khác nhau.........................................................................63 Bảng 3.9. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA có bổ sung nguồn nitơ khác nhau.....................................................64 Bảng 3.10. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma virens với nấm Cochliobolus lunatus..........................................................................67 Bảng 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus...................................................................69 Bảng 3.12. Phần trăm ức chế trung bình 3 lần nhắc của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus..............................................70
Đồ án tốt nghiệp vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình quả thanh long..................................................................................... 4 Hình 1.2. Hình ký sinh của nấm Trichoderma ............................................................31 Hình 2.1. Cành thanh long bị bệnh đốm trắng.............................................................34 Hình 2.2. Dịch bào tử sau khi lắc................................................................................41 Hình 2.3. Cành thanh long trƣớc khi lây bệnh nhân tạo ..............................................41 Hình 2.4. Phƣơng pháp cấy đối kháng ........................................................................46 Hình 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N1 ....................................................49 Hình 3.2. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N1 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) ....................................................................................................................50 Hình 3.3. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N2 ....................................................52 Hình 3.4. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N2 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) ....................................................................................................................53 Hình 3.5. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N3 ....................................................54 Hình 3.6. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N3 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) ....................................................................................................................55 Hình 3.7. Cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ....................56 Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA ............................................................59 Hình 3.9. Kết quả tra cứu BLAST SEARCH ..............................................................60 Hình 3.10. Đƣờng kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau qua 4 ngày sau cấy.............................................................................62 Hình 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA ở các mức pH khác nhau qua 4 ngày sau cấy ..............................................................64 Hình 3.12. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA với các nguồn nitơ khác nhau ở 4 ngày sau cấy ...............................67 Hình 3.13. Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus ....................................................................................72
Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây thanh long (Hylocereus undatus) là cây trồng chủ lực mang lại hiệu quả kinh tế cao cho ba tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang (Huyện Chợ Gạo) và Long An (Huyện Châu Thành). Trong những năm gần đây do việc mở rộng diện tích đất canh tác để gia tăng sản xuất, thâm canh đồng thời ứng dụng nhiều kỹ thuật mới vào sản xuất (chong đèn xử lý nghịch vụ, trồng mới bằng trụ bê tông, tăng lƣợng phân bón, chăm sóc vƣờn,…) nên năng suất đƣợc nâng cao, phục vụ cho nhu cầu của ngƣời tiêu dùng trong nƣớc và quốc tế cũng nhƣ cải thiện đáng kể nguồn thu nhập của ngƣời sản xuất. Tuy nhiên, ngoài những mặt tích cực trên vẫn còn tồn tại những mặt tiêu cực của vấn đề này là tình hình sâu bệnh trên cây thanh long ngày càng trở nên phức tạp hơn. Trong những năm qua nhiều đối tƣợng dịch hại đã có xu hƣớng phát triển và gây hại ngày càng nặng hơn trên cây thanh long nhƣ bệnh thối trái do vi khuẩn, bệnh thán thƣ, đốm đồng tiền, hiện tƣợng vàng bẹ rám cành… Đặc biệt, vài năm gần đây bệnh đốm trắng hay nhiều nơi bà con còn gọi là bệnh lạ phát triển mạnh và gây thiệt hại nặng ở các vùng trồng thanh long trong cả nƣớc. Bệnh gây hại trên cành và trái làm giảm khả năng quang hợp, gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất cũng nhƣ chất lƣợng trái thanh long. Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa biết đối tƣợng gây bệnh lạ trên thanh long cũng nhƣ chƣa tìm ra phƣơng thức lây lan và giải pháp quản lý hữu hiệu để ứng dụng vào trong sản xuất. Bệnh này đang là bức xúc lớn cho nông dân mà còn cho các nhà chức năng ở các địa phƣơng. Việc tìm ra tác nhân gây bệnh và biện pháp quản lý để giúp làm giảm thiệt hại cho sản xuất thanh long ở các vùng là nhu cầu rất cấp thiết hiện nay. Xuất phát từ lý do trên, sinh viên thực hiện đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bƣớc đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến tác nhân gây bệnh”.
Đồ án tốt nghiệp 2 2. Mục đích nghiên cứu đề tài Xác định đƣợc tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long, các yếu tố ảnh hƣởng đến nấm gây bệnh làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng biện pháp phòng trừ loại bệnh mới này. 3. Nội dung nghiên cứu Xác định tác nhân gây bệnh lạ trên cây thanh long. Ảnh hƣởng của các yếu tố đến sự phát triển của nấm gây bệnh đốm trắng. Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với tác nhân gây bệnh đốm trắng thanh long trong in vitro.
Đồ án tốt nghiệp 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây thanh long 1.1.1. Nguồn gốc (Nguyễn Văn Kế, 2000) Cây thanh long có tên khoa học là Hylocereus undatus Haw thuộc họ xƣơng rồng Cactaceae, tên tiếng Anh là Pitahaya hay còn gọi là dragon fruit. Thanh long có xuất xứ từ những vùng rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Mehico, Trung và Nam Mỹ (bao gồm miền Nam Mehico, bờ Thái Bình Dƣơng của các nƣớc: Guatemala, Costa Rica, El Salvador, Venezuela, Colombia, Ecuador, Nicaragua, Panama, Brazil và Uruguay). Cây thanh long là cây có khả năng chịu nhiệt nên đƣợc trồng ở vùng nóng nhƣ vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Thanh long đƣợc ngƣời Pháp đem vào trồng ở Việt Nam từ thời Pháp thuộc nhƣng mới đƣợc sản xuất ở quy mô lớn từ thập niên 1980. Hiện nay, Việt Nam là nƣớc duy nhất ở Đông Nam Á trồng thanh long tƣơng đối tập trung trên quy mô thƣơng mại. 1.1.2. Phân loại (Bùi Vũ Thùy Dương, 2013) Việc phân loại các loài cây xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và màu ruột thịt của trái. Các loài cây xƣơng rồng có trái ăn đƣợc, đƣợc chia làm 2 nhóm (dựa trên đặc điểm hình thái): vine cacti (có thân bò trên trụ đỡ) và columnar cacti (có thân cột). Nhóm vine cacti thuộc về hai chi khác nhau là Hylocereus và Selenicereus. Nhóm columnar cacti thuộc về ba chi Cereus, Pachycereus và Stenocereus. Ở Việt Nam, dựa theo đặc điểm của trái thanh long đƣợc chia thành ba loại phổ biến: - Thanh long ruột trắng với vỏ hồng (hoặc đỏ): có tên khoa học là Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus.
Đồ án tốt nghiệp 4 - Thanh long ruột đỏ với vỏ hồng (hoặc đỏ): có tên khoa học là Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus. - Thanh long ruột trắng với vỏ vàng: có tên khoa học là Hylocereus megalanthus thuộc chi Hylocereus nhƣng trong một nghiên cứu gần đây loài này có nguồn gốc lai giữa hai chi là Hylocereus Selenicereus. Hình 1.1. Hình quả thanh long (a. Quả thanh long ruột trắng, vỏ đỏ Hylocereus undatus, b. Qủa thanh long ruột đỏ, vỏ đỏ Hylocereus undatus, c. Qủa thanh long ruột trắng, vỏ vàng Hylocereus megalanthus (Trần Thị Hoài Vi, 2011) Bảng 1.1. Phân loại các loài xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) khác nhau dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và ruột thịt của trái Loài Màu sắc của Vỏ quả Ruột thịt quả Vine cacti Hylocereus udatus Hylocereus udatus Hylocereus triangularis Hylocereus costaricensis Hylocereus polyrhizus (syn H. monacanthus) Hylocereus ocamponic Selenicereus megalanthus Đỏ Đỏ Vàng Đỏ Đỏ Vàng Vàng Trắng Đỏ Trắng Đỏ Đỏ Đỏ Trắng a b c
Đồ án tốt nghiệp 5 (syn H. megalanthus) Columnar cacti Cereus triangular Acanthocereus pitajaya Cereus ocamponic Vàng Vàng Đỏ Trắng Trắng Đỏ (Nguồn: Crane và Balerdi, 2004; Mizrahi và Nerd, 1999) 1.1.3. Đặc điểm phân bố (Nguyễn Văn Kế, 2000) Thanh long là loài thực vật bản địa tại Mehico và các nƣớc ở khu vực Trung và Nam Mỹ, từ đây thanh long đƣợc du nhập sang các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới ở châu Mỹ, châu Á, châu Đại Dƣơng và vùng Trung Đông. Thanh long cũng đƣợc trồng ở các nƣớc trong khu vực Đông Nam Á nhƣ Việt Nam, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Indonesia; ngoài ra chúng cũng hiện diện ở khu vực miền Nam Trung Quốc, Đài Loan và một số khu vực khác. Hiện nay, thanh long đang đƣợc trồng ở ít nhất 22 nƣớc nhiệt đới nhƣ: Australia, Cambodia, China, Colombia, Ecuador, Guatemala, Indonesia, Israel, Philippines, Tây Ban Nha, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, miền Nam nƣớc Mỹ và Việt Nam. Ở Việt Nam, thanh long đƣợc trồng đầu tiên ở Nha Trang và Phan Thiết từ thời Pháp thuộc. Sau khi thanh long trở thành hàng hóa thƣơng mại và xuất khẩu ra nhiều nƣớc trên thế giới, phong trào trồng thanh long phát triển mạnh ở Phan Rang, Phan Thiết, Bình Thuận, Buôn Ma Thuộc và các tỉnh ở đồng bằng sông Cửu Long nhƣ: Tiền Giang, Long An…. Trong những vùng trồng thanh long ở Việt Nam, Bình Thuận có diện tích trồng thanh long thƣơng mại ƣớc tính khoảng 1000 ha trong khi cả nƣớc chiếm khoảng 2000 ha. 1.1.4. Đặc điểm chung của cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) Thanh long là cây có nguồn gốc nhiệt đới có khả năng chịu hạn nên thƣờng đƣợc trồng ở những vùng nóng, chúng thích nghi đƣợc với những nơi có cƣờng độ ánh sáng mạnh. Thanh long mọc đƣợc trên nhiều loại đất khác nhau nhƣ đất xám bạc màu
Đồ án tốt nghiệp 6 (Bình Thuận), đất phèn (Thành phố Hồ Chí Minh), đất đỏ latosol (Long Khánh)…, đồng thời cây thanh long có khả năng thích nghi với các độ chua (pH) khác nhau của đất (thanh long thích nghi tốt với đất hơi acid). Không giống nhƣ các loài xƣơng rồng khác, thanh long tuy có khả năng chịu hạn nhƣng cũng cần một lƣợng nƣớc nhất định cho sự phát triển và tạo quả. Lƣợng mƣa hằng năm từ 500 – 1500 mm thích hợp nhất cho sự phát triển của cây thanh long. Bảng 1.2. Điều kiện phát triển thích hợp của cây thanh long Yếu tố khí hậu Điều kiện tối ƣu Độ cao (m) Nhiệt độ (0 C) Lƣợng mƣa (mm) Đất pH Lên tới 1700 m 20 – 30 500 – 2000 (với thời tiết nóng ẩm nhiệt đới có hai mùa mƣa nắng luân phiên) Có khả năng thoát nƣớc tốt 5,5 – 6,5 (Nguồn: H. P. M. Gunasena và ctv, 2004) 1.2. Thành phần bệnh hại trong sản xuất thanh long 1.2.1. Tình hình dịch hại trên thanh long (Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa, 2014) Thanh long là một loại cây ở vùng nhiệt đới nên chúng dễ dàng bị nhiễm bệnh hoặc dịch hại. Tuy nhiên, so với các loại cây ăn trái khác, cây thanh long có ít đối tƣợng dịch hại nghiêm trọng hơn (Bảng 1.3), ngoại trừ gần đây đã xuất hiện bệnh đốm trắng gây hại nặng nề và diễn tiến bệnh có xu hƣớng ngày càng phức tạp đối với tất cả các vùng trồng thanh long trọng điểm ở phía Nam. Theo số liệu tổng hợp ghi nhận từ Chi cục Bảo vệ thực vật các tỉnh Tiền Giang, Long An và Bình Thuận, trong năm 2013 có khoảng 6000 ha thanh long nhiễm bệnh (chiếm 20 – 25% tổng diện tích), bệnh tấn công mạnh vào mùa mƣa và gây thiệt hại nặng nề 20 – 50% năng suất. Các giải pháp kỹ thuật tạm thời đƣợc các địa phƣơng khuyến cáo áp dụng vẫn chƣa đạt đƣợc hiệu quả
Đồ án tốt nghiệp 7 nhƣ mong muốn và ngƣời trồng thanh long đã sử dụng nhiều biện pháp khác nhau mà chủ yếu là thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) nhƣng tỷ lệ thành công còn thấp, ngƣợc lại tiềm ẩn nguy cơ mất an toàn do ô nhiễm thuốc BVTV là rất cao. Trong năm 2011, Bộ môn Bảo vệ thực vật - Viện Cây ăn quả miền Nam đã giám định một số mẫu bệnh đốm trắng trên cành thanh long do Chi cục Bảo vệ thực vật Bình Thuận gửi đến. Qua kết quả phân lập và giám định đã xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Kết quả cũng tƣơng tự đối với những mẫu bệnh trên cành và trái thanh long ở Long An, Tiền Giang. Trƣớc đây, nấm Neoscytalidium dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau nhƣ: Fusicoccum dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea... Theo ghi nhận của Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa (2014) bệnh đốm trắng chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh vào mùa mƣa, nhiệt độ thích hợp cho nấm bệnh phát triển từ 20 - 300 C, ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan. Bên cạnh đó, theo ghi nhận của Viện Cây ăn quả miền Nam cũng cho thấy một số đối tƣợng dịch hại mới khác nhƣ: hiện tƣợng đỏ đầu trái (chín ngƣợc), sâu đục cành hoặc thân, ốc sên trắng cũng bắt đầu gây hại rải rác ở các địa phƣơng trồng thanh long trọng điểm nêu trên. Cùng với sự hội nhập ngày càng sâu rộng, các yêu cầu về mặt chất lƣợng sản phẩm của các quốc gia nhập khẩu càng trở nên khắc khe và cũng là rào cản kỹ thuật đối với trái thanh long Việt Nam, đặc biệt là vấn đề tồn dƣ dƣ lƣợng thuốc BVTV trở nên nóng bỏng hơn bao giờ hết.
Đồ án tốt nghiệp 8 Bảng 1.3. Thành phần dịch hại quan trọng trên thanh long TT Dịch hại Tác nhân gây bệnh Bộ phận bị hại Thời điểm gây hại Mức độ phổ biến I. Bệnh hại 1 Bệnh đốm trắng (đốm nâu, tắc kè…) Neoscytalidium dimidiatum Cành, trái non và thu hoạch Quanh năm +++ 2 Bệnh thối trái (ruột đỏ), thối đầu trái (ruột trắng) Erwinia chrysanthemi Bông, trái non Quanh năm +++ 3 Thán thƣ Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum sp. Trái, hoa Mùa mƣa +++ 4 Rỉ sét (đốm đen) Bipolaris sp. Bông Mùa mƣa +++ 5 Vàng bẹ rám cành Fusarium equiseti, Bipolaris crutacea Cành Mùa nắng +++ 6 Nấm bồ hóng Capnodium sp. Cành, hoa, trái Quanh năm +++ 7 Thối trái Fusarium sp. Trái sắp chín Mùa mƣa ++ 8 Thối bẹ Alternaria sp., Fusarium sp., bacteria Cành Cuối mùa nắng, đầu mùa mƣa ++ 9 Đốm nâu Glocosporium Cành Quanh năm +
Đồ án tốt nghiệp 9 avages II. Côn trùng 1 Bọ trĩ Thrip sp. Bông, trái non Mùa nắng + 2 Ngâu Protaetia sp. và Hypomeces squamesus Cành, bông Quanh năm ++ 3 Kiến Cành, bông, trái non Kiến lửa Solenopsis geminate Quanh năm + Kiến riện Cardiocondyla wroughtoni Cành, bông, trái non Quanh năm +++ Kiến xám Paratrechina longicornis Cành, bông, trái non Quanh năm +++ 4 Ruồi đục quả Bactrocera dorsalis Trái chín Mùa mƣa + 5 Rệp sáp Pseudococcus sp. Cành, trái Mùa nắng + 6 Ốc sên Achtina sp. Cành, trái thu hoạch Mùa mƣa + 7 Rầy mềm Toxoptera sp. Cành, trái non Quanh năm + (Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa, 2014) Ghi chú: + mức độ bệnh thấp, ++ mức độ bệnh trung bình, +++ mức độ bệnh khá phổ biến.
Đồ án tốt nghiệp 10 1.2.2. Các bệnh thường gặp trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.2.1. Bệnh thối đầu cành Triệu chứng bệnh: Ngọn cành thanh long chuyển màu vàng, rồi mềm, sau đó thối. Cây tăng trƣởng chậm, số cành giảm hẳn. Bệnh hay xảy ra vào cuối mùa nắng. Bệnh xảy ra không những trên đất phèn (đất thấp) mà còn cả trên đất cao nữa. Nguyên nhân chính là do nấm Alternaria sp. gây ra. Biện pháp phòng trị bằng cách phun Rovral 2 lần liên tiếp cách nhau 1 tuần. 1.2.2.2. Bệnh đốm nâu trên cành Triệu chứng bệnh là trên thân cành thanh long có những đốm tròn nhƣ mắt cua màu nâu. Vết bệnh nằm rải rác hoặc tập trung, thƣờng kéo dài thành từng vệt dọc theo thân cành. Có nhiều vết acervulus tròn đen nằm rải rác. Tác nhân là nấm Gloeosporium agavaes. 1.2.2.3. Bệnh rám cành Triệu chứng: Bệnh rám cành làm cho thân, cành thanh long có một lớp màng mỏng màu xám tro, nhám. Tác nhân gây bệnh rám cành là nấm Macssonina agaves Syd và Sphaceloma sp. Họ Nectrioidaceae, Bộ Melanconiales, Lớp Deuteromycetes. Biện pháp phòng trị chung cho các bệnh thanh long là vệ sinh đồng ruộng, chống úng và chống hạn cho cây. Khi bệnh phát triển nhiều thì dùng thuốc Rovral, hoặc Anvil 5sc (30 – 100 g/ha) phối hợp với Topas (10 – 50 g/ha). Ngoài sâu bệnh kể trên thanh long còn bị dơi, chim, chuột phá hoại quả. 1.2.3. Côn trùng gây hại trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.3.1. Kiến Cắn, đục khoét làm hƣ hỏng giống và các cành thanh long non, cắn mất tai lá trên trái, gây tổn thƣơng vỏ trái, đây là loại côn trùng dễ phòng trừ. Để phòng trị dùng Basudin (Diazinon) 10H, Padan 4G, 10G trộn đều với cát 2/1000 rải đều quanh gốc hoặc những nơi chúng làm tổ. Khi phun vào các ổ kiến thì dùng Bi 58, Diazinon…
Đồ án tốt nghiệp 11 1.2.3.2. Bọ xít Hại thanh long từ khi có nụ hoa đến khi trái hình thành, chúng chích hút nhựa, để lại những vết chích rất nhỏ nhƣng đến khi quả chín nơi các vết chích sẽ xuất hiện một chấm đen, mất giá trị xuất khẩu. Việc phòng trừ dùng Trebon, Applaud, Bassa… nồng độ 0,2%. Phun lên khu vƣờn có bọ xít xuất hiện. 1.2.3.3. Ruồi vàng hay ruồi trái cây (Dacus dorsalis) Đây là đối tƣợng nguy hiểm đang đƣợc báo động hiện nay. Chúng trƣởng thành chích và đẻ trứng vào quả gây thoái hóa phần thịt quả và phần nhựa chảy ra ngoài vỏ làm quả thanh long bị hƣ, không xuất vƣờn đƣợc. Tuy chúng là đối tƣợng mới xuất hiện trên thanh long nhƣng ruồi trái cây đã gây hại rất nhiều loại quả ở nƣớc ta vì thế cần chú ý phòng trừ. Cần vệ sinh đồng ruộng nhƣ thu dọn và tiêu hủy các quả rụng, rải thuốc diệt nhộng dƣới đất, đặt bả có chứa chất dẫn dụ trích từ cây é tía trộn với thuốc trừ sâu để diệt ruồi. Hiện nay, các thuốc nhƣ Ruvacon 90L và Vizubon D đã có chứa sẵn chất dẫn dụ là Metyl eugenol 75% nên tiện cho nhà vƣờn hơn. 1.2.4. Các hiện tượng sinh lý thường gặp trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.4.1. Hiện tượng rụng nụ Xuất hiện khi số nụ trên cành nhiều. Sau khi nụ xuất hiện 5 – 7 ngày thì nụ không phát triển nữa, vàng rồi rụng. Tỷ lệ rụng từ 10% đến 20%. Cây thanh long tự quân bình sinh lý để nuôi quả còn lại trên cây. Để hạn chế sự rụng quả sinh lý cần bón phân tƣới nƣớc đầy đủ. 1.2.4.2. Hiện tượng nứt vỏ trái Do thời tiết, trời hạn ở giai đoạn vỏ quả phát triển, sau đó mƣa nhiều hoặc tƣới nhiều nƣớc vào lúc ruột đang phát triển nên quả nứt. Mặt khác, do nhà vƣờn treo quả lâu đợi dịp có giá mới bán. Để hạn chế nên kiểm soát độ ẩm đất, không để vƣờn khô hạn trong thời kỳ cây nuôi quả. 1.3. Một số bệnh hại chính
Đồ án tốt nghiệp 12 1.3.1. Bệnh thán thư 1.3.1.1. Đặc điểm gây hại a. Sự nguy hại của bệnh thán thƣ (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh thán thƣ do nấm Collectotrichum gloeospoides gây ra trên thanh long là bệnh gây hại quan trọng nhất làm tổn thất đến năng suất và phẩm chất của trái, đặc biệt vào mùa mƣa bão, nấm tấn công lên thân, cành, nụ hoa và trên trái ở các giai đoạn khác nhau, nhiễm nặng nhất là giai đoạn sau thu hoạch. b. Triệu chứng bệnh (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh gây hại chủ yếu trên đọt, hoa và trái, đôi khi trên cành cũng bị tấn công. Trên cành: Vết bệnh bắt đầu từ mép cành lan dần vào bên trong. Vết bệnh dạng tròn hay bất định. Khi nấm tấn công vào cành làm cho cành thối mềm có màu vàng sáng, sau một thời gian ngắn chuyển sang màu nâu, thối từ phần ngọn vào trong. Trên hoa: Nấm tạo thành những đốm đen nhỏ làm hoa bị thâm đen và rụng. Bệnh tấn công cả phần nụ hoa, làm cho nụ hoa biến thành màu nâu, sau đó rụng rất nhanh. Trên trái: Ở điều kiện ngoài đồng bệnh ít khi tấn công trên trái, tuy nhiên ở giai đoạn trái lớn sắp thu hoạch hoặc đã thu hoạch và tồn trữ. Vết bệnh là những đốm tròn hoặc gần tròn, có tâm màu nâu đỏ, lõm xuống, xung quanh có những vòng đồng tâm nâu sậm, sau đó phát triển nhanh thành những mãng thối lõm vào vỏ, gây thất thoát lớn trong quá trình vận chuyển, tồn trữ. c. Đặc điểm phát sinh và phát triển của bệnh (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh thán thƣ phát triển mạnh ở điều kiện ẩm ƣớt và nhiệt độ không khí cao. Nấm có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 40 C, nhƣng tối thích là 25 – 290 C. Bề mặt mô bệnh ẩm ƣớt kéo dài có ảnh hƣởng đến sự xâm nhiễm và sinh trƣởng của nấm Collectotrichum gloeosporioides.
Đồ án tốt nghiệp 13 Trong điều kiện ngoài đồng: Bệnh bình thƣờng tồn tại trong xác bã thực vật có trong vƣờn hoặc trên cành, trái bệnh. Bệnh phát triển mạnh và bộc phát ở điều kiện ẩm độ cao nhất là vào mùa mƣa. Bệnh phát triển và gây hại nặng ở giai đoạn ra hoa, trái sắp thu hoạch và sau thu hoạch. 1.3.1.2. Phổ ký chủ (Stanley Freeman, 2008; Steven John Mackenzie, 2005) Collectotrichum spp. là tác nhân gây bệnh trên phạm vi rộng, nhiều loài có thể lây nhiễm một vật chủ duy nhất và loài duy nhất có thể lây nhiễm vật chủ khác nhau (Freeman và ctv, 1998). Thí dụ một vật chủ có thể bị nhiễm bệnh bởi nhiều loài Collectotrichum kể cả dâu tây bị nhiễm bệnh bởi 3 loài Collectotrichum, cụ thể là C. acutatum, C. fragariae, và C. gloeosporioides ; quả bơ và xoài nhiễm bệnh do cả hai loại nấm C. acutatum và C. gloeosporioides ; hạnh nhân và các loại trái cây chín vào một thời kỳ nhất định bị nhiễm bệnh do nấm C. acutatum hoặc C. gloeosporioides gây ra; cam quýt bị bệnh do ảnh hƣởng của các loài Colletotrichum khác nhau, đó là rụng quả và bệnh loét do C. acutatum gây ra, cây chết mầm non do C. gloeosporioides (Freeman và ctv, 1998). Hơn nữa nấm Colletotrichum còn là ký chủ trên cây cà phê, cây bầu, cây hồ tiêu, cà chua và những cây khác (Bailey và Jeger, 1992). Ở vùng nhiệt đới, nấm Collectotrichum gloeosporioides xuất hiện trên hầu hết các loại cây trồng, giai đoạn tồn tại chủ yếu của nấm là sống hoại sinh trên mô chết hoặc những tàn dƣ của cây trồng. Theo Mills và ctv (1992), những mẫu nấm bệnh Collectotrichum gloeosprioides thƣờng gây hại trên cây ký chủ nhƣ bơ, đu đủ, xoài, chuối, phong lan và cao su. Ở Australia ngƣời ta phát hiện thấy trên cây cỏ Stylosanthes có hai chủng nấm Collectotrichum gloeosprioides khác nhau. Qua quá trình phân lập mẫu bệnh và phân tích sinh học phân tử đã phát hiện thấy có sự biến động xảy ra trong nhân mặc dù không biết do yếu tố nào gây ra. Sự biến động này cũng tìm thấy ở trên cây dâu trồng ở vùng ôn đới (Maner và ctv, 1992).
Đồ án tốt nghiệp 14 Nấm Colletotrichum gloeosporioides cũng đƣợc phân lập từ 23 loại cây ăn quả ở Sri Lanka. Tác nhân gây bệnh này đã không đƣợc ghi nhận trƣớc đây trên sầu riêng, măng cụt, chôm chôm và Jambu Pini và 11 cây ăn quả ít quan trọng về kinh tế khác ở Sri Lanka. Các triệu chứng của nhiễm C. gloeosporioides trên các giống cây ăn quả, đặc biệt là xoài và chôm chôm có thể gây ra lên đến 40%. 1.3.1.3. Phương pháp phòng trừ Để phòng trừ bệnh thán thƣ, có một số biện pháp nhƣ sau: a. Biện pháp canh tác (Nguyễn Văn Hòa, 2013) Đào mƣơng lên lip (luống): Tùy theo độ cao của đất mà thiết kế líp đôi hay líp đơn, sao cho đảm bảo mực nƣớc ở thời điểm cao nhất là 20 – 30 ci vì rễ rất dễ bị úng và thối. Nên đắp mô cao để cây phát triển tốt, kích thƣớc mô 80 × 30 cm, khoảng cách trồng 3 × 3 m hoặc 3 × 3,5 m (mật độ khoảng 100 trụ/1000 m2 ). Trồng cây chắn gió: Nên trồng cây chắn gió đối với những vùng chuyên canh để hạn chế mầm bệnh lan vào. Trụ để thanh long phát triển: Tốt nhất là sử dụng trụ xi măng vì trụ bằng cây sống dễ mang mầm bệnh, sâu, không bền vững. Trụ xi măng cao 2 – 2,5 m, ngang 12 – 15 cm, phía trên trụ nên có que sắt dài 30 – 40 cm để làm giá đỡ cho thanh long. Bón phân cân đối, hợp lý: Nên bón phân cân đối và hợp lý theo quy trình kỹ thuật canh tác thanh long, liều lƣợng và phân tùy thuộc vào loại đất và điều kiện sinh trƣởng của cây, khả năng cho trái của vụ trƣớc. Cần bón nhiều phân hữu cơ đã đƣợc ủ hoai mục, nên cung cấp thêm vôi cho cây trƣớc và sau mùa mƣa. Tƣới nƣớc: Nên thiết kế hệ thống tới để quản lý tốt nguồn nƣớc, tránh mầm bệnh lây lan, tránh tƣới phun lên tán cây khi trong vƣờn có nhiều mầm bệnh thán thƣ. Tủ gốc giữ ẩm: Tủ gốc giữ ẩm cho cây vào mùa nắng bằng rơm, rạ, cỏ khô, tủ cách gốc 5 – 10 cm giúp giảm lƣợng cỏ dại, cung cấp dinh dƣỡng cho cây. b. Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh (Vũ Triệu Mân, 2007)
Đồ án tốt nghiệp 15 Tạo ra những giống kháng bệnh đã và đang đƣợc các cơ sở nghiên cứu nông nghiệp trên thế giới quan tâm, tuy nhiên công việc này đòi hỏi phải mất nhiều thời gian. Do vậy, hiện nay đối với cây trồng hằng năm mới chỉ tạo một số giống có khả năng chống bệnh do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây ra, đặc biệt trên cây trồng lâu năm, số lƣợng những giống kháng với loại nấm này đem lại hiệu quả kinh tế cao còn chƣa nhiều. c. Biện pháp cơ học (Nguyễn Văn Hòa, 2013) Khi cây còn nhỏ: Tỉa cành và tạo tán giúp cho cây có tán phân bố đều theo 4 hƣớng, giúp cây thông thoáng, quang hợp tốt, loại bỏ đƣợc cành sâu bệnh, cành giáp mặt đất. Sau thu hoạch: Nên cắt bỏ những cành sâu bệnh, cành tiếp đất. Thu gom tất cả tàn dƣ sau khi cắt tỉa hoặc sau thu hoạch để giảm mầm bệnh trong vƣờn. d. Biện pháp sinh học (Nguyễn Văn Hòa, 2013) Đây là một trong những biện pháp phòng trừ tổng hợp dịch hại trên cây trồng. Tùy theo từng loại bệnh trên những cây trồng khác nhau mà hiệu quả của biện pháp này đem lại khác nhau. Còn rất ít những kết quả nghiên cứu khả năng phòng trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides trên đồng ruộng bằng biện pháp phòng trừ sinh học. Để phòng trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thƣ, trong vƣờn nên bón nhiều phân hữu cơ và cung cấp nấm đối kháng Trichoderma vừa giúp phân hủy chất hữu cơ nhanh, vừa diệt mầm bệnh hiện diện trên xác bã thực vật có trên và trong đất. Phun thuốc kháng sinh nhƣ Salicylic acid 15 ngày trƣớc khi thu hoạch. Sử dụng biện pháp bao trái sau khi phun thuốc lần cuối (14 – 15 ngày trƣớc khi thu hoạch). e. Biện pháp hóa học (Nguyễn Văn Hòa, 2013)
Đồ án tốt nghiệp 16 Trên thực tế, đối với các bệnh do nấm gây ra nói chung và bệnh do nấm Collectotrichum gây hại nói riêng thì biện pháp phòng trừ hóa học vẫn đóng vai trò cần thiết. Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1998), trong 6 nhóm thuốc trừ bệnh đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp, nhóm thuốc những hợp chất dị vòng có tác dụng hữu hiệu trừ bệnh do nấm Collectotrichum gây ra. Thuốc chứa hợp chất gốc đồng, Benzamidazole, Dithiocarbamates, Triazole và các thuốc trừ nấm nhƣ: Chlorothalonil, Imazalil, Prochloraz có hiệu quả trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides do những nhóm thuốc này có khả năng xâm nhập vào mô cây ngăn cản và phá hủy sự xâm nhiễm tiềm ẩn của nấm. Tuy nhiên việc dùng Benzamidazole liên tục có thể làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm. Nên phun thuốc trừ nấm ngoài đồng sau khi thu hoạch, sau khi cắt tỉa để giảm áp lực mầm bệnh, phun lần hai khi trái có nụ hoa. Phun thuốc gốc Propineb khi vừa đậu trái và Difenoconazole 7 ngày tiếp theo. f. Xử lý sau thu hoạch (Nguyễn Văn Hòa, 2013) Sau khi thu hoạch tiến hành xử lý nƣớc nóng trái thanh long, ở nhiệt độ 530 C trong 10 phút không làm tổn thƣơng trái và giảm thiểu đáng kể mầm bệnh sau thu hoạch. Khi thu hoạch thấy có vết sâu bệnh xuất hiện trên trái phải loại ngay, không nên để tồn trữ chung với những trái khác để tránh sự lây lan. Đây là loại nấm đa ký chủ và gây hại quan trọng, khó quản lý, để phòng trị hiệu quả nên thực hiện phòng trị đồng loạt trên diện rộng thì sẽ mang lại hiệu quả cao. 1.3.2. Bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng trên thanh long hay còn gọi là bệnh lạ, đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi khác nhau mà bà con nông dân trồng thanh long ở tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An đặt tên cho một loại dịch hại mới phát sinh, gây thiệt hại nghiêm trọng và có xu hƣớng ngày càng lan rộng.
Đồ án tốt nghiệp 17 1.3.2.1. Thời gian xuất hiện (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2013) Theo ghi nhận của Viện Nghiên cứu Cây ăn quả miền Nam thì trên thực tế bệnh này đã xuất hiện rải rác đầu tiên vào năm 2008 tại Bình Thuận và Tiền Giang và đến năm 2011 trở lại đây thì bệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn tại những địa phƣơng này. Theo TS Nguyễn Nhƣ Cƣờng, GĐ Trung tâm Nghiên cứu BVTV Nam bộ, tác nhân gây bệnh là một loài nấm. Năm 2009, bệnh lần đầu đƣợc ghi nhận ở Đài Loan và Bình Thuận của Việt Nam, bệnh này đƣợc đặt với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ “đốm nâu”, “mắt cua”, “đốm trắng”, “tắc kè”. Mức độ bệnh xuất ở các vƣờn dao động từ 20 – 50%, có những vƣờn mất trắng năng suất do quả bị nhiễm bệnh nặng không thể thu hoạch đƣợc, thiệt hại rất lớn cho nhà vƣờn trồng thanh long. Bên cạnh đó, theo ông Trần Minh Tiến, Chi Cục trƣởng Chi cục BVTV tỉnh Bình thuận cho biết, bệnh đốm trắng cành và quả thanh long đã xuất hiện từ năm 2009 – 2010 nhƣng chỉ xuất hiện rải rác, cục bộ tại một số vƣờn thanh long ở Hàm Thuận Bắc. Sau khi kiểm tra thực tế tại Cẩm Hang (xã Hàm Hiệp) và một số vƣờn ở Hàm Thuận Nam, Chi cục BVTV Bình Thuận đƣa ra nhận định, hiện tƣợng bệnh đốm trắng trên thanh long chỉ xảy ra vào đầu mùa mƣa. Đồng thời xuất hiện ở những vƣờn cỏ nhiều, chăm sóc kém, độ pH trong gốc thấp, bộ rễ kém phát triển. Đầu tiên, những đốm chấm trắng xuất hiện trên cành non, trái gần chín và trái chín. Trên cành non sau khi xuất hiện vết chấm thì 7 – 10 ngày lớp biểu bì sẽ chết, nấm và vi khuẩn xâm nhập vào gây thối, cháy cành. Nhƣng đến nay, chỉ sau một thời gian ngắn bệnh đã phát triển mạnh ở hầu hết các vùng trồng thanh long trong tỉnh. 1.3.2.2. Tác hại (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2013) Bệnh thƣờng gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Lúc đầu triệu chứng trên bẹ hoặc trái là những đốm tròn nhỏ màu trắng, vết
Đồ án tốt nghiệp 18 bệnh trũng thấp so với bề mặt bẹ, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên những vết ghẻ có màu nâu và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng. Bệnh còn tấn công trên trái chín chuẩn bị thu hoạch. Những đốm này xuất hiện rõ hơn và nhiều hơn, buộc lòng những trái này bị dạt ra hoặc bán với giá rẻ hơn, làm giảm thu nhập của nhà vƣờn. Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích thanh long bị nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800 ha, nặng 400 ha, trong tổng số 21 nghìn ha; Tiền Giang với gần 3 nghìn ha thanh long thì có đến 2420 ha nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ, diện tích nhiễm nặng 80 ha; Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766 ha, nặng 41 ha, trong tổng số gần 2700 ha… và đang có xu hƣớng lây lan nhanh. Thanh long Việt Nam đã xuất khẩu tới 40 quốc gia và vùng lãnh thổ. Năm 2013, kim ngạch xuất khẩu (chính ngạch) trái cây tƣơi đạt 307 triệu USD thì thanh long chiếm tới 61,4%. Ngoài một số thị trƣờng truyền thống nhƣ Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Hà Lan… thanh long đang từng bƣớc xâm nhập vào một số thị trƣờng mới nhƣ Ấn Độ, New Zealand, Úc, Chi Lê tạo đƣợc sự đa dạng hóa trong cơ cấu thị trƣờng xuất khẩu thanh long của Việt Nam. Tuy nhiên, với tình hình bệnh đốm trắng trên thanh long đang có xu hƣớng lây lan nhanh, làm giảm năng suất và chất lƣợng quả thanh long, không đảm bảo kim ngạch xuất khẩu có nguy cơ mất một số thị trƣờng tiêu thụ lớn. 1.3.2.3. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên thanh long Trƣớc thực trạng bệnh gây hại nặng trên cây thanh long, Viện Cây ăn quả miền Nam đã tiến hành nghiên cứu, khảo nghiệm bằng nhiều phƣơng pháp khoa học, chuyển giao kỹ thuật và triển khai tập huấn “Quy trình quản lý tổng hợp sâu bệnh hại quan trọng trên thanh long” cho gần 600 nông dân trồng thanh long tập trung ở Bình Thuận và Tiền Giang. Mặt khác, Viện còn cử 18 bác sĩ cây trồng từ Viện và sáu chuyên gia đến từ Malaysia đi thăm khám định kỳ tại một số xã có trồng thanh long ở huyện Chợ Gạo,
Đồ án tốt nghiệp 19 tỉnh Tiền Giang. Ngoài ra, Viện cũng đã đƣa ra quy trình “Quản lý bệnh đốm trắng trên thanh long tạm thời” trên thông tin đại chúng để giúp nhà vƣờn trồng thanh long ứng dụng vào sản xuất, bƣớc đầu đã có hiệu quả. Bên cạnh đó, một số đề tài nghiên cứu về bệnh trên cây thanh long đã cho một số hiệu quả nhƣ: kết quả phân lập, kiểm chứng và giám định tác nhân gây hiện tƣợng vàng bẹ thanh long đƣợc khẳng định là do 2 loại nấm Bipolaris crustacean và Fusarium equiseti gây hại (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012). Nấm Bipolaris crustacean có khả năng mọc trên môi trƣờng PDA. Tản nấm ban dầu có màu trắng sau chuyển sang màu xám đen hoặc nâu đen. Sợi nấm có màu nâu, mịn dày, sợi nấm có cấu trúc giống len. Bào tử nấm có 2 đến 3 vách ngăn, cong hoặc uốn gấp, bào tử tách ra hoặc nằm theo nhóm. Tuy nhiên, gần đây tác giả này lại cho rằng tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra trong nghiên cứu xác định tác nhân, đặc điểm hình thái và sinh học của nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014). Nấm Neoscytalidium dimidiatum phát triển khá nhanh trên môi trƣờng PDA sau 3 ngày nuôi cấy, tản nấm có đƣờng kính 90 mm. Tản nấm tròn, ban đầu có màu trắng sau chuyển sang màu xám đen rất nhanh. Sợi nấm có màu nâu đến nâu sậm, mịn, dày. Sợi nấm phân nhánh, có màu nâu, có vách ngăn và tự tách ra thành bào tử đốt. Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: elip, trứng, que, tròn. Bào tử đốt hình thành rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuôi cấy, có màu nâu nhạt đến nâu sẫm, có 1 vách ngăn. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Phan Thị Thu Hiền và ctv (2014) cũng đã cho rằng nấm Neoscytalidium dimiditaum là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long. Đồng thời tác giả còn đã đƣa ra môi trƣờng PDA là môi trƣờng thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của Neoscytalidium dimiditaum với khoảng nhiệt độ thích hợp là 30 – 350 C. Điều kiện pH và ánh sáng không có ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của Neoscytalidium dimiditaum. Không dừng lại ở đó, một số đề
Đồ án tốt nghiệp 20 tài còn nghiên cứu biện pháp để trừ bệnh đốm trắng đã cho một số kết quả nhƣ trong tổng số 22 loại thuốc khảo sát ở điều kiện in vitro chỉ có 8 loại thuốc có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển nấm Neoscytalidium dimiditaum là Cyat (Trifloxystrobin), Tilt supper (Propiconazole + Difenoconazole), Map supper (Difenoconazole + Propiconazole), Map Unique (Tebuconazole + Tricyclazole), Sagorain (Difenoconazole + Propiconazole), Viroval (Iprodione), Ridomyl gold (Metalaxyl-M + mancozeb) và Dithan (Mancozeb). Kết quả khảo sát hiệu quả của 20 loại thuốc đối với bệnh đốm trắng trên cành cho thấy Dithan M45 có hiệu quả tốt nhất, kế đến là Riddomyl gold, Saiporra, Vicarben, Map Hero và Viroval. Tƣơng tự, Saipora (Carbendazim + Hexaconazole) cho hiệu quả tốt nhất, làm giảm chỉ số bệnh trên trái dƣới 10%, kế đến là Ridomil gold (Metalaxyl-M + Mancozeb), Dithan (Mancozeb) và Vicarben (Carbendazim) trong đề tài “Đánh giá hiệu quả của một số loại thuốc hóa học đối với bệnh đốm trắng gây hại trên thanh long” (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014). 1.3.2.4. Một số biện pháp phòng trừ bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng có thể xuất hiện ở nơi có độ ẩm cao, nhiệt độ thấp… tùy điều kiện thích hợp mà bệnh phát triển nhanh hay chậm và cũng tùy vào giai đoạn bệnh mà có cách trừ bệnh thích hợp. Tuy nhiên, khi cây đã bị nhiễm bệnh, thƣờng bệnh lây lan rất nhanh. Do đó, khi phát hiện vƣờn thanh long có dấu hiệu nhiễm nấm bệnh bà con nên áp dụng các biện pháp sau đây để khắc phục và tránh lây lan bệnh: Bƣớc 1: - Vệ sinh vƣờn, tạo thông thoáng cho vƣờn: cắt tỉa cành bệnh, trái bệnh, thu gom tập trung lại một chỗ, đào hố, dùng vôi để xử lý. (Không vứt xuống mƣơng, rạch hoặc trong vƣờn vì sẽ tạo điều kiện cho bệnh lây lan nhanh khó trị). - Quản lý chặt nguồn nƣớc: đánh rảnh thoát nƣớc, không cho ứ đọng trên liếp vƣờn. Bƣớc 2:
Đồ án tốt nghiệp 21 - Rãi vôi xung quanh gốc để khử mầm bệnh: 400 – 500 kg/ha (không rãi lên cây) - Sau đó, phun các loại thuốc trừ nấm phổ rộng trƣớc khi áp dụng biện pháp sinh học bên dƣới 5 – 7 ngày. Lƣu ý: Trong thời gian cây bị bệnh, hạn chế sử dụng phân hóa học có hàm lƣợng đạm cao và phân gà tƣơi. Bƣớc 3: Sau khi thực hiện bƣớc 2 đƣợc 7 ngày - Bón phân hữu cơ vi sinh TRICHOMIX-DT hoặc phân hữu cơ sinh học TRIMIX-N1 (50 kg/bao, liều bón: 1 – 2 kg/gốc), bón xung quanh gốc và nên ủ cỏ mục, rơm hoặc lấp đất ở gốc để giữ ẩm, bón 2 – 3 lần liên tục cách nhau 15 – 20 ngày. - Phun men vi sinh siêu đậm đặc TRICHOMIX-DT (liều phun 01 gói 500g/100 lít nƣớc/100 trụ) trên khắp tán cây, thân cây và gốc cây, phun liên tục 4 – 5 ngày/lần. Lƣu ý: Nếu vƣờn không bị nhiễm bệnh bà con chỉ áp dụng bƣớc 3. Ngoài ra còn những biện pháp khác nhƣ ông Trần Minh Tiến, Chi cục BVTV Bình Thuận đã đƣa ra một số giải pháp để khắc phục đối với một số vƣờn đang bị bệnh đốm trắng. - Cần vệ sinh sạch cỏ dại, thu gom trái, cành bị hƣ hỏng ra khỏi vƣờn - Phun vệ sinh vƣờn khoảng 2 lần, cách nhau 1 tuần/ lần bằng các loại thuốc BVTV nhƣ Agri-life, Actinovate… - Bón phân chăm sóc gốc thanh long bằng các loại phân Humix, lân phosphoprite… để cây có bộ rễ mới, khỏe. - Giai đoạn từ nụ nhỏ đến nở hoa, quả non, quả chín phải phòng trừ bằng các biện pháp tổng hợp nhƣ quy trình thanh long VietGAP. Lƣu ý: giảm bớt thuốc kích thích sinh trƣởng. - Bên cạnh đó, phun bổ sung thêm các loại phân bón lá. Đồng thời tập trung thâm canh, bón phân cân đối, khai thác vừa phải và không lạm dụng chất kích thích
Đồ án tốt nghiệp 22 sinh trƣởng. Đây là những điều kiện cần thiết nhằm giúp cây thanh long đủ sức vƣợt qua các yếu tố biến đổi của thời tiết. Theo Trần Thanh Phong (2013) một biện pháp phòng trừ khác là: - Thoát nƣớc tốt cho vƣờn thanh long. - Thƣờng xuyên thăm vƣờn, kịp thời phát hiện các cành trái bị bệnh để cắt bỏ. Gom các cành trái bị bệnh để tiêu hủy. - Tuyệt đối không đƣợc vứt bỏ cành, trái bị bệnh xuống nƣớc vì sẽ làm bệnh lây lan nhanh. - Hạn chế tƣới nƣớc mƣơng lên tán thanh long, nhất là sau khi trời mƣa. - Không bón phân gà tƣơi hay bột xơ dừa cho vƣờn thanh long. - Sử dụng phân chuồng hoai và nấm đối kháng Trichoderma hoặc phân hữu cơ vi sinh. - Bón phân cân đối giữa đạm, lân, kali. Không bón thừa phân đạm. Tuy nhiên, các biện pháp trên không thể trừ một cách triệt để đƣợc bệnh đốm trắng, nhƣng nếu chúng ta chủ động thực hiện theo những phƣơng pháp trên sẽ giúp giảm thiểu tác hại và sự lây lan của bệnh đốm trắng. 1.4. Giới thiệu về nấm Cochliobolus lunatus 1.4.1. Phân loại (R. R. Nelson và Haasis, 1964) Nấm Cochliobolus lunatus thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Dothideomycetes Phân lớp: Pleosporomycetidae Bộ: Pleosporales Họ: Pleosporaceae Giống: Cochliobolus Loài: C. lunatus
Đồ án tốt nghiệp 23 1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa Đặc điểm hình thái: Theo nghiên cứu của R. R. Nelson và Haasis (1964), tản nấm C. lunatus phát triển nhanh chóng trên môi trƣờng thạch đƣờng khoai tây, ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu nâu, nâu đen hoặc đen, tản nấm giống len hoặc lông mƣợt nhƣ nhung và có cấu trúc sắp xếp lỏng lẻo. Sợi nấm chủ yếu mọc trong điều kiện ẩm ƣớt. Bào tử nấm C. lunatus có dạng bào tử đính, có thể đơn nhân hoặc đa nhân nằm riêng lẻ hoặc theo nhóm, thẳng hoặc cuộn xoắn đôi khi quặp. Bào tử có vách ngăn màu nhạt đến màu nâu sẫm; bào tử có chiều dài lên đến 650 µm, rộng 5 – 9 µm. Nấm C. lunatus đƣợc phân biệt với các loài khác ở chỗ bào tử có 3 vách ngăn và 4 tế bào, các tế bào đầu và cuối thƣờng nhạt màu hơn tế bào ở giữa. Đặc điểm sinh hóa: C. lunatus có phân bố rộng rãi nhƣng phần lớn chúng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi có khí hậu ẩm ƣớt thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh. Bào tử và túi bào tử có khả năng phát tán trong không khí. Ngoài ra, chúng cũng có thể tồn tại trong đất. Nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm vào khoảng 24 – 300 C, bào tử sẽ bị chết ở nhiệt độ 590 C trong vòng 1 phút và 550 C trong thời gian 5 phút. Nấm Cochliobolus lunatus có thể tồn tại trong đất ở dạng hạch nấm trong khoảng 2 năm và trong thời gian 3 năm chúng sẽ giải phóng bào tử lên những cây dễ bị tổn thƣơng (R. R. Nelson và Haasis, 1964). 1.4.3. Phổ ký chủ Nấm Cochliobolus lunatus có phạm vi ký chủ rất rộng. Chúng là một tác nhân gây bệnh trên hạt giống làm hạt giống không nảy mầm, làm tàn lụi cây con của những cây khác nhƣ cây mía đƣờng, lúa nƣớc, lúa mì, cây kê. Nó cũng gây tổn thƣơng cho thân, cành lá và hoa trên phạm vi ký chủ rộng lớn (R. R. Nelson và Haasis, 1964). Theo Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), chi Cochliobolus cũng là tác nhân gây bệnh đốm lá, bệnh rỉ sét (thối khô), biến dạng hạt, biến dạng màu (bạc màu) hạt và thậm chí thối rễ.
Đồ án tốt nghiệp 24 Nấm C. lunatus còn đƣợc biết đến nhƣ tác nhân gây bệnh vàng lá cây và làm hạt không nảy mầm đối với các cây trồng loại đơn tử diệp nhƣ mía, gạo, kê và ngô. Ngoài ra, chúng còn gây bệnh đốm lá trên các thực vật hạt kín. Theo Bengyella Louis và ctv (2014), nấm C. lunatus là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, chúng phát triển mạnh trên các cây trồng quan trọng nhƣ lúa nƣớc, lúa mì, sắn, dâu tây và khoai tây. Ngoài ra, chúng còn là tác nhân gây bệnh trên các loài cỏ dại trên ruộng lúa. 1.4.4. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh Nấm Cochliobolus lunatus phần lớn sản sinh bào tử và phát tán chủ yếu qua không khí, quá trình lây nhiễm vào lá cây khoai tây của nấm Cochliobolus lunatus khá phức tạp (Bengyella Louis và ctv, 2014), cách thức xâm nhiễm nhƣ sau: Cách thức xâm nhập của nấm C. lunatus chủ yếu bằng con đƣờng cơ học. Để xâm nhập đƣợc vào tế bào chủ, bào tử nấm C. lunatus tiếp xúc, bám lên lá cây. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm để xâm nhập vào trong lá. Trong quá trình xâm nhập, nếu pH môi trƣờng không thuận lợi, nấm C. lunatus điều hòa pH của môi trƣờng tạo điều kiện cho nấm xâm nhập vào tế bào chủ. Sau đó, nấm bệnh tiết độc tố melanin (có màu đen) nhằm ức chế và tiêu diệt những tế bào tại vị trí xâm nhập vào cây chủ làm cho vết bệnh sau đó có màu đen và lan rộng. Ngoài ra, melanin còn có khả năng giúp nấm chống lại các tác nhân oxy hóa và quá trình ly giải trong cơ chế bảo vệ của tế bào chủ (Miguel J. Benltrán-García và ctv, 2014). Thời gian ủ bệnh 4 – 5 ngày sau khi nhiễm bệnh và triệu chứng bắt đầu biểu hiện với sự hình thành bào tử của mầm bệnh trên các vết bệnh xảy ra vào ngày thứ 6. Điều kiện ẩm ƣớt trên bề mặt cây chủ trong khoảng 13 giờ là cần thiết cho việc nhiễm bệnh thành công (R. R. Nelson và Haasis, 1964). 1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus 1.4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Đồ án tốt nghiệp 25 Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển và hình thành bào tử của nấm bệnh. Theo Jyothi G và ctv (2013), nấm Cochliobolus lunatus sản sinh bào tử nhiều nhất ở nhiệt độ 250 C. Tuy nhiên, sự sinh trƣởng và phát triển kích thƣớc tản nấm nhanh nhất ở nhiệt độ 300 C, nấm bệnh phát triển chậm lại ở nhiệt độ 150 C và 400 C. Bên cạnh đó theo Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013), nấm C. lunatus có khả năng tăng trƣởng ở nhiệt độ 30 – 400 C. Ở nhiệt độ 45 – 500 C, quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm bị ngừng lại. Một nghiên cứu khác của Gao Ying và ctv (2009) cũng cho rằng nhiệt độ tốt nhất cho các chủng Cochliobolus spp. sinh trƣởng là 25 – 300 C. 1.4.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Đối với những nguồn cacbon khác nhau, sự sinh trƣởng và phát triển của nấm C. lunatus cũng khác nhau. Theo Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013), nấm C. lunatus phát triển tốt nhất trong môi trƣờng có bổ sung đƣờng glucose, sau đó là đƣờng maltose và cuối cùng là đƣờng sucrose. Nhƣng đối với môi trƣờng có bổ sung đƣờng lactose và cellulose, nấm không phát triển. Một nghiên cứu khác của Gao Ying và ctv (2009) cũng cho rằng nguồn cacbon tốt nhất cho sự phát triển của các chủng nấm Cochliobolus spp. là glucose và galactose. 1.4.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại Các ion kim loại có ảnh hƣởng đến sự phát triển và các hoạt động phân giải protein của nấm C. lunatus. Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013) cho rằng nấm này có thể sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có bổ sung các muối nhƣ NH4Cl, KH2PO4, K2HPO4, NaCl. Tuy nhiên, đối với muối chứa ion kim loại nhƣ là MgSO4 và CaCl2, nấm không phát triển đƣợc. 1.4.5.4. Ảnh hưởng của pH Yếu tố pH có ảnh hƣởng khá lớn đến sự phát triển của nấm Cochliobolus lunatus. Theo Gao Ying và ctv (2009), pH tốt nhất cho sự sinh trƣởng của nấm Cochliobolus spp. là khoảng pH 6 – 8, càng xa khoảng pH này sự sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh càng giảm.
Đồ án tốt nghiệp 26 1.4.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Nguồn nitơ là một trong các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ tăng trƣởng của nấm bệnh. Nguồn nitơ thích hợp cho sự phát triển của chủng nấm Cochliobolus spp. là kali nitrate và glycin (Gao Ying và ctv, 2009). 1.5. Sử dụng nấm Trichoderma spp. trong phòng trừ bệnh đốm trắng 1.5.1. Giới thiệu về nấm đối kháng Trichoderma spp. 1.5.1.1. Đặc điểm phân loại (Lê Thị Huệ, 2010) Trichoderma spp. thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma 1.5.1.2. Nguồn gốc Trichoderma spp. đƣợc tìm thấy ở mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J. Samuels, 2004). Trichoderma spp. rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000). Nhìn chung các loài Trichoderma spp. xuất hiện ở các vùng đất acid nhiều hơn ở vùng đất trung tính và kiềm (Papavizas, 1985). 1.5.1.3. Đặc điểm hình thái nấm (Gary J. Samuels, 2004) Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển nhanh trên môi trƣờng PDA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang màu xanh đậm,
Đồ án tốt nghiệp 27 xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trƣờng PDA hóa vàng. Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chƣa đƣợc xác định. Cuống bào tử của một số nấm bệnh xen vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có kích thƣớc từ 1 – 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng nhƣ bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này đƣợc tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động nhƣ chồi mầm. Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trƣng, một số ít có màu trắng (nhƣ T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc hình ovan (với tỉ lệ dài: rộng từ 1 – 1,1 µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài: rộng là hơn 1,4 µm), đa số các bào tử trơn láng, kích thƣớc không quá 5 µm. Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà T. harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trƣờng không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng nên chlamydospores có thể đƣợc dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học. 1.5.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5 và phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ƣu thƣờng là 25 – 300 C. Một vài dòng phát triển tốt ở 350 C. Một số ít phát triển đƣợc ở 400 C (Gary J. Samuels, 2004). Theo Prausun K. M. và Kanthadai R. (1997), hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350 C chúng tạo
Đồ án tốt nghiệp 28 ra những khuẩn lạc rắn dị thƣờng với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thƣờng, ở 370 C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy. Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme nhƣ chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là hai enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chƣa đƣợc biết (Gary J. Samuels, 2004). Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tƣợng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện môi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng nhƣ kiểu hình của cùng một loại Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng nhƣ trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000). 1.5.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma (Huỳnh Văn Phục, 2006) Theo Nguyễn Thị Hai (2013), rất nhiều nghiên cứu về vi sinh vật đã cho thấy nấm Trichoderma là một trong những nhóm đứng đầu của vi sinh vật trong đất có tính đối kháng và đƣợc nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Việc nghiên cứu tính đối kháng, đặc biệt là tính chọn lọc của những chất đặc trƣng do nấm Trichoderma tiết ra đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm và tiến hành nghiên cứu nhằm giải thích cơ chế tác động của nhóm nấm này đối với các vật gây bệnh cho cây trồng và sử dụng chúng trong phòng chống bệnh hại cây trồng. Đối với Okigbo và Ikediugw (2000), hai nhà khoa học này cho biết những loài Trichoderma spp. có hệ sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh học chống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch.
Đồ án tốt nghiệp 29 Nấm Trichoderma spp. tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Klein và Eveleigh, 1998). Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra bao gồm glucan 1,3 – beta – glucosidase, endochitinase, chitobiosidase, N – acetyl – beta – D – glucosaminidase (NAGase), trypsin, chymotrypsin, cellulose, protease, lipase, khi kết hợp hai enzyme glucan 1,3 – beta – glucosidase và endochitinase sẽ ngăn đƣợc quá trình tăng trƣởng của nhiều loại Ascomycetes trong nuôi cấy, thêm vào đó sẽ có hiệu quả cao trong việc ngăn cản sự nảy mầm của bào tử hơn là từng loại enzyme đơn lẻ (Margolles và Clark, 1995). Hầu hết các tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc biết là sản xuất enzyme chitinase và β – 1,3 – glucanase có thể làm rã thành tế bào dẫn đến ly giải sợi nấm của mầm bệnh (Esposito .E, Silva .D.M, 1998). Phát hiện thấy hoạt động của các enzym - chitinase và β - 1,3 glucanase trong Trichoderma spp. mạnh hơn khi ủ với tế bào mầm bệnh. Sản xuất β - 1,3 glucanase cũng đã đƣợc báo cáo là một enzyme quan trọng trong kiểm soát sinh học của tác nhân gây bệnh vì β - 1,3 glucan là một thành phần cấu trúc của màng tế bào nấm (Denis, C và Webster, 1971). Đối với cơ chế đối kháng nấm bệnh của nấm Trichoderma, các nhà khoa học đƣa ra những cơ chế khác nhau nhƣng nhìn chung thì nấm Trichoderma kiểm soát sinh học thông qua 3 cơ chế chính: a. Tiết kháng sinh T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của các loài Rhizoctinia solani và Pythium spp. Isonitriles đƣợc sản xuất bởi T. hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở một vài loài T. atroviride và T. viride tiết 6 – pentyl alpha – pyrone (α – pyrone) có hƣơng dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy mầm của những noãn bào tử nấm bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của Botrytis cinnerea.
Đồ án tốt nghiệp 30 Peptaibols do T. polysporum, T. harzianum, T. koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. T. virens, T. koningii, T. viride sản xuất sesquiterpenes và polyketides đƣợc T. harzianum sản xuất. Steroids (viridian) là một độc tố thực vật có hiệu lực nhƣ một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, đƣợc sản xuất bởi T. virens. b. Ký sinh Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hƣớng hóa chất, nó ký sinh phân nhánh hƣớng về những nấm đã đƣợc định trƣớc (do những nấm này tiết ra các hóa chất). Ngoài ra, vật ký sinh và vật đối kháng đƣợc Trichoderma nhận dạng qua trung gian là lectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời, Trichoderma ký sinh và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease những enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. Không những thế, Trichoderma còn có khả năng tiết những enzyme phân giải nhƣ chitinase, glucanase, protease giúp bào mòn thành tế bào sau khi ký sinh và cuộn quanh nấm gây bệnh đối kháng với nó. Khi ký sinh vào cây T. asperellum tiết cellulose, cho phép nó tấn công vào những nấm nhƣ Phytophthora spp. và Pythium spp. khi chúng bám vào cây trồng.
Đồ án tốt nghiệp 31 Hình 1.2. Hình ký sinh của nấm Trichoderma (a. Trichoderma ký sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở các cây họ đậu. (Trichoderma nhuộm màu; Pythium nhuộm màu xanh), b. Nấm Trichoderma sp. quấn lấy sợi nấm gây bệnh (Tô Duy Khƣơng, 2007)). c. Cạnh tranh (Nguyễn Ngọc Phúc, 2005) Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đƣa ra khái niệm cạnh tranh khai thác và cạnh tranh cản trở vào tƣơng tác giữa quần thể nấm. Sự cạnh tranh cản trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật khác tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tƣơng tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác loài. Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 loài cùng khai thác một nguồn lợi nhƣng khác nhau về tốc độ và hiệu quả khai thác. Trong trƣờng hợp nguồn lợi là nguồn dinh dƣỡng đƣợc xem nhƣ cạnh tranh dinh dƣỡng. - Sự cạnh tranh cho mô hoại sinh Botrytis và Sclerotinia spp. là mầm bệnh cơ hội tấn công vào mô thực vật lão hóa hoặc chết coi đó nhƣ nguồn dinh dƣỡng, từ đây tiếp tục tấn công vào những mô khỏe mạnh. Khi đã xử lý Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm chậm sự hình thành khuẩn lạc của Botrytis vào mô thực vật. Sau đó làm giảm mức độ bệnh trên cây. Trichoderma đã đƣợc ứng dụng thành công trong kiểm soát Botrytis và Sclerotinia trên những loại rau cải, trái cây khác nhau: dâu, dƣa chuột… - Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt Bệnh chết nhát (Damping - off) gây bởi Pythium ultimum ở một số loại ngũ cốc và rau quả đƣợc xuất phát bởi sự đáp ứng nhanh chóng của mầm bệnh đối với dịch rỉ từ a b
Đồ án tốt nghiệp 32 hạt. Túi bào tử của Pythium nảy mầm và xâm nhiễm vào hạt giống trong vòng vài giờ khi Pythium đã tràn lan trong đất. Xử lý hạt giống với Trichoderma làm giảm sút sự nảy mầm của túi bào tử Pythium, hiện tƣợng này đƣợc cho là sự cạnh tranh chất kích thích nảy mầm. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng cũng đƣợc xem nhƣ cơ chế hữu hiệu nhất sử dụng bởi T. harzianum T-35 trong sự kiểm soát Fusarium oxysporum trong vùng rễ cây bông vải và dƣa hấu. - Sự cạnh tranh trên vị trí vết thƣơng Một trong những thí nghiệm thành công đầu tiên của sự kiểm soát sinh học trên vết thƣơng gây do cắt xén là sử dụng T. viride, áp dụng trong phun xịt hoặc dùng kéo lớn cắt, để kiểm soát mầm bệnh gây bạc lá (Chondrostoreum purpureum). Thể Trichoderma đƣa vào đƣợc chứng minh có khả năng mọc sợi nấm trên cây vừa bị cắt và ngăn ngừa sự xâm nhiễm của mầm bệnh ở rễ (Amillaria luteobubalina). Sự thối thân thƣờng theo cùng sự xâm nhiễm Botrytis vào vết thƣơng bị cắt trên cây cà chua trong nhà kính; căn bệnh này rất khó kiểm soát bởi những biện pháp canh tác. Thể Trichoderma đƣợc chứng minh có khả năng kiểm soát sự thối thân khi tiêm chủng trƣớc hay cùng lúc với Botrytis, nhƣng không có hiệu quả kiểm soát nếu đƣợc tiêm sau, nhƣ vậy có thể cho rằng sự cạnh tranh mọc sợi nấm trên vết thƣơng là yếu tố xác định sự giảm bệnh. Trong một nghiên cứu sự xâm nhiễm của Pythium vào rễ dƣa chuột đã chỉ ra rằng mặc dù không có sự hình thành sợi nấm của chủng T. harzianum T3 trên toàn bộ rễ nhƣng vẫn có sự hình thành sợi nấm tại vết thƣơng. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng từ dịch rỉ vết thƣơng của thể cạnh tranh là nguyên nhân giảm sự xâm nhiễm của Pythium. Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết những dƣỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores).
Đồ án tốt nghiệp 33 Trong hoạt động sống ký sinh của nấm Trichoderma spp. thì enzyme thủy phân chitinase và β – glucanase đóng vai trò rất quan trọng (Crus và ctv, 1995). Nấm Trichoderma harzianum có khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào nhƣ chitinase, β – 1,3 – glucanase đây là hai enzyme quan trọng trong quá trình ký sinh lên nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003). Khả năng tiết enzyme của Trichoderma spp. chịu ảnh hƣởng của độ yếm khí, lƣợng oxy hòa tan, tốc độ lắc (Marco và ctv, 2002). Một vấn đề quan trọng trong sự hình thành cơ chế đối kháng đƣợc trình bày ở nhiều báo cáo là tùy thuộc vào dòng vi sinh vật đối kháng, nguồn gốc của chúng và điều kiện môi trƣờng, vì thế khi chọn một tác nhân sinh học nên quan tâm đến hƣớng áp dụng, nguồn gốc của mầm bệnh (Kubicek và Harman, 1998).
Đồ án tốt nghiệp 34 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh, Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 07/04/2014 đến ngày 31/07/2014. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguyên liệu 2.2.1.1. Trái và cành thanh long Trái và cành thanh long bị bệnh đƣợc thu từ huyện Châu Thành, tỉnh Long An. Cành thanh long sạch bệnh đƣợc thu từ huyện Châu Thành, tỉnh Long An. Hình 2.1. Cành thanh long bị bệnh đốm trắng (Nguyễn Thành Hiếu và ctv)
Đồ án tốt nghiệp 35 2.2.1.2. Chủng nấm mốc Chủng nấm mốc Trichoderma đƣợc cung cấp, do bạn Nguyễn Thái Minh Hiếu phân lập từ nấm linh chi, sinh viên Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2.2. Hóa chất - D – Glucose (Trung Quốc) - Agar (Việt Nam) - Tween 80 (Trung Quốc) - Kháng khuẩn Chloramphenycol - Urê (Trung Quốc) - KNO3 (Trung Quốc) - (NH4)2SO4 (Trung Quốc) - NaCl (Trung Quốc) 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ - Erlen 250ml - Bình môi trƣờng 250ml, 500ml - Ống đong 100ml, 250ml - Cốc 100ml, 250ml,1000ml, 2000ml - Pipet 1ml, 10ml - Ống nghiệm - Que cấy - Bình tia - Đũa thủy tinh 2.2.3.2. Thiết bị - Cân phân tích (Satorius, Đức) - Cân kỹ thuật (Shimadzu, Nhật)
Đồ án tốt nghiệp 36 - Bếp từ - Nồi hấp Autoclave - Tủ hút Các dụng cụ, thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm... 2.2.3.3. Môi trường nuôi cấy a. Môi trƣờng WA (Water Agar) Thành phần môi trƣờng: - Nƣớc cất: 1000 ml - Agar: 20 g/l - Thuốc kháng khuẩn Chloramphenycol: 0,25 g/l Cách nấu: Cho agar và thuốc kháng khuẩn vào nƣớc cất đun sôi, đem hấp khử trùng ở 1210 C trong 20 phút. Sau khi hấp khử trùng xong, để môi trƣờng hạ xuống nhiệt độ 600 C, đem đổ môi trƣờng. Môi trƣờng WA là môi trƣờng phổ biến để phân lập nấm bệnh. b. Môi trƣờng PDA (Potato D – Glucose Agar) Thành phần môi trƣờng: - Khoai tây: 200 g - Đƣờng D – Glucose: 20 g - Agar: 20 g - Nƣớc cất: 1000 ml Cách nấu: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt hạt lựu, cân đủ 200 g cho nƣớc cất vào đun sôi khoảng 20 phút kể từ khi bắt đầu sôi. Lọc bỏ phần bã, đun sôi trở lại, tiếp theo cho lần lƣợt đƣờng và agar vào (Lƣu ý vừa cho vừa khuấy đều để tránh bị vón cục). Cho vào bình môi trƣờng, đem hấp khử trùng ở nhiệt 1210 C trong 20 phút.
Đồ án tốt nghiệp 37 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 2.3.1. Phương pháp vi sinh 2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh a. Phƣơng pháp nhận dạng và thu thập mẫu (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Bệnh đốm trắng trên thanh long xuất hiện trên bẹ hoặc trái ban đầu là những chấm nhỏ li ti nhƣ kim, phát triển thành những đốm nhỏ màu trắng, vết bệnh trũn thấp so với bẹ, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên vết ghẻ màu nâu và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng. Chọn mẫu ở giai đoạn khi là những chấm nhỏ li ti, đốm nhỏ màu trắng để phân lập tác nhân gây bệnh. b. Phƣơng pháp phân lập nấm bệnh (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Mục đích: nhằm phân lập đƣợc nấm trên mô bệnh Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Cành thanh long bị bệnh lạ cần phân lập. - Đĩa petri vô trùng có chứa môi trƣờng nuôi cấy WA (2%). Các bƣớc phân lập nấm bệnh từ mô cây bệnh nhƣ sau: - Rửa mẫu bệnh dƣới nƣớc máy để loại bỏ đất và bụi bẩn. - Dùng cồn ethanol 70% lau sạch bụi bẩn xung quanh vết bệnh. - Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm, cho vào cồn ethanol 96% trong 5 giây, rửa lại bằng nƣớc cất, vớt ra để lên giấy thấm nƣớc sau đó đặt lên môi trƣờng agar - nƣớc cất. Đặt đĩa petri ở nhiệt độ phòng thí nghiệm cho nấm phát triển. c. Phƣơng pháp cấy truyền (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009)
Đồ án tốt nghiệp 38 Mục đích của giai đoạn này là giúp xác định vi sinh vật nào đã đƣợc phân lập. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Đĩa nấm bệnh đã nuôi cấy trên môi trƣờng WA (2%). - Đĩa petri vô trùng có chứa môi trƣờng PDA. Quy trình cấy truyền - Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày dƣới kính lúp soi nổi và đánh giá sự phát triển của sợi nấm từ các miếng cấy. - Xác định xem có nhiều hơn một loại nấm mọc lên hay không. - Cấy truyền khi sợi nấm mọc đƣợc khoảng 5 mm từ miếng cấy. - Cắt một miếng thạch nhỏ (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi trƣờng PDA Sau khi cấy truyền các mẫu nấm có trong mẫu cấy ban đầu, ta tiến hành làm thuần các mẫu nấm từ các mẫu nấm cấy truyền. d. Phƣơng pháp làm thuần (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Mục đích của phƣơng pháp này là đảm bảo nấm đƣợc cấy hoàn toàn thuần Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Đĩa nấm bệnh đã đƣợc cấy truyền trên môi trƣờng PDA. - Đĩa petri vô trùng có chứa sẵn môi trƣờng PDA. Cách thực hiện Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, lấy một miếng thạch nhỏ chứa phần đỉnh của một sợi nấm duy nhất trên đĩa nấm đã cấy truyền cấy sang đĩa môi trƣờng PDA. Kí hiệu tên mẫu cấy, ngày cấy. e. Phƣơng pháp làm phòng ẩm (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009; Phạm Minh Nhựt, 2010)
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh

Recomendados

đáNh giá hiệu quả thực hiện chương trình thí điểm phân loại rác tại nguồn tr...
đáNh giá hiệu quả thực hiện chương trình thí điểm phân loại rác tại nguồn tr...đáNh giá hiệu quả thực hiện chương trình thí điểm phân loại rác tại nguồn tr...
đáNh giá hiệu quả thực hiện chương trình thí điểm phân loại rác tại nguồn tr...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Analysis the process of importing in forwarding operation of tra-sas ...
Đề tài: Analysis the process of importing in forwarding operation of tra-sas ...Đề tài: Analysis the process of importing in forwarding operation of tra-sas ...
Đề tài: Analysis the process of importing in forwarding operation of tra-sas ...
Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
Sophie Ammann MA Dissertation
Sophie Ammann MA DissertationSophie Ammann MA Dissertation
Sophie Ammann MA Dissertation
Sophie Ammann
 
Invigguide
InvigguideInvigguide
Invigguide
sergioquimica
 
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát quá trình tạo màng phủ ăn được alginate kháng oxi hóa ứng dụng trong...
Khảo sát quá trình tạo màng phủ ăn được alginate kháng oxi hóa ứng dụng trong...Khảo sát quá trình tạo màng phủ ăn được alginate kháng oxi hóa ứng dụng trong...
Khảo sát quá trình tạo màng phủ ăn được alginate kháng oxi hóa ứng dụng trong...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chômNghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Recomendados

đáNh giá hiệu quả thực hiện chương trình thí điểm phân loại rác tại nguồn tr...
đáNh giá hiệu quả thực hiện chương trình thí điểm phân loại rác tại nguồn tr...đáNh giá hiệu quả thực hiện chương trình thí điểm phân loại rác tại nguồn tr...
đáNh giá hiệu quả thực hiện chương trình thí điểm phân loại rác tại nguồn tr...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
Khảo sát trích ly lignin từ gỗ cao su (hevea brasiliensis) bằng na oh h2o2 ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài: Analysis the process of importing in forwarding operation of tra-sas ...
Đề tài: Analysis the process of importing in forwarding operation of tra-sas ...Đề tài: Analysis the process of importing in forwarding operation of tra-sas ...
Đề tài: Analysis the process of importing in forwarding operation of tra-sas ...
Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
Sophie Ammann MA Dissertation
Sophie Ammann MA DissertationSophie Ammann MA Dissertation
Sophie Ammann MA Dissertation
Sophie Ammann
 
Invigguide
InvigguideInvigguide
Invigguide
sergioquimica
 
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ v...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát quá trình tạo màng phủ ăn được alginate kháng oxi hóa ứng dụng trong...
Khảo sát quá trình tạo màng phủ ăn được alginate kháng oxi hóa ứng dụng trong...Khảo sát quá trình tạo màng phủ ăn được alginate kháng oxi hóa ứng dụng trong...
Khảo sát quá trình tạo màng phủ ăn được alginate kháng oxi hóa ứng dụng trong...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chômNghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
Nghiên cứu sản xuất mứt chôm chôm
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang ...
Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang ...Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang ...
Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Đề tài Một số giải pháp nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh tại chi nhánh b...
Đề tài Một số giải pháp nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh tại chi nhánh b...Đề tài Một số giải pháp nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh tại chi nhánh b...
Đề tài Một số giải pháp nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh tại chi nhánh b...
Thư viện Tài liệu mẫu
 
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Analyzing the actual situation exporting cashew nut of cao phat co., ltd.doc
Analyzing the actual situation exporting cashew nut of cao phat co., ltd.docAnalyzing the actual situation exporting cashew nut of cao phat co., ltd.doc
Analyzing the actual situation exporting cashew nut of cao phat co., ltd.doc
Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói 😊 Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149
 
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ongNghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
ứNg dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic
ứNg dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lacticứNg dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic
ứNg dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmNghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai ...
Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai ...Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai ...
Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
đáNh giá hiện trạng và đề xuất các biện pháp quản lý chất thải rắn sinh hoạt ...
đáNh giá hiện trạng và đề xuất các biện pháp quản lý chất thải rắn sinh hoạt ...đáNh giá hiện trạng và đề xuất các biện pháp quản lý chất thải rắn sinh hoạt ...
đáNh giá hiện trạng và đề xuất các biện pháp quản lý chất thải rắn sinh hoạt ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
https://www.facebook.com/garmentspace
 

Mais conteúdo relacionado

Semelhante a Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh

Semelhante a Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh (20)

Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh họcNghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
Nghiên cứu công nghệ thủy phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học
 
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phươ...
 
Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang ...
Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang ...Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang ...
Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang ...
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
ứNg dụng một số phương pháp mô tả nhanh trong phát triển sản phẩm thực phẩm t...
 
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
đáNh giá khả năng đối kháng của một số chủng trichoderma với nấm gây bệnh lở ...
 
Đề tài Một số giải pháp nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh tại chi nhánh b...
Đề tài Một số giải pháp nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh tại chi nhánh b...Đề tài Một số giải pháp nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh tại chi nhánh b...
Đề tài Một số giải pháp nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh tại chi nhánh b...
 
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
Thiết kế hệ thống xử lý nước thải giết mổ gia súc cho hộ kinh doanh lê hữu bì...
 
Analyzing the actual situation exporting cashew nut of cao phat co., ltd.doc
Analyzing the actual situation exporting cashew nut of cao phat co., ltd.docAnalyzing the actual situation exporting cashew nut of cao phat co., ltd.doc
Analyzing the actual situation exporting cashew nut of cao phat co., ltd.doc
 
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ongNghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
Nghiên cứu sản xuất nước nha đam mật ong
 
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp en...
 
ứNg dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic
ứNg dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lacticứNg dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic
ứNg dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêmNghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang từ mãng cầu xiêm
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
 
Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai ...
Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai ...Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai ...
Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống led cải tiến, môi trường hai ...
 
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết anthocyanin từ hoa bụp...
 
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
Khảo sát khả năng diệt khuẩn của sản phẩm gpc8 tm đối với vi khuẩn vibrio par...
 
đáNh giá hiện trạng và đề xuất các biện pháp quản lý chất thải rắn sinh hoạt ...
đáNh giá hiện trạng và đề xuất các biện pháp quản lý chất thải rắn sinh hoạt ...đáNh giá hiện trạng và đề xuất các biện pháp quản lý chất thải rắn sinh hoạt ...
đáNh giá hiện trạng và đề xuất các biện pháp quản lý chất thải rắn sinh hoạt ...
 
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm...
 

Mais de https://www.facebook.com/garmentspace

Mais de https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với nhãn hiệu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty cổ phần...
 
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
Khóa luận tốt nghiệp Xây dựng hệ thống hỗ trợ tương tác trong quá trình điều ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng cung ứng dịch vụ thi ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
Khóa luận tốt nghiệp Quản trị kinh doanh Hoàn thiện cơ cấu tổ chức và phân qu...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Thu hút vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài vào các ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích, thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự t...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cung ứng dịch vụ vận tải hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdfKhóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
Khóa luận tốt nghiệp Tuyển dụng nhân lực tại Công ty Cổ phần Miken Việt Nam.pdf
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Nâng cao hiệu quả áp dụng chính sách tiền lươ...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về an toàn lao động và vệ sinh lao ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
Khóa luận tốt nghiệp Giải pháp phát triển hoạt động marketing điện tử cho Côn...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về hợp đồng mua bán hàng hóa - Th...
 
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh tế Pháp luật về giao kết và thực hiện hợp đồng...
 
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
Khóa luận tốt nghiệp Kinh tế Nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu mặt hàng ...
 
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
Khóa luận tốt nghiệp Hoàn thiện công tác hoạch định của Công ty Cổ phần Đầu t...
 
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
Khóa luận tốt nghiệp ngành Luật Pháp luật về đăng ký kinh doanh và thực tiễn ...
 
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.docĐề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
Đề tài Tác động của đầu tư đến sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế.doc
 
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
Luận văn đề tài Nâng cao sự hài lòng về chất lượng dịch vụ tại công ty TNHH D...
 
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
Khóa luận tốt nghiệp Phân tích và thiết kế hệ thống thông tin quản lý nhân sự...
 

Último

Ecosystem Interactions Class Discussion Presentation in Blue Green Lined Styl...
Ecosystem Interactions Class Discussion Presentation in Blue Green Lined Styl...Ecosystem Interactions Class Discussion Presentation in Blue Green Lined Styl...
Ecosystem Interactions Class Discussion Presentation in Blue Green Lined Styl...
fonyou31
 
9548086042 for call girls in Indira Nagar with room service
9548086042 for call girls in Indira Nagar with room service9548086042 for call girls in Indira Nagar with room service
9548086042 for call girls in Indira Nagar with room service
discovermytutordmt
 
Kisan Call Centre - To harness potential of ICT in Agriculture by answer farm...
Kisan Call Centre - To harness potential of ICT in Agriculture by answer farm...Kisan Call Centre - To harness potential of ICT in Agriculture by answer farm...
Kisan Call Centre - To harness potential of ICT in Agriculture by answer farm...
Krashi Coaching
 

Último (20)

Student login on Anyboli platform.helpin
Student login on Anyboli platform.helpinStudent login on Anyboli platform.helpin
Student login on Anyboli platform.helpin
 
Presentation by Andreas Schleicher Tackling the School Absenteeism Crisis 30 ...
Presentation by Andreas Schleicher Tackling the School Absenteeism Crisis 30 ...Presentation by Andreas Schleicher Tackling the School Absenteeism Crisis 30 ...
Presentation by Andreas Schleicher Tackling the School Absenteeism Crisis 30 ...
 
Class 11th Physics NEET formula sheet pdf
Class 11th Physics NEET formula sheet pdfClass 11th Physics NEET formula sheet pdf
Class 11th Physics NEET formula sheet pdf
 
Ecosystem Interactions Class Discussion Presentation in Blue Green Lined Styl...
Ecosystem Interactions Class Discussion Presentation in Blue Green Lined Styl...Ecosystem Interactions Class Discussion Presentation in Blue Green Lined Styl...
Ecosystem Interactions Class Discussion Presentation in Blue Green Lined Styl...
 
Measures of Central Tendency: Mean, Median and Mode
Measures of Central Tendency: Mean, Median and ModeMeasures of Central Tendency: Mean, Median and Mode
Measures of Central Tendency: Mean, Median and Mode
 
Sanyam Choudhary Chemistry practical.pdf
Sanyam Choudhary Chemistry practical.pdfSanyam Choudhary Chemistry practical.pdf
Sanyam Choudhary Chemistry practical.pdf
 
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptx
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptxSOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptx
SOCIAL AND HISTORICAL CONTEXT - LFTVD.pptx
 
Código Creativo y Arte de Software | Unidad 1
Código Creativo y Arte de Software | Unidad 1Código Creativo y Arte de Software | Unidad 1
Código Creativo y Arte de Software | Unidad 1
 
Z Score,T Score, Percential Rank and Box Plot Graph
Z Score,T Score, Percential Rank and Box Plot GraphZ Score,T Score, Percential Rank and Box Plot Graph
Z Score,T Score, Percential Rank and Box Plot Graph
 
9548086042 for call girls in Indira Nagar with room service
9548086042 for call girls in Indira Nagar with room service9548086042 for call girls in Indira Nagar with room service
9548086042 for call girls in Indira Nagar with room service
 
Mattingly "AI & Prompt Design: Structured Data, Assistants, & RAG"
Mattingly "AI & Prompt Design: Structured Data, Assistants, & RAG"Mattingly "AI & Prompt Design: Structured Data, Assistants, & RAG"
Mattingly "AI & Prompt Design: Structured Data, Assistants, & RAG"
 
Paris 2024 Olympic Geographies - an activity
Paris 2024 Olympic Geographies - an activityParis 2024 Olympic Geographies - an activity
Paris 2024 Olympic Geographies - an activity
 
Arihant handbook biology for class 11 .pdf
Arihant handbook biology for class 11 .pdfArihant handbook biology for class 11 .pdf
Arihant handbook biology for class 11 .pdf
 
Advance Mobile Application Development class 07
Advance Mobile Application Development class 07Advance Mobile Application Development class 07
Advance Mobile Application Development class 07
 
Sports & Fitness Value Added Course FY..
Sports & Fitness Value Added Course FY..Sports & Fitness Value Added Course FY..
Sports & Fitness Value Added Course FY..
 
Kisan Call Centre - To harness potential of ICT in Agriculture by answer farm...
Kisan Call Centre - To harness potential of ICT in Agriculture by answer farm...Kisan Call Centre - To harness potential of ICT in Agriculture by answer farm...
Kisan Call Centre - To harness potential of ICT in Agriculture by answer farm...
 
A Critique of the Proposed National Education Policy Reform
A Critique of the Proposed National Education Policy ReformA Critique of the Proposed National Education Policy Reform
A Critique of the Proposed National Education Policy Reform
 
Accessible design: Minimum effort, maximum impact
Accessible design: Minimum effort, maximum impactAccessible design: Minimum effort, maximum impact
Accessible design: Minimum effort, maximum impact
 
APM Welcome, APM North West Network Conference, Synergies Across Sectors
APM Welcome, APM North West Network Conference, Synergies Across SectorsAPM Welcome, APM North West Network Conference, Synergies Across Sectors
APM Welcome, APM North West Network Conference, Synergies Across Sectors
 
Measures of Dispersion and Variability: Range, QD, AD and SD
Measures of Dispersion and Variability: Range, QD, AD and SDMeasures of Dispersion and Variability: Range, QD, AD and SD
Measures of Dispersion and Variability: Range, QD, AD and SD
 

Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tác nhân gây bệnh

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN THANH LONG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÁC NHÂN GÂY BỆNH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Võ Thị Lan Thanh MSSV: 1051110144 Lớp: 10DSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  • 2. Số: 328/2014/DVVS KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM THÔNG TIN VỀ MẪU THỬ Nơi gởi mẫu: VÕ THỊ LAN THANH Mẫu thử: TL Yêu cầu: Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28S PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN  Giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH Kết quả SAB Kết quả giải trình tự gen 28S CACACCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTG GTGTTGGGCGTTTTGTCTTTGCATCAAAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCGGCCTA CTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAGAGGTCGGCAATCCATC AAGTCCATTTCTCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGG CAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGGCG CTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCC CGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC PHOØNG XEÙT NGHIEÄM NK-BIOTEK 793/58 TRAÀN XUAÂN SOÏAN, P. TAÂN HÖNG, Q.7, TP. HCM ÑT: (08) 37715818, (08) 37752252 Fax: (08) 37750583, ( 08) 37752250 Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com, namkhoa.biotek@gmail.com GP soá: 41G8005341 Theo ñònh höôùng ISO 15189
  • 3. Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH Cochliobolus lunatus internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|JF798505.1|Length: 929Number of Matches: 1 Related Information Range 1: 77 to 716GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1083 bits(586) 0.0 623/640(97%) 6/640(0%) Plus/Plus Query 1 CACACCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT 60 |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 77 CACATCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCAT 136 Query 61 TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 137 TTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC 196 Query 121 GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 197 GATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC 256 Query 181 CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 257 CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTT 316 Query 241 GGTGTTGGGCGTTTT--GTCTTTGCAT--CAAAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCG 296 ||||||||||||||| ||||||| | |||||||||||||||||| |||||||||||| Sbjct 317 GGTGTTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCG 376 Query 297 GCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGC--AAGAGGTCGGCA 354 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||||| Sbjct 377 GCCTACTGGTTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCA 436
  • 4. Query 355 ATCCATCAAGTCCATTTCTCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT 414 |||||||||| | ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 437 ATCCATCAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT 496 Query 415 AAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTG 474 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 497 AAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTG 556 Query 475 AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAG 534 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 557 AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGCAG 616 Query 535 AGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGA 594 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 617 AGGGCGCTTTGGCTTTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGA 676 Query 595 GAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC 634 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 677 GAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCTATTGCCGTGTAAAGCC 716 KẾT LUẬN Cochliobolus lunatus TP. Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 06 năm 2014 TRƯỞNG PHÒNG TS.BS.Phạm Hùng Vân
  • 5. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin “CAM ĐOAN”, luận văn tốt nghiệp này đƣợc tôi thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Tôi cam đoan những nội dung, các số liệu và trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 9 tháng 8 năm 2014 Sinh viên thực hiện Võ Thị Lan Thanh
  • 6. LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nổ lực hết sức của bản thân, em còn nhận đƣợc sự hổ trợ, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, gia đình và bạn bè, em xin chân thành gửi lời “CÁM ƠN” tới: Em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể thầy cô trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng đã truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng để em thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn, lời tri ân sâu sắc đến TS.Nguyễn Thị Hai, Cô đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm để em hoàn thành khóa luận thật tốt. Con xin gửi lời cảm ơn, lòng biết ơn sâu sắc đến ba, mẹ, gia đình, ngƣời thân đã luôn bên cạnh con, cổ vũ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cám ơn đến quý thầy, cô và các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp một cách tốt nhất. Trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp, khó tránh khỏi sai sót; đồng thời, do trình độ cũng nhƣ kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của quý Thầy, Cô để em có thêm nhiều kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm trong công việc sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn ! Tp. Hồ Chí Minh, ngày 9 tháng 8 năm 2014 Sinh viên thực hiện Võ Thị Lan Thanh
  • 7. Đồ án tốt nghiệp i MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu đề tài...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN............................................................................................ 3 1.1. Giới thiệu về cây thanh long ................................................................................. 3 1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 3 1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm phân bố.............................................................................................. 5 1.1.4. Đặc điểm chung của cây thanh long .................................................................. 5 1.2. Thành phần bệnh hại trong sản xuất thanh long .................................................... 6 1.2.1. Tình hình dịch hại trên thanh long..................................................................... 6 1.2.2. Các bệnh thường gặp trên cây thanh long.........................................................10 1.2.2.1. Bệnh thối đầu cành ........................................................................................10 1.2.2.2. Bệnh đốm nâu trên cành ................................................................................10 1.2.2.3. Bệnh rám cành...............................................................................................10 1.2.3. Côn trùng gây hại trên cây thanh long..............................................................10 1.2.3.1. Kiến...............................................................................................................10 1.2.3.2. Bọ xít .............................................................................................................11 1.2.3.3. Ruồi vàng hay ruồi trái cây............................................................................11 1.2.4. Các hiện tượng sinh lý thường gặp trên cây thanh long ....................................11 1.2.4.1. Hiện tượng rụng nụ........................................................................................11
  • 8. Đồ án tốt nghiệp ii 1.2.4.2. Hiện tượng nứt vỏ trái....................................................................................11 1.3. Một số bệnh hại chính..........................................................................................11 1.3.1. Bệnh thán thư ...................................................................................................12 1.3.1.1. Đặc điểm gây hại...........................................................................................12 1.3.1.2. Phổ ký chủ .....................................................................................................13 1.3.1.3. Phương pháp phòng trừ.................................................................................14 1.3.2. Bệnh đốm trắng ................................................................................................16 1.3.2.1. Thời gian xuất hiện........................................................................................17 1.3.2.2. Tác hại...........................................................................................................17 1.3.2.3. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên thanh long .......................................18 1.3.2.4. Một số biện pháp phòng trừ bệnh đốm trắng..................................................20 1.4. Giới thiệu về nấm Cochliobolus lunatus ..............................................................22 1.4.1. Phân loại ..........................................................................................................22 1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa ............................................................................23 1.4.3. Phổ ký chủ........................................................................................................23 1.4.4. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh...........................................................................24 1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus........................................................................................................................24 1.4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ.................................................................................24 1.4.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon........................................................................25 1.4.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại.....................................................................25 1.4.5.4. Ảnh hưởng của pH.........................................................................................25 1.4.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ.............................................................................26 1.5. Sử dụng nấm Trichoderma trong phòng trừ bệnh đốm trắng................................26 1.5.1. Giới thiệu về nấm đối kháng Trichoderma........................................................26 1.5.1.1. Đặc điểm phân loại........................................................................................26 1.5.1.2. Nguồn gốc......................................................................................................26
  • 9. Đồ án tốt nghiệp iii 1.5.1.3. Đặc điểm hình thái nấm.................................................................................26 1.5.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .............................................................................27 1.5.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma...........................................................28 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................... 34 2.1. Địa điểm và thời gian...........................................................................................34 2.1.1. Địa điểm...........................................................................................................34 2.1.2. Thời gian ..........................................................................................................34 2.2. Vật liệu................................................................................................................34 2.2.1. Nguyên liệu.......................................................................................................34 2.2.1.1. Trái và cành thanh long.................................................................................34 2.2.1.2. Chủng nấm mốc.............................................................................................35 2.2.2. Hóa chất...........................................................................................................35 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị............................................................................................35 2.2.3.1. Dụng cụ.........................................................................................................35 2.2.3.2. Thiết bị ..........................................................................................................35 2.2.3.3. Môi trường nuôi cấy ......................................................................................36 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. ....................................................................................37 2.3.1. Phương pháp vi sinh .........................................................................................37 2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh....................37 2.3.1.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến tốc độ phát triển kích thước khuẩn lạc..........................................................................................................42 2.3.1.3. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh với các chủng Trichoderma ..............................................................................................................43 2.3.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu.................................................................................46 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 48 3.1. Kết quả nhận dạng, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long...................................................................................................................48
  • 10. Đồ án tốt nghiệp iv 3.1.1. Kết quả phân lập...............................................................................................48 3.1.1.1. Chủng nấm N1................................................................................................48 3.1.2.2. Chủng nấm N2................................................................................................51 3.1.1.3. Chủng nấm N3................................................................................................53 3.1.2. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ...................................................55 3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến kích thƣớc tăng trƣởng của nấm Cochliobolus lunatus..................................................................................................60 3.2.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến kích thước tăng trưởng của nấm Cochliobolus lunatus........................................................................................................................60 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus ...................................................................................................................................62 3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus........................................................................................................................64 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm Cochliobolus lunatus..................................................................................................67 3.3.1. Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma virens với nấm Cochliobolus lunatus........................................................................................................................67 3.3.2.Khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus..................................................................................................69 3.3.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus ..........................................................................................70 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................. 73 4.1. Kết luận...............................................................................................................73 4.2. Kiến nghị.............................................................................................................73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................74
  • 11. Đồ án tốt nghiệp v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật Ctv: Cộng tác viên GĐ: Giám đốc PDA: Potato D – Glucose Agar TL: Thanh long
  • 12. Đồ án tốt nghiệp vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại các loài xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) khác nhau dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và ruột thịt của trái........................................................................... 4 Bảng 1.2. Điều kiện phát triển thích hợp của cây thanh long........................................ 6 Bảng 1.3. Thành phần dịch hại quan trọng trên thanh long .......................................... 8 Bảng 3.1. Thành phần nấm phân lập đƣợc trên cành thanh long bị bệnh đốm trắng ....48 Bảng 3.2. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N1 trƣớc Koch...........................50 Bảng 3.3. Đƣờng kính trung bình (mm) của tản nấm N2 .............................................53 Bảng 3.4. Đƣờng kính trung bình (mm) tản nấm N3....................................................55 Bảng 3.5. Tỷ lệ bệnh của 3 loại nấm trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo..... ...................................................................................................................................56 Bảng 3.6. Hình thái chủng nấm N1 trƣớc Koch và sau Koch.......................................58 Bảng 3.7. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA với các điều kiện chiếu sáng khác nhau khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng...61 Bảng 3.8. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA ở các mức pH khác nhau.........................................................................63 Bảng 3.9. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA có bổ sung nguồn nitơ khác nhau.....................................................64 Bảng 3.10. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma virens với nấm Cochliobolus lunatus..........................................................................67 Bảng 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm và phần trăm ức chế của Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus...................................................................69 Bảng 3.12. Phần trăm ức chế trung bình 3 lần nhắc của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus..............................................70
  • 13. Đồ án tốt nghiệp vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình quả thanh long..................................................................................... 4 Hình 1.2. Hình ký sinh của nấm Trichoderma ............................................................31 Hình 2.1. Cành thanh long bị bệnh đốm trắng.............................................................34 Hình 2.2. Dịch bào tử sau khi lắc................................................................................41 Hình 2.3. Cành thanh long trƣớc khi lây bệnh nhân tạo ..............................................41 Hình 2.4. Phƣơng pháp cấy đối kháng ........................................................................46 Hình 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N1 ....................................................49 Hình 3.2. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N1 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) ....................................................................................................................50 Hình 3.3. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N2 ....................................................52 Hình 3.4. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N2 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) ....................................................................................................................53 Hình 3.5. Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm N3 ....................................................54 Hình 3.6. Đƣờng kính trung bình của chủng nấm N3 (mm) trong 3NSC (a), 5NSC (b), 7NSC (c) ....................................................................................................................55 Hình 3.7. Cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch ....................56 Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA ............................................................59 Hình 3.9. Kết quả tra cứu BLAST SEARCH ..............................................................60 Hình 3.10. Đƣờng kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau qua 4 ngày sau cấy.............................................................................62 Hình 3.11. Đƣờng kính trung bình tản nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA ở các mức pH khác nhau qua 4 ngày sau cấy ..............................................................64 Hình 3.12. Đƣờng kính trung bình tản nấm của các mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên môi trƣờng PDA với các nguồn nitơ khác nhau ở 4 ngày sau cấy ...............................67 Hình 3.13. Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma virens, Trichoderma harzianum với nấm Cochliobolus lunatus ....................................................................................72
  • 14. Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây thanh long (Hylocereus undatus) là cây trồng chủ lực mang lại hiệu quả kinh tế cao cho ba tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang (Huyện Chợ Gạo) và Long An (Huyện Châu Thành). Trong những năm gần đây do việc mở rộng diện tích đất canh tác để gia tăng sản xuất, thâm canh đồng thời ứng dụng nhiều kỹ thuật mới vào sản xuất (chong đèn xử lý nghịch vụ, trồng mới bằng trụ bê tông, tăng lƣợng phân bón, chăm sóc vƣờn,…) nên năng suất đƣợc nâng cao, phục vụ cho nhu cầu của ngƣời tiêu dùng trong nƣớc và quốc tế cũng nhƣ cải thiện đáng kể nguồn thu nhập của ngƣời sản xuất. Tuy nhiên, ngoài những mặt tích cực trên vẫn còn tồn tại những mặt tiêu cực của vấn đề này là tình hình sâu bệnh trên cây thanh long ngày càng trở nên phức tạp hơn. Trong những năm qua nhiều đối tƣợng dịch hại đã có xu hƣớng phát triển và gây hại ngày càng nặng hơn trên cây thanh long nhƣ bệnh thối trái do vi khuẩn, bệnh thán thƣ, đốm đồng tiền, hiện tƣợng vàng bẹ rám cành… Đặc biệt, vài năm gần đây bệnh đốm trắng hay nhiều nơi bà con còn gọi là bệnh lạ phát triển mạnh và gây thiệt hại nặng ở các vùng trồng thanh long trong cả nƣớc. Bệnh gây hại trên cành và trái làm giảm khả năng quang hợp, gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất cũng nhƣ chất lƣợng trái thanh long. Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa biết đối tƣợng gây bệnh lạ trên thanh long cũng nhƣ chƣa tìm ra phƣơng thức lây lan và giải pháp quản lý hữu hiệu để ứng dụng vào trong sản xuất. Bệnh này đang là bức xúc lớn cho nông dân mà còn cho các nhà chức năng ở các địa phƣơng. Việc tìm ra tác nhân gây bệnh và biện pháp quản lý để giúp làm giảm thiệt hại cho sản xuất thanh long ở các vùng là nhu cầu rất cấp thiết hiện nay. Xuất phát từ lý do trên, sinh viên thực hiện đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long và bƣớc đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến tác nhân gây bệnh”.
  • 15. Đồ án tốt nghiệp 2 2. Mục đích nghiên cứu đề tài Xác định đƣợc tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long, các yếu tố ảnh hƣởng đến nấm gây bệnh làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng biện pháp phòng trừ loại bệnh mới này. 3. Nội dung nghiên cứu Xác định tác nhân gây bệnh lạ trên cây thanh long. Ảnh hƣởng của các yếu tố đến sự phát triển của nấm gây bệnh đốm trắng. Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với tác nhân gây bệnh đốm trắng thanh long trong in vitro.
  • 16. Đồ án tốt nghiệp 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây thanh long 1.1.1. Nguồn gốc (Nguyễn Văn Kế, 2000) Cây thanh long có tên khoa học là Hylocereus undatus Haw thuộc họ xƣơng rồng Cactaceae, tên tiếng Anh là Pitahaya hay còn gọi là dragon fruit. Thanh long có xuất xứ từ những vùng rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Mehico, Trung và Nam Mỹ (bao gồm miền Nam Mehico, bờ Thái Bình Dƣơng của các nƣớc: Guatemala, Costa Rica, El Salvador, Venezuela, Colombia, Ecuador, Nicaragua, Panama, Brazil và Uruguay). Cây thanh long là cây có khả năng chịu nhiệt nên đƣợc trồng ở vùng nóng nhƣ vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Thanh long đƣợc ngƣời Pháp đem vào trồng ở Việt Nam từ thời Pháp thuộc nhƣng mới đƣợc sản xuất ở quy mô lớn từ thập niên 1980. Hiện nay, Việt Nam là nƣớc duy nhất ở Đông Nam Á trồng thanh long tƣơng đối tập trung trên quy mô thƣơng mại. 1.1.2. Phân loại (Bùi Vũ Thùy Dương, 2013) Việc phân loại các loài cây xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và màu ruột thịt của trái. Các loài cây xƣơng rồng có trái ăn đƣợc, đƣợc chia làm 2 nhóm (dựa trên đặc điểm hình thái): vine cacti (có thân bò trên trụ đỡ) và columnar cacti (có thân cột). Nhóm vine cacti thuộc về hai chi khác nhau là Hylocereus và Selenicereus. Nhóm columnar cacti thuộc về ba chi Cereus, Pachycereus và Stenocereus. Ở Việt Nam, dựa theo đặc điểm của trái thanh long đƣợc chia thành ba loại phổ biến: - Thanh long ruột trắng với vỏ hồng (hoặc đỏ): có tên khoa học là Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus.
  • 17. Đồ án tốt nghiệp 4 - Thanh long ruột đỏ với vỏ hồng (hoặc đỏ): có tên khoa học là Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus. - Thanh long ruột trắng với vỏ vàng: có tên khoa học là Hylocereus megalanthus thuộc chi Hylocereus nhƣng trong một nghiên cứu gần đây loài này có nguồn gốc lai giữa hai chi là Hylocereus Selenicereus. Hình 1.1. Hình quả thanh long (a. Quả thanh long ruột trắng, vỏ đỏ Hylocereus undatus, b. Qủa thanh long ruột đỏ, vỏ đỏ Hylocereus undatus, c. Qủa thanh long ruột trắng, vỏ vàng Hylocereus megalanthus (Trần Thị Hoài Vi, 2011) Bảng 1.1. Phân loại các loài xƣơng rồng (có trái ăn đƣợc) khác nhau dựa trên đặc điểm sinh thái, màu vỏ và ruột thịt của trái Loài Màu sắc của Vỏ quả Ruột thịt quả Vine cacti Hylocereus udatus Hylocereus udatus Hylocereus triangularis Hylocereus costaricensis Hylocereus polyrhizus (syn H. monacanthus) Hylocereus ocamponic Selenicereus megalanthus Đỏ Đỏ Vàng Đỏ Đỏ Vàng Vàng Trắng Đỏ Trắng Đỏ Đỏ Đỏ Trắng a b c
  • 18. Đồ án tốt nghiệp 5 (syn H. megalanthus) Columnar cacti Cereus triangular Acanthocereus pitajaya Cereus ocamponic Vàng Vàng Đỏ Trắng Trắng Đỏ (Nguồn: Crane và Balerdi, 2004; Mizrahi và Nerd, 1999) 1.1.3. Đặc điểm phân bố (Nguyễn Văn Kế, 2000) Thanh long là loài thực vật bản địa tại Mehico và các nƣớc ở khu vực Trung và Nam Mỹ, từ đây thanh long đƣợc du nhập sang các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới ở châu Mỹ, châu Á, châu Đại Dƣơng và vùng Trung Đông. Thanh long cũng đƣợc trồng ở các nƣớc trong khu vực Đông Nam Á nhƣ Việt Nam, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Indonesia; ngoài ra chúng cũng hiện diện ở khu vực miền Nam Trung Quốc, Đài Loan và một số khu vực khác. Hiện nay, thanh long đang đƣợc trồng ở ít nhất 22 nƣớc nhiệt đới nhƣ: Australia, Cambodia, China, Colombia, Ecuador, Guatemala, Indonesia, Israel, Philippines, Tây Ban Nha, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, miền Nam nƣớc Mỹ và Việt Nam. Ở Việt Nam, thanh long đƣợc trồng đầu tiên ở Nha Trang và Phan Thiết từ thời Pháp thuộc. Sau khi thanh long trở thành hàng hóa thƣơng mại và xuất khẩu ra nhiều nƣớc trên thế giới, phong trào trồng thanh long phát triển mạnh ở Phan Rang, Phan Thiết, Bình Thuận, Buôn Ma Thuộc và các tỉnh ở đồng bằng sông Cửu Long nhƣ: Tiền Giang, Long An…. Trong những vùng trồng thanh long ở Việt Nam, Bình Thuận có diện tích trồng thanh long thƣơng mại ƣớc tính khoảng 1000 ha trong khi cả nƣớc chiếm khoảng 2000 ha. 1.1.4. Đặc điểm chung của cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) Thanh long là cây có nguồn gốc nhiệt đới có khả năng chịu hạn nên thƣờng đƣợc trồng ở những vùng nóng, chúng thích nghi đƣợc với những nơi có cƣờng độ ánh sáng mạnh. Thanh long mọc đƣợc trên nhiều loại đất khác nhau nhƣ đất xám bạc màu
  • 19. Đồ án tốt nghiệp 6 (Bình Thuận), đất phèn (Thành phố Hồ Chí Minh), đất đỏ latosol (Long Khánh)…, đồng thời cây thanh long có khả năng thích nghi với các độ chua (pH) khác nhau của đất (thanh long thích nghi tốt với đất hơi acid). Không giống nhƣ các loài xƣơng rồng khác, thanh long tuy có khả năng chịu hạn nhƣng cũng cần một lƣợng nƣớc nhất định cho sự phát triển và tạo quả. Lƣợng mƣa hằng năm từ 500 – 1500 mm thích hợp nhất cho sự phát triển của cây thanh long. Bảng 1.2. Điều kiện phát triển thích hợp của cây thanh long Yếu tố khí hậu Điều kiện tối ƣu Độ cao (m) Nhiệt độ (0 C) Lƣợng mƣa (mm) Đất pH Lên tới 1700 m 20 – 30 500 – 2000 (với thời tiết nóng ẩm nhiệt đới có hai mùa mƣa nắng luân phiên) Có khả năng thoát nƣớc tốt 5,5 – 6,5 (Nguồn: H. P. M. Gunasena và ctv, 2004) 1.2. Thành phần bệnh hại trong sản xuất thanh long 1.2.1. Tình hình dịch hại trên thanh long (Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa, 2014) Thanh long là một loại cây ở vùng nhiệt đới nên chúng dễ dàng bị nhiễm bệnh hoặc dịch hại. Tuy nhiên, so với các loại cây ăn trái khác, cây thanh long có ít đối tƣợng dịch hại nghiêm trọng hơn (Bảng 1.3), ngoại trừ gần đây đã xuất hiện bệnh đốm trắng gây hại nặng nề và diễn tiến bệnh có xu hƣớng ngày càng phức tạp đối với tất cả các vùng trồng thanh long trọng điểm ở phía Nam. Theo số liệu tổng hợp ghi nhận từ Chi cục Bảo vệ thực vật các tỉnh Tiền Giang, Long An và Bình Thuận, trong năm 2013 có khoảng 6000 ha thanh long nhiễm bệnh (chiếm 20 – 25% tổng diện tích), bệnh tấn công mạnh vào mùa mƣa và gây thiệt hại nặng nề 20 – 50% năng suất. Các giải pháp kỹ thuật tạm thời đƣợc các địa phƣơng khuyến cáo áp dụng vẫn chƣa đạt đƣợc hiệu quả
  • 20. Đồ án tốt nghiệp 7 nhƣ mong muốn và ngƣời trồng thanh long đã sử dụng nhiều biện pháp khác nhau mà chủ yếu là thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) nhƣng tỷ lệ thành công còn thấp, ngƣợc lại tiềm ẩn nguy cơ mất an toàn do ô nhiễm thuốc BVTV là rất cao. Trong năm 2011, Bộ môn Bảo vệ thực vật - Viện Cây ăn quả miền Nam đã giám định một số mẫu bệnh đốm trắng trên cành thanh long do Chi cục Bảo vệ thực vật Bình Thuận gửi đến. Qua kết quả phân lập và giám định đã xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Kết quả cũng tƣơng tự đối với những mẫu bệnh trên cành và trái thanh long ở Long An, Tiền Giang. Trƣớc đây, nấm Neoscytalidium dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau nhƣ: Fusicoccum dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea... Theo ghi nhận của Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa (2014) bệnh đốm trắng chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh vào mùa mƣa, nhiệt độ thích hợp cho nấm bệnh phát triển từ 20 - 300 C, ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan. Bên cạnh đó, theo ghi nhận của Viện Cây ăn quả miền Nam cũng cho thấy một số đối tƣợng dịch hại mới khác nhƣ: hiện tƣợng đỏ đầu trái (chín ngƣợc), sâu đục cành hoặc thân, ốc sên trắng cũng bắt đầu gây hại rải rác ở các địa phƣơng trồng thanh long trọng điểm nêu trên. Cùng với sự hội nhập ngày càng sâu rộng, các yêu cầu về mặt chất lƣợng sản phẩm của các quốc gia nhập khẩu càng trở nên khắc khe và cũng là rào cản kỹ thuật đối với trái thanh long Việt Nam, đặc biệt là vấn đề tồn dƣ dƣ lƣợng thuốc BVTV trở nên nóng bỏng hơn bao giờ hết.
  • 21. Đồ án tốt nghiệp 8 Bảng 1.3. Thành phần dịch hại quan trọng trên thanh long TT Dịch hại Tác nhân gây bệnh Bộ phận bị hại Thời điểm gây hại Mức độ phổ biến I. Bệnh hại 1 Bệnh đốm trắng (đốm nâu, tắc kè…) Neoscytalidium dimidiatum Cành, trái non và thu hoạch Quanh năm +++ 2 Bệnh thối trái (ruột đỏ), thối đầu trái (ruột trắng) Erwinia chrysanthemi Bông, trái non Quanh năm +++ 3 Thán thƣ Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum sp. Trái, hoa Mùa mƣa +++ 4 Rỉ sét (đốm đen) Bipolaris sp. Bông Mùa mƣa +++ 5 Vàng bẹ rám cành Fusarium equiseti, Bipolaris crutacea Cành Mùa nắng +++ 6 Nấm bồ hóng Capnodium sp. Cành, hoa, trái Quanh năm +++ 7 Thối trái Fusarium sp. Trái sắp chín Mùa mƣa ++ 8 Thối bẹ Alternaria sp., Fusarium sp., bacteria Cành Cuối mùa nắng, đầu mùa mƣa ++ 9 Đốm nâu Glocosporium Cành Quanh năm +
  • 22. Đồ án tốt nghiệp 9 avages II. Côn trùng 1 Bọ trĩ Thrip sp. Bông, trái non Mùa nắng + 2 Ngâu Protaetia sp. và Hypomeces squamesus Cành, bông Quanh năm ++ 3 Kiến Cành, bông, trái non Kiến lửa Solenopsis geminate Quanh năm + Kiến riện Cardiocondyla wroughtoni Cành, bông, trái non Quanh năm +++ Kiến xám Paratrechina longicornis Cành, bông, trái non Quanh năm +++ 4 Ruồi đục quả Bactrocera dorsalis Trái chín Mùa mƣa + 5 Rệp sáp Pseudococcus sp. Cành, trái Mùa nắng + 6 Ốc sên Achtina sp. Cành, trái thu hoạch Mùa mƣa + 7 Rầy mềm Toxoptera sp. Cành, trái non Quanh năm + (Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa, 2014) Ghi chú: + mức độ bệnh thấp, ++ mức độ bệnh trung bình, +++ mức độ bệnh khá phổ biến.
  • 23. Đồ án tốt nghiệp 10 1.2.2. Các bệnh thường gặp trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.2.1. Bệnh thối đầu cành Triệu chứng bệnh: Ngọn cành thanh long chuyển màu vàng, rồi mềm, sau đó thối. Cây tăng trƣởng chậm, số cành giảm hẳn. Bệnh hay xảy ra vào cuối mùa nắng. Bệnh xảy ra không những trên đất phèn (đất thấp) mà còn cả trên đất cao nữa. Nguyên nhân chính là do nấm Alternaria sp. gây ra. Biện pháp phòng trị bằng cách phun Rovral 2 lần liên tiếp cách nhau 1 tuần. 1.2.2.2. Bệnh đốm nâu trên cành Triệu chứng bệnh là trên thân cành thanh long có những đốm tròn nhƣ mắt cua màu nâu. Vết bệnh nằm rải rác hoặc tập trung, thƣờng kéo dài thành từng vệt dọc theo thân cành. Có nhiều vết acervulus tròn đen nằm rải rác. Tác nhân là nấm Gloeosporium agavaes. 1.2.2.3. Bệnh rám cành Triệu chứng: Bệnh rám cành làm cho thân, cành thanh long có một lớp màng mỏng màu xám tro, nhám. Tác nhân gây bệnh rám cành là nấm Macssonina agaves Syd và Sphaceloma sp. Họ Nectrioidaceae, Bộ Melanconiales, Lớp Deuteromycetes. Biện pháp phòng trị chung cho các bệnh thanh long là vệ sinh đồng ruộng, chống úng và chống hạn cho cây. Khi bệnh phát triển nhiều thì dùng thuốc Rovral, hoặc Anvil 5sc (30 – 100 g/ha) phối hợp với Topas (10 – 50 g/ha). Ngoài sâu bệnh kể trên thanh long còn bị dơi, chim, chuột phá hoại quả. 1.2.3. Côn trùng gây hại trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.3.1. Kiến Cắn, đục khoét làm hƣ hỏng giống và các cành thanh long non, cắn mất tai lá trên trái, gây tổn thƣơng vỏ trái, đây là loại côn trùng dễ phòng trừ. Để phòng trị dùng Basudin (Diazinon) 10H, Padan 4G, 10G trộn đều với cát 2/1000 rải đều quanh gốc hoặc những nơi chúng làm tổ. Khi phun vào các ổ kiến thì dùng Bi 58, Diazinon…
  • 24. Đồ án tốt nghiệp 11 1.2.3.2. Bọ xít Hại thanh long từ khi có nụ hoa đến khi trái hình thành, chúng chích hút nhựa, để lại những vết chích rất nhỏ nhƣng đến khi quả chín nơi các vết chích sẽ xuất hiện một chấm đen, mất giá trị xuất khẩu. Việc phòng trừ dùng Trebon, Applaud, Bassa… nồng độ 0,2%. Phun lên khu vƣờn có bọ xít xuất hiện. 1.2.3.3. Ruồi vàng hay ruồi trái cây (Dacus dorsalis) Đây là đối tƣợng nguy hiểm đang đƣợc báo động hiện nay. Chúng trƣởng thành chích và đẻ trứng vào quả gây thoái hóa phần thịt quả và phần nhựa chảy ra ngoài vỏ làm quả thanh long bị hƣ, không xuất vƣờn đƣợc. Tuy chúng là đối tƣợng mới xuất hiện trên thanh long nhƣng ruồi trái cây đã gây hại rất nhiều loại quả ở nƣớc ta vì thế cần chú ý phòng trừ. Cần vệ sinh đồng ruộng nhƣ thu dọn và tiêu hủy các quả rụng, rải thuốc diệt nhộng dƣới đất, đặt bả có chứa chất dẫn dụ trích từ cây é tía trộn với thuốc trừ sâu để diệt ruồi. Hiện nay, các thuốc nhƣ Ruvacon 90L và Vizubon D đã có chứa sẵn chất dẫn dụ là Metyl eugenol 75% nên tiện cho nhà vƣờn hơn. 1.2.4. Các hiện tượng sinh lý thường gặp trên cây thanh long (Nguyễn Văn Kế, 2000) 1.2.4.1. Hiện tượng rụng nụ Xuất hiện khi số nụ trên cành nhiều. Sau khi nụ xuất hiện 5 – 7 ngày thì nụ không phát triển nữa, vàng rồi rụng. Tỷ lệ rụng từ 10% đến 20%. Cây thanh long tự quân bình sinh lý để nuôi quả còn lại trên cây. Để hạn chế sự rụng quả sinh lý cần bón phân tƣới nƣớc đầy đủ. 1.2.4.2. Hiện tượng nứt vỏ trái Do thời tiết, trời hạn ở giai đoạn vỏ quả phát triển, sau đó mƣa nhiều hoặc tƣới nhiều nƣớc vào lúc ruột đang phát triển nên quả nứt. Mặt khác, do nhà vƣờn treo quả lâu đợi dịp có giá mới bán. Để hạn chế nên kiểm soát độ ẩm đất, không để vƣờn khô hạn trong thời kỳ cây nuôi quả. 1.3. Một số bệnh hại chính
  • 25. Đồ án tốt nghiệp 12 1.3.1. Bệnh thán thư 1.3.1.1. Đặc điểm gây hại a. Sự nguy hại của bệnh thán thƣ (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh thán thƣ do nấm Collectotrichum gloeospoides gây ra trên thanh long là bệnh gây hại quan trọng nhất làm tổn thất đến năng suất và phẩm chất của trái, đặc biệt vào mùa mƣa bão, nấm tấn công lên thân, cành, nụ hoa và trên trái ở các giai đoạn khác nhau, nhiễm nặng nhất là giai đoạn sau thu hoạch. b. Triệu chứng bệnh (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh gây hại chủ yếu trên đọt, hoa và trái, đôi khi trên cành cũng bị tấn công. Trên cành: Vết bệnh bắt đầu từ mép cành lan dần vào bên trong. Vết bệnh dạng tròn hay bất định. Khi nấm tấn công vào cành làm cho cành thối mềm có màu vàng sáng, sau một thời gian ngắn chuyển sang màu nâu, thối từ phần ngọn vào trong. Trên hoa: Nấm tạo thành những đốm đen nhỏ làm hoa bị thâm đen và rụng. Bệnh tấn công cả phần nụ hoa, làm cho nụ hoa biến thành màu nâu, sau đó rụng rất nhanh. Trên trái: Ở điều kiện ngoài đồng bệnh ít khi tấn công trên trái, tuy nhiên ở giai đoạn trái lớn sắp thu hoạch hoặc đã thu hoạch và tồn trữ. Vết bệnh là những đốm tròn hoặc gần tròn, có tâm màu nâu đỏ, lõm xuống, xung quanh có những vòng đồng tâm nâu sậm, sau đó phát triển nhanh thành những mãng thối lõm vào vỏ, gây thất thoát lớn trong quá trình vận chuyển, tồn trữ. c. Đặc điểm phát sinh và phát triển của bệnh (Nguyễn Văn Hòa, 2013; Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh thán thƣ phát triển mạnh ở điều kiện ẩm ƣớt và nhiệt độ không khí cao. Nấm có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 40 C, nhƣng tối thích là 25 – 290 C. Bề mặt mô bệnh ẩm ƣớt kéo dài có ảnh hƣởng đến sự xâm nhiễm và sinh trƣởng của nấm Collectotrichum gloeosporioides.
  • 26. Đồ án tốt nghiệp 13 Trong điều kiện ngoài đồng: Bệnh bình thƣờng tồn tại trong xác bã thực vật có trong vƣờn hoặc trên cành, trái bệnh. Bệnh phát triển mạnh và bộc phát ở điều kiện ẩm độ cao nhất là vào mùa mƣa. Bệnh phát triển và gây hại nặng ở giai đoạn ra hoa, trái sắp thu hoạch và sau thu hoạch. 1.3.1.2. Phổ ký chủ (Stanley Freeman, 2008; Steven John Mackenzie, 2005) Collectotrichum spp. là tác nhân gây bệnh trên phạm vi rộng, nhiều loài có thể lây nhiễm một vật chủ duy nhất và loài duy nhất có thể lây nhiễm vật chủ khác nhau (Freeman và ctv, 1998). Thí dụ một vật chủ có thể bị nhiễm bệnh bởi nhiều loài Collectotrichum kể cả dâu tây bị nhiễm bệnh bởi 3 loài Collectotrichum, cụ thể là C. acutatum, C. fragariae, và C. gloeosporioides ; quả bơ và xoài nhiễm bệnh do cả hai loại nấm C. acutatum và C. gloeosporioides ; hạnh nhân và các loại trái cây chín vào một thời kỳ nhất định bị nhiễm bệnh do nấm C. acutatum hoặc C. gloeosporioides gây ra; cam quýt bị bệnh do ảnh hƣởng của các loài Colletotrichum khác nhau, đó là rụng quả và bệnh loét do C. acutatum gây ra, cây chết mầm non do C. gloeosporioides (Freeman và ctv, 1998). Hơn nữa nấm Colletotrichum còn là ký chủ trên cây cà phê, cây bầu, cây hồ tiêu, cà chua và những cây khác (Bailey và Jeger, 1992). Ở vùng nhiệt đới, nấm Collectotrichum gloeosporioides xuất hiện trên hầu hết các loại cây trồng, giai đoạn tồn tại chủ yếu của nấm là sống hoại sinh trên mô chết hoặc những tàn dƣ của cây trồng. Theo Mills và ctv (1992), những mẫu nấm bệnh Collectotrichum gloeosprioides thƣờng gây hại trên cây ký chủ nhƣ bơ, đu đủ, xoài, chuối, phong lan và cao su. Ở Australia ngƣời ta phát hiện thấy trên cây cỏ Stylosanthes có hai chủng nấm Collectotrichum gloeosprioides khác nhau. Qua quá trình phân lập mẫu bệnh và phân tích sinh học phân tử đã phát hiện thấy có sự biến động xảy ra trong nhân mặc dù không biết do yếu tố nào gây ra. Sự biến động này cũng tìm thấy ở trên cây dâu trồng ở vùng ôn đới (Maner và ctv, 1992).
  • 27. Đồ án tốt nghiệp 14 Nấm Colletotrichum gloeosporioides cũng đƣợc phân lập từ 23 loại cây ăn quả ở Sri Lanka. Tác nhân gây bệnh này đã không đƣợc ghi nhận trƣớc đây trên sầu riêng, măng cụt, chôm chôm và Jambu Pini và 11 cây ăn quả ít quan trọng về kinh tế khác ở Sri Lanka. Các triệu chứng của nhiễm C. gloeosporioides trên các giống cây ăn quả, đặc biệt là xoài và chôm chôm có thể gây ra lên đến 40%. 1.3.1.3. Phương pháp phòng trừ Để phòng trừ bệnh thán thƣ, có một số biện pháp nhƣ sau: a. Biện pháp canh tác (Nguyễn Văn Hòa, 2013) Đào mƣơng lên lip (luống): Tùy theo độ cao của đất mà thiết kế líp đôi hay líp đơn, sao cho đảm bảo mực nƣớc ở thời điểm cao nhất là 20 – 30 ci vì rễ rất dễ bị úng và thối. Nên đắp mô cao để cây phát triển tốt, kích thƣớc mô 80 × 30 cm, khoảng cách trồng 3 × 3 m hoặc 3 × 3,5 m (mật độ khoảng 100 trụ/1000 m2 ). Trồng cây chắn gió: Nên trồng cây chắn gió đối với những vùng chuyên canh để hạn chế mầm bệnh lan vào. Trụ để thanh long phát triển: Tốt nhất là sử dụng trụ xi măng vì trụ bằng cây sống dễ mang mầm bệnh, sâu, không bền vững. Trụ xi măng cao 2 – 2,5 m, ngang 12 – 15 cm, phía trên trụ nên có que sắt dài 30 – 40 cm để làm giá đỡ cho thanh long. Bón phân cân đối, hợp lý: Nên bón phân cân đối và hợp lý theo quy trình kỹ thuật canh tác thanh long, liều lƣợng và phân tùy thuộc vào loại đất và điều kiện sinh trƣởng của cây, khả năng cho trái của vụ trƣớc. Cần bón nhiều phân hữu cơ đã đƣợc ủ hoai mục, nên cung cấp thêm vôi cho cây trƣớc và sau mùa mƣa. Tƣới nƣớc: Nên thiết kế hệ thống tới để quản lý tốt nguồn nƣớc, tránh mầm bệnh lây lan, tránh tƣới phun lên tán cây khi trong vƣờn có nhiều mầm bệnh thán thƣ. Tủ gốc giữ ẩm: Tủ gốc giữ ẩm cho cây vào mùa nắng bằng rơm, rạ, cỏ khô, tủ cách gốc 5 – 10 cm giúp giảm lƣợng cỏ dại, cung cấp dinh dƣỡng cho cây. b. Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh (Vũ Triệu Mân, 2007)
  • 28. Đồ án tốt nghiệp 15 Tạo ra những giống kháng bệnh đã và đang đƣợc các cơ sở nghiên cứu nông nghiệp trên thế giới quan tâm, tuy nhiên công việc này đòi hỏi phải mất nhiều thời gian. Do vậy, hiện nay đối với cây trồng hằng năm mới chỉ tạo một số giống có khả năng chống bệnh do nấm Collectotrichum gloeosporioides gây ra, đặc biệt trên cây trồng lâu năm, số lƣợng những giống kháng với loại nấm này đem lại hiệu quả kinh tế cao còn chƣa nhiều. c. Biện pháp cơ học (Nguyễn Văn Hòa, 2013) Khi cây còn nhỏ: Tỉa cành và tạo tán giúp cho cây có tán phân bố đều theo 4 hƣớng, giúp cây thông thoáng, quang hợp tốt, loại bỏ đƣợc cành sâu bệnh, cành giáp mặt đất. Sau thu hoạch: Nên cắt bỏ những cành sâu bệnh, cành tiếp đất. Thu gom tất cả tàn dƣ sau khi cắt tỉa hoặc sau thu hoạch để giảm mầm bệnh trong vƣờn. d. Biện pháp sinh học (Nguyễn Văn Hòa, 2013) Đây là một trong những biện pháp phòng trừ tổng hợp dịch hại trên cây trồng. Tùy theo từng loại bệnh trên những cây trồng khác nhau mà hiệu quả của biện pháp này đem lại khác nhau. Còn rất ít những kết quả nghiên cứu khả năng phòng trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides trên đồng ruộng bằng biện pháp phòng trừ sinh học. Để phòng trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thƣ, trong vƣờn nên bón nhiều phân hữu cơ và cung cấp nấm đối kháng Trichoderma vừa giúp phân hủy chất hữu cơ nhanh, vừa diệt mầm bệnh hiện diện trên xác bã thực vật có trên và trong đất. Phun thuốc kháng sinh nhƣ Salicylic acid 15 ngày trƣớc khi thu hoạch. Sử dụng biện pháp bao trái sau khi phun thuốc lần cuối (14 – 15 ngày trƣớc khi thu hoạch). e. Biện pháp hóa học (Nguyễn Văn Hòa, 2013)
  • 29. Đồ án tốt nghiệp 16 Trên thực tế, đối với các bệnh do nấm gây ra nói chung và bệnh do nấm Collectotrichum gây hại nói riêng thì biện pháp phòng trừ hóa học vẫn đóng vai trò cần thiết. Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1998), trong 6 nhóm thuốc trừ bệnh đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp, nhóm thuốc những hợp chất dị vòng có tác dụng hữu hiệu trừ bệnh do nấm Collectotrichum gây ra. Thuốc chứa hợp chất gốc đồng, Benzamidazole, Dithiocarbamates, Triazole và các thuốc trừ nấm nhƣ: Chlorothalonil, Imazalil, Prochloraz có hiệu quả trừ nấm Collectotrichum gloeosporioides do những nhóm thuốc này có khả năng xâm nhập vào mô cây ngăn cản và phá hủy sự xâm nhiễm tiềm ẩn của nấm. Tuy nhiên việc dùng Benzamidazole liên tục có thể làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm. Nên phun thuốc trừ nấm ngoài đồng sau khi thu hoạch, sau khi cắt tỉa để giảm áp lực mầm bệnh, phun lần hai khi trái có nụ hoa. Phun thuốc gốc Propineb khi vừa đậu trái và Difenoconazole 7 ngày tiếp theo. f. Xử lý sau thu hoạch (Nguyễn Văn Hòa, 2013) Sau khi thu hoạch tiến hành xử lý nƣớc nóng trái thanh long, ở nhiệt độ 530 C trong 10 phút không làm tổn thƣơng trái và giảm thiểu đáng kể mầm bệnh sau thu hoạch. Khi thu hoạch thấy có vết sâu bệnh xuất hiện trên trái phải loại ngay, không nên để tồn trữ chung với những trái khác để tránh sự lây lan. Đây là loại nấm đa ký chủ và gây hại quan trọng, khó quản lý, để phòng trị hiệu quả nên thực hiện phòng trị đồng loạt trên diện rộng thì sẽ mang lại hiệu quả cao. 1.3.2. Bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng trên thanh long hay còn gọi là bệnh lạ, đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi khác nhau mà bà con nông dân trồng thanh long ở tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An đặt tên cho một loại dịch hại mới phát sinh, gây thiệt hại nghiêm trọng và có xu hƣớng ngày càng lan rộng.
  • 30. Đồ án tốt nghiệp 17 1.3.2.1. Thời gian xuất hiện (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2013) Theo ghi nhận của Viện Nghiên cứu Cây ăn quả miền Nam thì trên thực tế bệnh này đã xuất hiện rải rác đầu tiên vào năm 2008 tại Bình Thuận và Tiền Giang và đến năm 2011 trở lại đây thì bệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn tại những địa phƣơng này. Theo TS Nguyễn Nhƣ Cƣờng, GĐ Trung tâm Nghiên cứu BVTV Nam bộ, tác nhân gây bệnh là một loài nấm. Năm 2009, bệnh lần đầu đƣợc ghi nhận ở Đài Loan và Bình Thuận của Việt Nam, bệnh này đƣợc đặt với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ “đốm nâu”, “mắt cua”, “đốm trắng”, “tắc kè”. Mức độ bệnh xuất ở các vƣờn dao động từ 20 – 50%, có những vƣờn mất trắng năng suất do quả bị nhiễm bệnh nặng không thể thu hoạch đƣợc, thiệt hại rất lớn cho nhà vƣờn trồng thanh long. Bên cạnh đó, theo ông Trần Minh Tiến, Chi Cục trƣởng Chi cục BVTV tỉnh Bình thuận cho biết, bệnh đốm trắng cành và quả thanh long đã xuất hiện từ năm 2009 – 2010 nhƣng chỉ xuất hiện rải rác, cục bộ tại một số vƣờn thanh long ở Hàm Thuận Bắc. Sau khi kiểm tra thực tế tại Cẩm Hang (xã Hàm Hiệp) và một số vƣờn ở Hàm Thuận Nam, Chi cục BVTV Bình Thuận đƣa ra nhận định, hiện tƣợng bệnh đốm trắng trên thanh long chỉ xảy ra vào đầu mùa mƣa. Đồng thời xuất hiện ở những vƣờn cỏ nhiều, chăm sóc kém, độ pH trong gốc thấp, bộ rễ kém phát triển. Đầu tiên, những đốm chấm trắng xuất hiện trên cành non, trái gần chín và trái chín. Trên cành non sau khi xuất hiện vết chấm thì 7 – 10 ngày lớp biểu bì sẽ chết, nấm và vi khuẩn xâm nhập vào gây thối, cháy cành. Nhƣng đến nay, chỉ sau một thời gian ngắn bệnh đã phát triển mạnh ở hầu hết các vùng trồng thanh long trong tỉnh. 1.3.2.2. Tác hại (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2013) Bệnh thƣờng gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Lúc đầu triệu chứng trên bẹ hoặc trái là những đốm tròn nhỏ màu trắng, vết
  • 31. Đồ án tốt nghiệp 18 bệnh trũng thấp so với bề mặt bẹ, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên những vết ghẻ có màu nâu và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng. Bệnh còn tấn công trên trái chín chuẩn bị thu hoạch. Những đốm này xuất hiện rõ hơn và nhiều hơn, buộc lòng những trái này bị dạt ra hoặc bán với giá rẻ hơn, làm giảm thu nhập của nhà vƣờn. Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích thanh long bị nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800 ha, nặng 400 ha, trong tổng số 21 nghìn ha; Tiền Giang với gần 3 nghìn ha thanh long thì có đến 2420 ha nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ, diện tích nhiễm nặng 80 ha; Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766 ha, nặng 41 ha, trong tổng số gần 2700 ha… và đang có xu hƣớng lây lan nhanh. Thanh long Việt Nam đã xuất khẩu tới 40 quốc gia và vùng lãnh thổ. Năm 2013, kim ngạch xuất khẩu (chính ngạch) trái cây tƣơi đạt 307 triệu USD thì thanh long chiếm tới 61,4%. Ngoài một số thị trƣờng truyền thống nhƣ Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Hà Lan… thanh long đang từng bƣớc xâm nhập vào một số thị trƣờng mới nhƣ Ấn Độ, New Zealand, Úc, Chi Lê tạo đƣợc sự đa dạng hóa trong cơ cấu thị trƣờng xuất khẩu thanh long của Việt Nam. Tuy nhiên, với tình hình bệnh đốm trắng trên thanh long đang có xu hƣớng lây lan nhanh, làm giảm năng suất và chất lƣợng quả thanh long, không đảm bảo kim ngạch xuất khẩu có nguy cơ mất một số thị trƣờng tiêu thụ lớn. 1.3.2.3. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên thanh long Trƣớc thực trạng bệnh gây hại nặng trên cây thanh long, Viện Cây ăn quả miền Nam đã tiến hành nghiên cứu, khảo nghiệm bằng nhiều phƣơng pháp khoa học, chuyển giao kỹ thuật và triển khai tập huấn “Quy trình quản lý tổng hợp sâu bệnh hại quan trọng trên thanh long” cho gần 600 nông dân trồng thanh long tập trung ở Bình Thuận và Tiền Giang. Mặt khác, Viện còn cử 18 bác sĩ cây trồng từ Viện và sáu chuyên gia đến từ Malaysia đi thăm khám định kỳ tại một số xã có trồng thanh long ở huyện Chợ Gạo,
  • 32. Đồ án tốt nghiệp 19 tỉnh Tiền Giang. Ngoài ra, Viện cũng đã đƣa ra quy trình “Quản lý bệnh đốm trắng trên thanh long tạm thời” trên thông tin đại chúng để giúp nhà vƣờn trồng thanh long ứng dụng vào sản xuất, bƣớc đầu đã có hiệu quả. Bên cạnh đó, một số đề tài nghiên cứu về bệnh trên cây thanh long đã cho một số hiệu quả nhƣ: kết quả phân lập, kiểm chứng và giám định tác nhân gây hiện tƣợng vàng bẹ thanh long đƣợc khẳng định là do 2 loại nấm Bipolaris crustacean và Fusarium equiseti gây hại (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012). Nấm Bipolaris crustacean có khả năng mọc trên môi trƣờng PDA. Tản nấm ban dầu có màu trắng sau chuyển sang màu xám đen hoặc nâu đen. Sợi nấm có màu nâu, mịn dày, sợi nấm có cấu trúc giống len. Bào tử nấm có 2 đến 3 vách ngăn, cong hoặc uốn gấp, bào tử tách ra hoặc nằm theo nhóm. Tuy nhiên, gần đây tác giả này lại cho rằng tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra trong nghiên cứu xác định tác nhân, đặc điểm hình thái và sinh học của nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014). Nấm Neoscytalidium dimidiatum phát triển khá nhanh trên môi trƣờng PDA sau 3 ngày nuôi cấy, tản nấm có đƣờng kính 90 mm. Tản nấm tròn, ban đầu có màu trắng sau chuyển sang màu xám đen rất nhanh. Sợi nấm có màu nâu đến nâu sậm, mịn, dày. Sợi nấm phân nhánh, có màu nâu, có vách ngăn và tự tách ra thành bào tử đốt. Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: elip, trứng, que, tròn. Bào tử đốt hình thành rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuôi cấy, có màu nâu nhạt đến nâu sẫm, có 1 vách ngăn. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Phan Thị Thu Hiền và ctv (2014) cũng đã cho rằng nấm Neoscytalidium dimiditaum là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long. Đồng thời tác giả còn đã đƣa ra môi trƣờng PDA là môi trƣờng thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của Neoscytalidium dimiditaum với khoảng nhiệt độ thích hợp là 30 – 350 C. Điều kiện pH và ánh sáng không có ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của Neoscytalidium dimiditaum. Không dừng lại ở đó, một số đề
  • 33. Đồ án tốt nghiệp 20 tài còn nghiên cứu biện pháp để trừ bệnh đốm trắng đã cho một số kết quả nhƣ trong tổng số 22 loại thuốc khảo sát ở điều kiện in vitro chỉ có 8 loại thuốc có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển nấm Neoscytalidium dimiditaum là Cyat (Trifloxystrobin), Tilt supper (Propiconazole + Difenoconazole), Map supper (Difenoconazole + Propiconazole), Map Unique (Tebuconazole + Tricyclazole), Sagorain (Difenoconazole + Propiconazole), Viroval (Iprodione), Ridomyl gold (Metalaxyl-M + mancozeb) và Dithan (Mancozeb). Kết quả khảo sát hiệu quả của 20 loại thuốc đối với bệnh đốm trắng trên cành cho thấy Dithan M45 có hiệu quả tốt nhất, kế đến là Riddomyl gold, Saiporra, Vicarben, Map Hero và Viroval. Tƣơng tự, Saipora (Carbendazim + Hexaconazole) cho hiệu quả tốt nhất, làm giảm chỉ số bệnh trên trái dƣới 10%, kế đến là Ridomil gold (Metalaxyl-M + Mancozeb), Dithan (Mancozeb) và Vicarben (Carbendazim) trong đề tài “Đánh giá hiệu quả của một số loại thuốc hóa học đối với bệnh đốm trắng gây hại trên thanh long” (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014). 1.3.2.4. Một số biện pháp phòng trừ bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng có thể xuất hiện ở nơi có độ ẩm cao, nhiệt độ thấp… tùy điều kiện thích hợp mà bệnh phát triển nhanh hay chậm và cũng tùy vào giai đoạn bệnh mà có cách trừ bệnh thích hợp. Tuy nhiên, khi cây đã bị nhiễm bệnh, thƣờng bệnh lây lan rất nhanh. Do đó, khi phát hiện vƣờn thanh long có dấu hiệu nhiễm nấm bệnh bà con nên áp dụng các biện pháp sau đây để khắc phục và tránh lây lan bệnh: Bƣớc 1: - Vệ sinh vƣờn, tạo thông thoáng cho vƣờn: cắt tỉa cành bệnh, trái bệnh, thu gom tập trung lại một chỗ, đào hố, dùng vôi để xử lý. (Không vứt xuống mƣơng, rạch hoặc trong vƣờn vì sẽ tạo điều kiện cho bệnh lây lan nhanh khó trị). - Quản lý chặt nguồn nƣớc: đánh rảnh thoát nƣớc, không cho ứ đọng trên liếp vƣờn. Bƣớc 2:
  • 34. Đồ án tốt nghiệp 21 - Rãi vôi xung quanh gốc để khử mầm bệnh: 400 – 500 kg/ha (không rãi lên cây) - Sau đó, phun các loại thuốc trừ nấm phổ rộng trƣớc khi áp dụng biện pháp sinh học bên dƣới 5 – 7 ngày. Lƣu ý: Trong thời gian cây bị bệnh, hạn chế sử dụng phân hóa học có hàm lƣợng đạm cao và phân gà tƣơi. Bƣớc 3: Sau khi thực hiện bƣớc 2 đƣợc 7 ngày - Bón phân hữu cơ vi sinh TRICHOMIX-DT hoặc phân hữu cơ sinh học TRIMIX-N1 (50 kg/bao, liều bón: 1 – 2 kg/gốc), bón xung quanh gốc và nên ủ cỏ mục, rơm hoặc lấp đất ở gốc để giữ ẩm, bón 2 – 3 lần liên tục cách nhau 15 – 20 ngày. - Phun men vi sinh siêu đậm đặc TRICHOMIX-DT (liều phun 01 gói 500g/100 lít nƣớc/100 trụ) trên khắp tán cây, thân cây và gốc cây, phun liên tục 4 – 5 ngày/lần. Lƣu ý: Nếu vƣờn không bị nhiễm bệnh bà con chỉ áp dụng bƣớc 3. Ngoài ra còn những biện pháp khác nhƣ ông Trần Minh Tiến, Chi cục BVTV Bình Thuận đã đƣa ra một số giải pháp để khắc phục đối với một số vƣờn đang bị bệnh đốm trắng. - Cần vệ sinh sạch cỏ dại, thu gom trái, cành bị hƣ hỏng ra khỏi vƣờn - Phun vệ sinh vƣờn khoảng 2 lần, cách nhau 1 tuần/ lần bằng các loại thuốc BVTV nhƣ Agri-life, Actinovate… - Bón phân chăm sóc gốc thanh long bằng các loại phân Humix, lân phosphoprite… để cây có bộ rễ mới, khỏe. - Giai đoạn từ nụ nhỏ đến nở hoa, quả non, quả chín phải phòng trừ bằng các biện pháp tổng hợp nhƣ quy trình thanh long VietGAP. Lƣu ý: giảm bớt thuốc kích thích sinh trƣởng. - Bên cạnh đó, phun bổ sung thêm các loại phân bón lá. Đồng thời tập trung thâm canh, bón phân cân đối, khai thác vừa phải và không lạm dụng chất kích thích
  • 35. Đồ án tốt nghiệp 22 sinh trƣởng. Đây là những điều kiện cần thiết nhằm giúp cây thanh long đủ sức vƣợt qua các yếu tố biến đổi của thời tiết. Theo Trần Thanh Phong (2013) một biện pháp phòng trừ khác là: - Thoát nƣớc tốt cho vƣờn thanh long. - Thƣờng xuyên thăm vƣờn, kịp thời phát hiện các cành trái bị bệnh để cắt bỏ. Gom các cành trái bị bệnh để tiêu hủy. - Tuyệt đối không đƣợc vứt bỏ cành, trái bị bệnh xuống nƣớc vì sẽ làm bệnh lây lan nhanh. - Hạn chế tƣới nƣớc mƣơng lên tán thanh long, nhất là sau khi trời mƣa. - Không bón phân gà tƣơi hay bột xơ dừa cho vƣờn thanh long. - Sử dụng phân chuồng hoai và nấm đối kháng Trichoderma hoặc phân hữu cơ vi sinh. - Bón phân cân đối giữa đạm, lân, kali. Không bón thừa phân đạm. Tuy nhiên, các biện pháp trên không thể trừ một cách triệt để đƣợc bệnh đốm trắng, nhƣng nếu chúng ta chủ động thực hiện theo những phƣơng pháp trên sẽ giúp giảm thiểu tác hại và sự lây lan của bệnh đốm trắng. 1.4. Giới thiệu về nấm Cochliobolus lunatus 1.4.1. Phân loại (R. R. Nelson và Haasis, 1964) Nấm Cochliobolus lunatus thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Dothideomycetes Phân lớp: Pleosporomycetidae Bộ: Pleosporales Họ: Pleosporaceae Giống: Cochliobolus Loài: C. lunatus
  • 36. Đồ án tốt nghiệp 23 1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa Đặc điểm hình thái: Theo nghiên cứu của R. R. Nelson và Haasis (1964), tản nấm C. lunatus phát triển nhanh chóng trên môi trƣờng thạch đƣờng khoai tây, ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu nâu, nâu đen hoặc đen, tản nấm giống len hoặc lông mƣợt nhƣ nhung và có cấu trúc sắp xếp lỏng lẻo. Sợi nấm chủ yếu mọc trong điều kiện ẩm ƣớt. Bào tử nấm C. lunatus có dạng bào tử đính, có thể đơn nhân hoặc đa nhân nằm riêng lẻ hoặc theo nhóm, thẳng hoặc cuộn xoắn đôi khi quặp. Bào tử có vách ngăn màu nhạt đến màu nâu sẫm; bào tử có chiều dài lên đến 650 µm, rộng 5 – 9 µm. Nấm C. lunatus đƣợc phân biệt với các loài khác ở chỗ bào tử có 3 vách ngăn và 4 tế bào, các tế bào đầu và cuối thƣờng nhạt màu hơn tế bào ở giữa. Đặc điểm sinh hóa: C. lunatus có phân bố rộng rãi nhƣng phần lớn chúng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi có khí hậu ẩm ƣớt thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh. Bào tử và túi bào tử có khả năng phát tán trong không khí. Ngoài ra, chúng cũng có thể tồn tại trong đất. Nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm vào khoảng 24 – 300 C, bào tử sẽ bị chết ở nhiệt độ 590 C trong vòng 1 phút và 550 C trong thời gian 5 phút. Nấm Cochliobolus lunatus có thể tồn tại trong đất ở dạng hạch nấm trong khoảng 2 năm và trong thời gian 3 năm chúng sẽ giải phóng bào tử lên những cây dễ bị tổn thƣơng (R. R. Nelson và Haasis, 1964). 1.4.3. Phổ ký chủ Nấm Cochliobolus lunatus có phạm vi ký chủ rất rộng. Chúng là một tác nhân gây bệnh trên hạt giống làm hạt giống không nảy mầm, làm tàn lụi cây con của những cây khác nhƣ cây mía đƣờng, lúa nƣớc, lúa mì, cây kê. Nó cũng gây tổn thƣơng cho thân, cành lá và hoa trên phạm vi ký chủ rộng lớn (R. R. Nelson và Haasis, 1964). Theo Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), chi Cochliobolus cũng là tác nhân gây bệnh đốm lá, bệnh rỉ sét (thối khô), biến dạng hạt, biến dạng màu (bạc màu) hạt và thậm chí thối rễ.
  • 37. Đồ án tốt nghiệp 24 Nấm C. lunatus còn đƣợc biết đến nhƣ tác nhân gây bệnh vàng lá cây và làm hạt không nảy mầm đối với các cây trồng loại đơn tử diệp nhƣ mía, gạo, kê và ngô. Ngoài ra, chúng còn gây bệnh đốm lá trên các thực vật hạt kín. Theo Bengyella Louis và ctv (2014), nấm C. lunatus là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, chúng phát triển mạnh trên các cây trồng quan trọng nhƣ lúa nƣớc, lúa mì, sắn, dâu tây và khoai tây. Ngoài ra, chúng còn là tác nhân gây bệnh trên các loài cỏ dại trên ruộng lúa. 1.4.4. Cơ chế xâm nhập và gây bệnh Nấm Cochliobolus lunatus phần lớn sản sinh bào tử và phát tán chủ yếu qua không khí, quá trình lây nhiễm vào lá cây khoai tây của nấm Cochliobolus lunatus khá phức tạp (Bengyella Louis và ctv, 2014), cách thức xâm nhiễm nhƣ sau: Cách thức xâm nhập của nấm C. lunatus chủ yếu bằng con đƣờng cơ học. Để xâm nhập đƣợc vào tế bào chủ, bào tử nấm C. lunatus tiếp xúc, bám lên lá cây. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm để xâm nhập vào trong lá. Trong quá trình xâm nhập, nếu pH môi trƣờng không thuận lợi, nấm C. lunatus điều hòa pH của môi trƣờng tạo điều kiện cho nấm xâm nhập vào tế bào chủ. Sau đó, nấm bệnh tiết độc tố melanin (có màu đen) nhằm ức chế và tiêu diệt những tế bào tại vị trí xâm nhập vào cây chủ làm cho vết bệnh sau đó có màu đen và lan rộng. Ngoài ra, melanin còn có khả năng giúp nấm chống lại các tác nhân oxy hóa và quá trình ly giải trong cơ chế bảo vệ của tế bào chủ (Miguel J. Benltrán-García và ctv, 2014). Thời gian ủ bệnh 4 – 5 ngày sau khi nhiễm bệnh và triệu chứng bắt đầu biểu hiện với sự hình thành bào tử của mầm bệnh trên các vết bệnh xảy ra vào ngày thứ 6. Điều kiện ẩm ƣớt trên bề mặt cây chủ trong khoảng 13 giờ là cần thiết cho việc nhiễm bệnh thành công (R. R. Nelson và Haasis, 1964). 1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus 1.4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
  • 38. Đồ án tốt nghiệp 25 Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển và hình thành bào tử của nấm bệnh. Theo Jyothi G và ctv (2013), nấm Cochliobolus lunatus sản sinh bào tử nhiều nhất ở nhiệt độ 250 C. Tuy nhiên, sự sinh trƣởng và phát triển kích thƣớc tản nấm nhanh nhất ở nhiệt độ 300 C, nấm bệnh phát triển chậm lại ở nhiệt độ 150 C và 400 C. Bên cạnh đó theo Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013), nấm C. lunatus có khả năng tăng trƣởng ở nhiệt độ 30 – 400 C. Ở nhiệt độ 45 – 500 C, quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm bị ngừng lại. Một nghiên cứu khác của Gao Ying và ctv (2009) cũng cho rằng nhiệt độ tốt nhất cho các chủng Cochliobolus spp. sinh trƣởng là 25 – 300 C. 1.4.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Đối với những nguồn cacbon khác nhau, sự sinh trƣởng và phát triển của nấm C. lunatus cũng khác nhau. Theo Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013), nấm C. lunatus phát triển tốt nhất trong môi trƣờng có bổ sung đƣờng glucose, sau đó là đƣờng maltose và cuối cùng là đƣờng sucrose. Nhƣng đối với môi trƣờng có bổ sung đƣờng lactose và cellulose, nấm không phát triển. Một nghiên cứu khác của Gao Ying và ctv (2009) cũng cho rằng nguồn cacbon tốt nhất cho sự phát triển của các chủng nấm Cochliobolus spp. là glucose và galactose. 1.4.5.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại Các ion kim loại có ảnh hƣởng đến sự phát triển và các hoạt động phân giải protein của nấm C. lunatus. Yasmeen Faiz Kazi và ctv (2013) cho rằng nấm này có thể sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có bổ sung các muối nhƣ NH4Cl, KH2PO4, K2HPO4, NaCl. Tuy nhiên, đối với muối chứa ion kim loại nhƣ là MgSO4 và CaCl2, nấm không phát triển đƣợc. 1.4.5.4. Ảnh hưởng của pH Yếu tố pH có ảnh hƣởng khá lớn đến sự phát triển của nấm Cochliobolus lunatus. Theo Gao Ying và ctv (2009), pH tốt nhất cho sự sinh trƣởng của nấm Cochliobolus spp. là khoảng pH 6 – 8, càng xa khoảng pH này sự sinh trƣởng và phát triển của nấm bệnh càng giảm.
  • 39. Đồ án tốt nghiệp 26 1.4.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Nguồn nitơ là một trong các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ tăng trƣởng của nấm bệnh. Nguồn nitơ thích hợp cho sự phát triển của chủng nấm Cochliobolus spp. là kali nitrate và glycin (Gao Ying và ctv, 2009). 1.5. Sử dụng nấm Trichoderma spp. trong phòng trừ bệnh đốm trắng 1.5.1. Giới thiệu về nấm đối kháng Trichoderma spp. 1.5.1.1. Đặc điểm phân loại (Lê Thị Huệ, 2010) Trichoderma spp. thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma 1.5.1.2. Nguồn gốc Trichoderma spp. đƣợc tìm thấy ở mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J. Samuels, 2004). Trichoderma spp. rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000). Nhìn chung các loài Trichoderma spp. xuất hiện ở các vùng đất acid nhiều hơn ở vùng đất trung tính và kiềm (Papavizas, 1985). 1.5.1.3. Đặc điểm hình thái nấm (Gary J. Samuels, 2004) Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển nhanh trên môi trƣờng PDA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang màu xanh đậm,
  • 40. Đồ án tốt nghiệp 27 xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trƣờng PDA hóa vàng. Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chƣa đƣợc xác định. Cuống bào tử của một số nấm bệnh xen vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có kích thƣớc từ 1 – 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng nhƣ bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này đƣợc tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động nhƣ chồi mầm. Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trƣng, một số ít có màu trắng (nhƣ T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc hình ovan (với tỉ lệ dài: rộng từ 1 – 1,1 µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài: rộng là hơn 1,4 µm), đa số các bào tử trơn láng, kích thƣớc không quá 5 µm. Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà T. harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trƣờng không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng nên chlamydospores có thể đƣợc dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học. 1.5.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5 và phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ƣu thƣờng là 25 – 300 C. Một vài dòng phát triển tốt ở 350 C. Một số ít phát triển đƣợc ở 400 C (Gary J. Samuels, 2004). Theo Prausun K. M. và Kanthadai R. (1997), hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 350 C chúng tạo
  • 41. Đồ án tốt nghiệp 28 ra những khuẩn lạc rắn dị thƣờng với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thƣờng, ở 370 C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy. Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme nhƣ chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là hai enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chƣa đƣợc biết (Gary J. Samuels, 2004). Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tƣợng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện môi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng nhƣ kiểu hình của cùng một loại Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng nhƣ trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000). 1.5.2. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma (Huỳnh Văn Phục, 2006) Theo Nguyễn Thị Hai (2013), rất nhiều nghiên cứu về vi sinh vật đã cho thấy nấm Trichoderma là một trong những nhóm đứng đầu của vi sinh vật trong đất có tính đối kháng và đƣợc nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Việc nghiên cứu tính đối kháng, đặc biệt là tính chọn lọc của những chất đặc trƣng do nấm Trichoderma tiết ra đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm và tiến hành nghiên cứu nhằm giải thích cơ chế tác động của nhóm nấm này đối với các vật gây bệnh cho cây trồng và sử dụng chúng trong phòng chống bệnh hại cây trồng. Đối với Okigbo và Ikediugw (2000), hai nhà khoa học này cho biết những loài Trichoderma spp. có hệ sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh học chống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch.
  • 42. Đồ án tốt nghiệp 29 Nấm Trichoderma spp. tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Klein và Eveleigh, 1998). Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra bao gồm glucan 1,3 – beta – glucosidase, endochitinase, chitobiosidase, N – acetyl – beta – D – glucosaminidase (NAGase), trypsin, chymotrypsin, cellulose, protease, lipase, khi kết hợp hai enzyme glucan 1,3 – beta – glucosidase và endochitinase sẽ ngăn đƣợc quá trình tăng trƣởng của nhiều loại Ascomycetes trong nuôi cấy, thêm vào đó sẽ có hiệu quả cao trong việc ngăn cản sự nảy mầm của bào tử hơn là từng loại enzyme đơn lẻ (Margolles và Clark, 1995). Hầu hết các tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc biết là sản xuất enzyme chitinase và β – 1,3 – glucanase có thể làm rã thành tế bào dẫn đến ly giải sợi nấm của mầm bệnh (Esposito .E, Silva .D.M, 1998). Phát hiện thấy hoạt động của các enzym - chitinase và β - 1,3 glucanase trong Trichoderma spp. mạnh hơn khi ủ với tế bào mầm bệnh. Sản xuất β - 1,3 glucanase cũng đã đƣợc báo cáo là một enzyme quan trọng trong kiểm soát sinh học của tác nhân gây bệnh vì β - 1,3 glucan là một thành phần cấu trúc của màng tế bào nấm (Denis, C và Webster, 1971). Đối với cơ chế đối kháng nấm bệnh của nấm Trichoderma, các nhà khoa học đƣa ra những cơ chế khác nhau nhƣng nhìn chung thì nấm Trichoderma kiểm soát sinh học thông qua 3 cơ chế chính: a. Tiết kháng sinh T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của các loài Rhizoctinia solani và Pythium spp. Isonitriles đƣợc sản xuất bởi T. hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở một vài loài T. atroviride và T. viride tiết 6 – pentyl alpha – pyrone (α – pyrone) có hƣơng dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy mầm của những noãn bào tử nấm bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của Botrytis cinnerea.
  • 43. Đồ án tốt nghiệp 30 Peptaibols do T. polysporum, T. harzianum, T. koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. T. virens, T. koningii, T. viride sản xuất sesquiterpenes và polyketides đƣợc T. harzianum sản xuất. Steroids (viridian) là một độc tố thực vật có hiệu lực nhƣ một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, đƣợc sản xuất bởi T. virens. b. Ký sinh Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hƣớng hóa chất, nó ký sinh phân nhánh hƣớng về những nấm đã đƣợc định trƣớc (do những nấm này tiết ra các hóa chất). Ngoài ra, vật ký sinh và vật đối kháng đƣợc Trichoderma nhận dạng qua trung gian là lectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời, Trichoderma ký sinh và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease những enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. Không những thế, Trichoderma còn có khả năng tiết những enzyme phân giải nhƣ chitinase, glucanase, protease giúp bào mòn thành tế bào sau khi ký sinh và cuộn quanh nấm gây bệnh đối kháng với nó. Khi ký sinh vào cây T. asperellum tiết cellulose, cho phép nó tấn công vào những nấm nhƣ Phytophthora spp. và Pythium spp. khi chúng bám vào cây trồng.
  • 44. Đồ án tốt nghiệp 31 Hình 1.2. Hình ký sinh của nấm Trichoderma (a. Trichoderma ký sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở các cây họ đậu. (Trichoderma nhuộm màu; Pythium nhuộm màu xanh), b. Nấm Trichoderma sp. quấn lấy sợi nấm gây bệnh (Tô Duy Khƣơng, 2007)). c. Cạnh tranh (Nguyễn Ngọc Phúc, 2005) Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đƣa ra khái niệm cạnh tranh khai thác và cạnh tranh cản trở vào tƣơng tác giữa quần thể nấm. Sự cạnh tranh cản trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật khác tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tƣơng tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác loài. Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 loài cùng khai thác một nguồn lợi nhƣng khác nhau về tốc độ và hiệu quả khai thác. Trong trƣờng hợp nguồn lợi là nguồn dinh dƣỡng đƣợc xem nhƣ cạnh tranh dinh dƣỡng. - Sự cạnh tranh cho mô hoại sinh Botrytis và Sclerotinia spp. là mầm bệnh cơ hội tấn công vào mô thực vật lão hóa hoặc chết coi đó nhƣ nguồn dinh dƣỡng, từ đây tiếp tục tấn công vào những mô khỏe mạnh. Khi đã xử lý Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm chậm sự hình thành khuẩn lạc của Botrytis vào mô thực vật. Sau đó làm giảm mức độ bệnh trên cây. Trichoderma đã đƣợc ứng dụng thành công trong kiểm soát Botrytis và Sclerotinia trên những loại rau cải, trái cây khác nhau: dâu, dƣa chuột… - Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt Bệnh chết nhát (Damping - off) gây bởi Pythium ultimum ở một số loại ngũ cốc và rau quả đƣợc xuất phát bởi sự đáp ứng nhanh chóng của mầm bệnh đối với dịch rỉ từ a b
  • 45. Đồ án tốt nghiệp 32 hạt. Túi bào tử của Pythium nảy mầm và xâm nhiễm vào hạt giống trong vòng vài giờ khi Pythium đã tràn lan trong đất. Xử lý hạt giống với Trichoderma làm giảm sút sự nảy mầm của túi bào tử Pythium, hiện tƣợng này đƣợc cho là sự cạnh tranh chất kích thích nảy mầm. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng cũng đƣợc xem nhƣ cơ chế hữu hiệu nhất sử dụng bởi T. harzianum T-35 trong sự kiểm soát Fusarium oxysporum trong vùng rễ cây bông vải và dƣa hấu. - Sự cạnh tranh trên vị trí vết thƣơng Một trong những thí nghiệm thành công đầu tiên của sự kiểm soát sinh học trên vết thƣơng gây do cắt xén là sử dụng T. viride, áp dụng trong phun xịt hoặc dùng kéo lớn cắt, để kiểm soát mầm bệnh gây bạc lá (Chondrostoreum purpureum). Thể Trichoderma đƣa vào đƣợc chứng minh có khả năng mọc sợi nấm trên cây vừa bị cắt và ngăn ngừa sự xâm nhiễm của mầm bệnh ở rễ (Amillaria luteobubalina). Sự thối thân thƣờng theo cùng sự xâm nhiễm Botrytis vào vết thƣơng bị cắt trên cây cà chua trong nhà kính; căn bệnh này rất khó kiểm soát bởi những biện pháp canh tác. Thể Trichoderma đƣợc chứng minh có khả năng kiểm soát sự thối thân khi tiêm chủng trƣớc hay cùng lúc với Botrytis, nhƣng không có hiệu quả kiểm soát nếu đƣợc tiêm sau, nhƣ vậy có thể cho rằng sự cạnh tranh mọc sợi nấm trên vết thƣơng là yếu tố xác định sự giảm bệnh. Trong một nghiên cứu sự xâm nhiễm của Pythium vào rễ dƣa chuột đã chỉ ra rằng mặc dù không có sự hình thành sợi nấm của chủng T. harzianum T3 trên toàn bộ rễ nhƣng vẫn có sự hình thành sợi nấm tại vết thƣơng. Sự cạnh tranh dinh dƣỡng từ dịch rỉ vết thƣơng của thể cạnh tranh là nguyên nhân giảm sự xâm nhiễm của Pythium. Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết những dƣỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores).
  • 46. Đồ án tốt nghiệp 33 Trong hoạt động sống ký sinh của nấm Trichoderma spp. thì enzyme thủy phân chitinase và β – glucanase đóng vai trò rất quan trọng (Crus và ctv, 1995). Nấm Trichoderma harzianum có khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào nhƣ chitinase, β – 1,3 – glucanase đây là hai enzyme quan trọng trong quá trình ký sinh lên nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003). Khả năng tiết enzyme của Trichoderma spp. chịu ảnh hƣởng của độ yếm khí, lƣợng oxy hòa tan, tốc độ lắc (Marco và ctv, 2002). Một vấn đề quan trọng trong sự hình thành cơ chế đối kháng đƣợc trình bày ở nhiều báo cáo là tùy thuộc vào dòng vi sinh vật đối kháng, nguồn gốc của chúng và điều kiện môi trƣờng, vì thế khi chọn một tác nhân sinh học nên quan tâm đến hƣớng áp dụng, nguồn gốc của mầm bệnh (Kubicek và Harman, 1998).
  • 47. Đồ án tốt nghiệp 34 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh, Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 07/04/2014 đến ngày 31/07/2014. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguyên liệu 2.2.1.1. Trái và cành thanh long Trái và cành thanh long bị bệnh đƣợc thu từ huyện Châu Thành, tỉnh Long An. Cành thanh long sạch bệnh đƣợc thu từ huyện Châu Thành, tỉnh Long An. Hình 2.1. Cành thanh long bị bệnh đốm trắng (Nguyễn Thành Hiếu và ctv)
  • 48. Đồ án tốt nghiệp 35 2.2.1.2. Chủng nấm mốc Chủng nấm mốc Trichoderma đƣợc cung cấp, do bạn Nguyễn Thái Minh Hiếu phân lập từ nấm linh chi, sinh viên Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2.2. Hóa chất - D – Glucose (Trung Quốc) - Agar (Việt Nam) - Tween 80 (Trung Quốc) - Kháng khuẩn Chloramphenycol - Urê (Trung Quốc) - KNO3 (Trung Quốc) - (NH4)2SO4 (Trung Quốc) - NaCl (Trung Quốc) 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ - Erlen 250ml - Bình môi trƣờng 250ml, 500ml - Ống đong 100ml, 250ml - Cốc 100ml, 250ml,1000ml, 2000ml - Pipet 1ml, 10ml - Ống nghiệm - Que cấy - Bình tia - Đũa thủy tinh 2.2.3.2. Thiết bị - Cân phân tích (Satorius, Đức) - Cân kỹ thuật (Shimadzu, Nhật)
  • 49. Đồ án tốt nghiệp 36 - Bếp từ - Nồi hấp Autoclave - Tủ hút Các dụng cụ, thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm... 2.2.3.3. Môi trường nuôi cấy a. Môi trƣờng WA (Water Agar) Thành phần môi trƣờng: - Nƣớc cất: 1000 ml - Agar: 20 g/l - Thuốc kháng khuẩn Chloramphenycol: 0,25 g/l Cách nấu: Cho agar và thuốc kháng khuẩn vào nƣớc cất đun sôi, đem hấp khử trùng ở 1210 C trong 20 phút. Sau khi hấp khử trùng xong, để môi trƣờng hạ xuống nhiệt độ 600 C, đem đổ môi trƣờng. Môi trƣờng WA là môi trƣờng phổ biến để phân lập nấm bệnh. b. Môi trƣờng PDA (Potato D – Glucose Agar) Thành phần môi trƣờng: - Khoai tây: 200 g - Đƣờng D – Glucose: 20 g - Agar: 20 g - Nƣớc cất: 1000 ml Cách nấu: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt hạt lựu, cân đủ 200 g cho nƣớc cất vào đun sôi khoảng 20 phút kể từ khi bắt đầu sôi. Lọc bỏ phần bã, đun sôi trở lại, tiếp theo cho lần lƣợt đƣờng và agar vào (Lƣu ý vừa cho vừa khuấy đều để tránh bị vón cục). Cho vào bình môi trƣờng, đem hấp khử trùng ở nhiệt 1210 C trong 20 phút.
  • 50. Đồ án tốt nghiệp 37 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 2.3.1. Phương pháp vi sinh 2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh a. Phƣơng pháp nhận dạng và thu thập mẫu (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Bệnh đốm trắng trên thanh long xuất hiện trên bẹ hoặc trái ban đầu là những chấm nhỏ li ti nhƣ kim, phát triển thành những đốm nhỏ màu trắng, vết bệnh trũn thấp so với bẹ, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên vết ghẻ màu nâu và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng. Chọn mẫu ở giai đoạn khi là những chấm nhỏ li ti, đốm nhỏ màu trắng để phân lập tác nhân gây bệnh. b. Phƣơng pháp phân lập nấm bệnh (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Mục đích: nhằm phân lập đƣợc nấm trên mô bệnh Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Cành thanh long bị bệnh lạ cần phân lập. - Đĩa petri vô trùng có chứa môi trƣờng nuôi cấy WA (2%). Các bƣớc phân lập nấm bệnh từ mô cây bệnh nhƣ sau: - Rửa mẫu bệnh dƣới nƣớc máy để loại bỏ đất và bụi bẩn. - Dùng cồn ethanol 70% lau sạch bụi bẩn xung quanh vết bệnh. - Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm, cho vào cồn ethanol 96% trong 5 giây, rửa lại bằng nƣớc cất, vớt ra để lên giấy thấm nƣớc sau đó đặt lên môi trƣờng agar - nƣớc cất. Đặt đĩa petri ở nhiệt độ phòng thí nghiệm cho nấm phát triển. c. Phƣơng pháp cấy truyền (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009)
  • 51. Đồ án tốt nghiệp 38 Mục đích của giai đoạn này là giúp xác định vi sinh vật nào đã đƣợc phân lập. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Đĩa nấm bệnh đã nuôi cấy trên môi trƣờng WA (2%). - Đĩa petri vô trùng có chứa môi trƣờng PDA. Quy trình cấy truyền - Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày dƣới kính lúp soi nổi và đánh giá sự phát triển của sợi nấm từ các miếng cấy. - Xác định xem có nhiều hơn một loại nấm mọc lên hay không. - Cấy truyền khi sợi nấm mọc đƣợc khoảng 5 mm từ miếng cấy. - Cắt một miếng thạch nhỏ (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi trƣờng PDA Sau khi cấy truyền các mẫu nấm có trong mẫu cấy ban đầu, ta tiến hành làm thuần các mẫu nấm từ các mẫu nấm cấy truyền. d. Phƣơng pháp làm thuần (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009) Mục đích của phƣơng pháp này là đảm bảo nấm đƣợc cấy hoàn toàn thuần Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị: - Đĩa nấm bệnh đã đƣợc cấy truyền trên môi trƣờng PDA. - Đĩa petri vô trùng có chứa sẵn môi trƣờng PDA. Cách thực hiện Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, lấy một miếng thạch nhỏ chứa phần đỉnh của một sợi nấm duy nhất trên đĩa nấm đã cấy truyền cấy sang đĩa môi trƣờng PDA. Kí hiệu tên mẫu cấy, ngày cấy. e. Phƣơng pháp làm phòng ẩm (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009; Phạm Minh Nhựt, 2010)