Manualbiok

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FORMACIÓN BÁSICA
DISCIPLINARIA
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I

MANUAL DE LABORATORIO
SEMESTRE ENERO – JUNIO 2011
ALUMNO: Grupo: 2CM

PROFESORES
TITULAR:
LABORATORIO:
LABORATORIO:
LABORATORIO:

PRÁCTICA AUTORIZACIÓN

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Laboratorio de Bioquímica Médica 1 1


INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FORMACIÓN
BÁSICA DISCIPLINARIA
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I

TITULARES DE GRUPO
JUAN GUILLERMO ORDORICA VARGAS
FRANCISCO JAVIER CASTAÑEDA IBARRA
MIGUEL ANGEL ORDORICA VARGAS
FELICIANO TAMAY CACH
JOSÉ GUADALUPE TRUJILLO FERRARA
ALFREDO MONTIEL MÁRQUEZ
MARTHA CECILIA ROSALES HERNÁNDEZ
ARTURO DÍAZ MARTÍNEZ
MARÍA DE LA LUZ VELÁZQUEZ MONROY
SANDRA GISSELA MÁRQUEZ RAMÍREZ
REYNA ELIZABETH BARBOSA CABRERA
JESSICA ELENA MENDIETA WEJEBE
IO STEPHANIE ZAMUDIO VEGA
LETICIA ARACELI RAMÍREZ DURÁN
EUNICE DALET FARFÁN GARCÍA
LUZ MARÍA CHIRINO CASTILLO
MARÍA DEL ROSARIO LEÓN REYES
LABORATORIO
CLAUDIA CAMELIA CALZADA MENDOZA
ERÉNDIRA YADIRA CARRERA GARCÍA
SANDRA CASELÍN CASTRO
CRISTINA LOPEZ GLORIA
ARGENTINA HERNANDEZ RAMOS
MARIA TERESA LÓPEZ VENEGAS
ARTURO RAMIREZ CRUZ
ANAYETZIN TORRES RIVERA

Auxiliares de Laboratorio:
José Luis Martínez Vásquez
Alex Hernández Aguilar
Julio César Aguilar Rentería

Manual Versión Enero de 2011
Editado por:
Dra. Luz María Chirino Castillo
y Dr. Arturo Díaz Martínez


ÍNDICE

No. TEMA Página:

1 INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO 4
2 SOLUCIONES 9
3 ELECTROLITOS Y pH 16
4 SOLUCIONES REGULADORAS 19
5 PROTEÍNAS 24
6 CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS 32
7 CINÉTICA ENZIMÁTICA 40
8 GLÚCIDOS 46
9 OXIDACIONES BIOLÓGICAS 52
10 LÍPIDOS 58
11 ÁCIDOS NUCLEICOS 62



1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO
DE BIOQUÍMICA MÉDICA I

S
e revisan conceptos y procedimientos de importancia para el trabajo en el
laboratorio. El alumno deberá previamente haber leído, entendido,
comprendido, estar de acuerdo con, y sujetarse al Reglamento de la
Academia de Bioquímica.

• Las actividades de laboratorio constituyen una parte importante del aprendizaje
de la bioquímica médica y complementan las actividades de la materia
impartidas en el aula.
• Es obligación del alumno la asistencia puntual, así como la participación activa,
la recolección de resultados de los experimentos y la entrega de reportes de los
mismos.
• Es de la mayor importancia cumplir meticulosamente con las medidas de
seguridad tanto en comportamiento, uniforme y accesorios como guantes,
anteojos de protección o caretas transparentes, cubre bocas, bata larga, y otros
como pre pipetas.

DISTRIBUCIÓN DE LOS ALUMNOS
EJERCICIO 1
Antes de entrar al laboratorio, todos los alumnos deberán portar, debidamente
abotonada, su bata de laboratorio y tener listo su material de trabajo.
a)Cuando el profesor lo indique, los alumnos colocarán su mochila en el lugar
que les sea asignado.
b)Siguiendo las instrucciones de su profesor, localice su mesa de trabajo e
inmediatamente diríjase a ella.
c)En su mesa, localice las tomas de corriente, desagües, tuberías y sitios
donde puede trabajar.
d)Ubique la posición de su mesa de trabajo con respecto de la mesa de la
campana, instalaciones de seguridad, extintores, zonas de seguridad y rutas de
evacuación.
e)Con base en la explicación recibida, identifique el uso de cada una de las
tuberías que encuentre en su mesa de trabajo y márquelas con masking tape.
Espere a que su profesor confirme que su etiquetado es correcto.
f)Localice la posición de las válvulas de seguridad de cada tubería.

1.Dibuje un esquema de su mesa señalando la posición de las tomas de
corriente, desagües y válvulas de flujo.
2.Dibuje un esquema simple del laboratorio e indique en él las zonas de
seguridad, la posición del equipo de seguridad y marque la ruta de evacuación desde
su mesa.
3.En el esquema de la mesa de trabajo que elaboró en el ejercicio anterior,
marque la posición de las válvulas de seguridad.


EL VALE DE MATERIAL DE LABORATORIO
EJERCICIO 2
a)Localice en la charola de material de laboratorio el vale, el cual es un
documento que enlista el material que se le confía para la realización de cada
práctica. De acuerdo con esta lista identifique y revise cuidadosamente cada una de
las piezas, indicando en el vale cualquier defecto que encuentre.
b)Rotule cada pieza identificada con una etiqueta de masking tape. Reúna en la
charola el material de nombre y/o empleo desconocidos, o de cuyo estado tenga
duda, y pregunte a su profesor. Espere a que su profesor compruebe que su
identificación del material es correcta.
c)Una vez revisado todo el material, complete los datos solicitados en el vale,
(fecha, grupo, equipo, responsable, etc.) y entréguelo al personal técnico de
laboratorio.

1.¿Cuál es el uso de cada una de las siguientes piezas de material de
laboratorio?

Pipeta Mortero
Bureta Tubo de ensayo
Probeta

MANEJO DEL MECHERO FISHER
EJERCICIO 3
a)No encienda el mechero hasta que su profesor se lo indique.
b)Si es necesario, conecte el tubo de plástico del mechero a la llave de gas, la
que deberá estar completamente cerrada, con la manija en posición transversal
respecto de la salida del gas. Recuerde que la tubería de gas es de color amarillo.
c)Asegúrese que el tornillo de control de flujo de gas esté abierto más o menos
a la mitad de su capacidad total. El flujo de gas se disminuye girando el tornillo en el
sentido de las manecillas del reloj y se aumenta en sentido contrario.
d)Encienda el mechero aproximando la flama de un cerillo o encendedor al
borde de la parte superior del mechero inmediatamente después de abrir la llave de
gas, lo cual debe hacerse lentamente, avanzándola hasta que esté aproximadamente
a 45 grados con el tubo del gas. Tenga cuidado de no acercar su rostro, pelo u
objetos inflamables al mechero al momento de encenderlo ni cuando esté
encendido. Al usar el mechero no deberá portar guantes clínicos hechos de
látex o polietileno, tenga cuidado, ya que son inflamables.
e)Ajuste la cantidad de aire que entra, usando el arillo de control de flujo de
aire, hasta que la flama tenga una zona central de color azul claro rodeada de otra de
color azul oscuro o violeta. La parte más caliente se encuentra en la punta de la zona
interna. Cuando la combustión es incompleta, por falta de oxigeno, la flama tiene
color amarillo.
f)Deje el mechero encendido para usarlo en el ejercicio siguiente.



1) Elabore un esquema del mechero de FISHER, en el que se indique la posición
del tornillo de control de flujo de gas, el arillo de control de flujo del aire y la
entrada del gas.

COMO CALENTAR UN LÍQUIDO EN UN TUBO DE ENSAYO

EJERCICIO 4

a)Todos los miembros del equipo deben usar los anteojos de
protección.
b)Llene el tubo de ensayo hasta un 20% de su capacidad con agua de la llave y
sujételo con las pinzas para tubo de ensayo.
c)En caso necesario quitarse los guantes de látex antes de iniciar el
calentamiento
d)Coloque el tubo sobre la flama del mechero, inclinado aproximadamente a 70
grados y cuidando que la flama caliente la parte superior del líquido. Nunca caliente
un tubo de ensayo en el fondo o en posición vertical porque se puede
proyectar su contenido.
e)Mueva el tubo cuidadosamente, sin sacarlo de la flama, para que el líquido se
caliente de manera uniforme
f)Durante el calentamiento dirija la boca del tubo hacia un lugar en que
no se encuentre ninguna persona o material que se pueda dañar.
g)Jamás mire directamente la boca de un tubo de ensayo que se está
calentando, aunque esté fuera de la flama del mechero.
h)Continúe el calentamiento hasta lograr que el agua hierva, sin proyectarse.
i)Nunca caliente solventes orgánicos en tubo de ensayo directamente
en la flama del mechero. Hágalo siempre en baño maría.

1.Elabore un esquema de la forma correcta de calentar un líquido en un tubo de
ensayo.

MANEJO DE REACTIVOS LÍQUIDOS
EJERCICIO 5a
a)Para manejar con seguridad los reactivos líquidos se usa siempre la pre
pipeta.
b)Después de abrir un frasco de reactivo, coloque el tapón sobre la mesa en
posición invertida, para evitar contaminación.
c)Para extraer el líquido utilice una pipeta o un gotero limpios. Nunca vierta
reactivos directamente del frasco para evitar escurrimiento.
d)Usando la pipeta de 10 mL, transfiera 5 mL de agua de un vaso de
precipitados a un tubo de ensayo. Repita la maniobra hasta que pueda realizarla con
seguridad.

1)Describa la forma como ensambló su pre pipeta.
EJERCICIO 5b


a)Prepare una serie de 4 tubos de ensayo. Numere los tubos del 1 al 4.
Coloque en el tubo número uno 2.5 mL de agua. En el tubo número dos, 1.25 mL de
agua. En tanto que en el tubo número tres deposite 0.8 mL de agua y en el tubo
número cuatro, deposite 0.6 mL de agua.
b)Utilice para cada tubo de ensayo una pipeta de capacidad adecuada. Repita
este ejercicio hasta que pueda realizarlo con seguridad y precisión.
1.Elabore un esquema que describa este experimento.

EJERCICIO 5c
a)Monte el dispositivo de titulación según indicaciones de su profesor y
aprenda a manejar con soltura y seguridad la llave de su bureta. Familiarícese con el
procedimiento de dejar gotear el líquido de la bureta, en este caso agua, o dejar salir
de la misma cantidades fijas como por ejemplo, de un mL cada vez, de 5 mL cada
vez, etc. Asimismo, deberá aprender a leer con precisión la escala de la bureta.

1.Elabore un esquema del dispositivo de titulación.

MANEJO DE REACTIVOS SÓLIDOS

EJERCICIO 6
a)Prepare una charola de papel usando una hoja de papel limpio, de preferencia
encerado. Esta charola se prepara doblando el papel aproximadamente a un
centímetro de cada borde y colocándolos en ángulo recto para formar una pared en la
periferia del papel. El tamaño de la charola depende de la cantidad de reactivo a
pesar.
b)Encienda la balanza y espere a que se estabilice la lectura. Coloque la charola
de papel en el plato de la balanza. Cuando se estabilice, por medio del botón de
tarar, tare a cero la balanza.
c)Abra el recipiente del reactivo y coloque la tapa sobre la mesa, boca arriba,
para evitar la contaminación.
d)Por medio de espátula saque el reactivo del recipiente y colóquelo sobre la
charola de papel. Si se rebasa la cantidad deseada, regrese el exceso de reactivo al
respectivo recipiente usando la espátula. Nunca regrese al recipiente original un
reactivo que caiga fuera de la charola de papel o sobre la mesa.
e)Pese la cantidad de cloruro de sodio que le indique su profesor y colóquela
en el sobre de papel que se le proporciona. Escriba en el sobre el nombre y la
cantidad de reactivo que contiene.
f)Cierre inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate o
contamine. Asegúrese de que la mesa y la balanza queden limpias.

1) Elabore un diagrama de la balanza, señalando la posición del botón de
encendido y apagado y del botón de tara.

TARAR TUBOS PARA CENTRIFUGAR
EJERCICIO 7
a)En este ejercicio se usará la balanza de dos platillos.


b)Coloque las pesas de medición en la posición de cero. Asegúrese de que la
aguja o fiel de la balanza esté en posición cero. Si no lo está, gire cuidadosamente las
pesas de ajuste en el sentido que sea necesario hasta lograr el equilibrio.
c)Coloque un frasco gerber en cada platillo, cuidando que el más pesado quede
del lado izquierdo.
d)Deslice las pesas de medición de la balanza hasta lograr que el fiel vuelva a
la posición de equilibrio.
e)Coloque en cada frasco una camisa de la centrífuga con un tubo adecuado
para centrifugar dentro.
f)Usando una pipeta, añada agua de la llave entre la camisa y el tubo más ligero
hasta lograr que el fiel de la balanza regrese al equilibrio.

1) Elabore un esquema de la balanza de platillo señalando la posición de las
pesas de ajuste y las de medición.



2. SOLUCIONES

U
na solución es un sistema homogéneo monofásico, formado por dos o más
sustancias químicas y presenta las mismas propiedades fisicoquímicas en todas
sus partes. Está formada por un solvente (líquido) en el cual se dispersan
molecularmente uno mas solutos (sólidos). Cuando ambos son líquidos miscibles, se
acostumbra nombrar solvente al que se encuentra en mayor cantidad.
La relación que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una solución
se llama concentración. Para explicar concentración necesitamos la definición de
mol.
Un mol se define como el peso molecular en gramos de una sustancia, o sea la
masa de una sustancia que contiene el mismo número de átomos o moléculas que
hay en 12 g de 12C. (6.022 x 1023 o Número de Avogadro). La masa molecular o
peso molecular (PM) de una sustancia es la suma de los pesos atómicos de sus
componentes; por ejemplo: PM del ácido sulfúrico (H2SO4): 98 g/mol.
Con un mol podemos preparar una solución 1 molar (1M) la cual contiene un
mol de soluto en un litro de solución.
Si dividimos los gramos de un mol entre la valencia del compuesto, y diluimos hasta
aforar a un litro tendremos una solución 1 normal (1N).
Existen varias formas de expresar la concentración de una solución. Las de uso
más frecuente son:
• MOLARIDAD (M). Número de moles de soluto en un litro de solución. Un mol
es el peso molecular expresado en gramos.
• MOLALIDAD (m). Número de moles de soluto en 1000 g de solvente.
• NORMALIDAD (N). Número de equivalentes químicos de soluto en un litro
de solución.
• FRACCIÓN MOLAR (Xi). Número de moles de una sustancia en una solución
entre la suma de los moles de todos los componentes de la misma.

PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solución. Existen
diferentes tipos:
• Porciento en peso (% p/p). Número de gramos de soluto en 100g de
solución.
• Porciento en volumen (% v/v). Número de mililitros de soluto en 100 mL
de solución.
• Porciento en peso-volumen (% p/v). Número de gramos de soluto en 100
mL de solución.

PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES
Se pueden dividir en tres categorías: Constitutivas, Aditivas y Coligativas.
Constitutivas:
• Dependen de la constitución química de sus moléculas, como la presencia de grupos
funcionales, tipo y disposición de los átomos, etc.
• Son propiedades constitutivas el carácter ácido, básico, oxidante, reductor, radioactivo,
dulce, insípido, colorido, etc.


Aditivas:
• Dependen de la suma de las propiedades correspondientes a los constituyentes de la
solución.
• como la concentración, densidad, viscosidad.
Coligativas:
• Dependen del número de partículas por unidad de volumen.
• Son muy importantes para los procesos biológicos e incluyen:
a) Elevación del punto de ebullición
b) descenso de la presión de vapor y/o del punto de congelación
c) presión osmótica
d) así como las constantes crioscópica, y ebulloscópica, etc.

DIFUSIÓN, ÓSMOSIS, DIÁLISIS.

Difusión es el proceso físico químico por el cual las moléculas, ya sea en estado
de gas o líquido, tienden a distribuirse uniformemente por todo el espacio de que
disponen formando un medio homogéneo.
En el caso de los gases, la difusión está sujeta a la “Ley General de la
Energía”, la cual establece que la velocidad con que se mueve una partícula es
inversamente proporcional a la raíz cuadrada de su masa.
Las propiedades dinámicas de las soluciones son:
• Difusión Simple
• y Difusión a través de membranas (Ósmosis y Diálisis).

En los líquidos la velocidad de difusión es afectada por varios factores. Entre ellos
tenemos:

a)Naturaleza de la sustancia que difunde b) Área de difusión

c)Tamaño y concentración de las partículas d) Temperatura

Graham hizo notar estos factores que influyen sobre la difusión y Fick, de
acuerdo con los mismos estableció la siguiente relación:

dm dc
v = ---- = KQ ----
dt ds

v = velocidad de difusión K = Constante de Difusión dm = cantidad de sustancia que difunde dt =
tiempo que tarda en efectuarse la difusión dc = concentración de la sustancia que difunde ds =
espacio que recorre la sustancia al difundir.

Así, la velocidad de difusión es directamente proporcional al gradiente de
concentración y al área de sección. A temperatura, gradiente de concentración y
área constantes, cada sustancia tiene una velocidad de difusión característica con



relación al peso molecular por lo que se incluye una constante K llamada
constante de difusión.
DIFUSIÓN SIMPLE (En líquidos)
EXPERIMENTO 1
Llene casi completamente una probeta de 100 mL con agua de la llave y luego
espolvoree, con un aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno sobre
la superficie del agua y observe que ocurre. Anote sus observaciones.
A continuación caliente ligeramente la probeta en cualquier punto y nuevamente
observe que ocurre al agregar calor. Anote sus observaciones. Una vez
homogeneizado el colorante, la difusión se ha efectuado.

1)¿Es uniforme el descenso del colorante por la columna de agua?
2)¿Qué sucede si se calienta ligeramente un punto de la probeta?
3)¿Qué es disolución, convección y difusión?

DIFUSIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANAS

Cuando se interpone en el sistema una membrana dialítica, permeable al agua y
a solutos cristaloides pero no a coloides, la sustancia sigue difundiendo como si la
membrana no existiera dependiendo de los factores ya señalados, pero la naturaleza
de la membrana será un factor adicional. En estos casos, K recibe el nombre de
constante de permeabilidad. Esta difusión es inversamente proporcional a su peso
molecular.
ÓSMOSIS Y PRESIÓN OSMÓTICA

Si dos soluciones de diferente concentración están separadas por una
membrana semipermeable, el solvente de la solución menos concentrada difunde a la
de mayor concentración. Esto se explica termodinámicamente porque la solución
diluida tiene una tendencia de escape o presión de vapor muy grande. Esta tendencia
de escape o presión de vapor es muy baja cuando la solución está concentrada. Este
fenómeno es conocido como ósmosis y ejerce una presión osmótica, propiedad
coligativa de gran importancia fisiológica ya que interviene en la regulación del
volumen de sangre circulante, así como en la formación o eliminación de edemas
tisulares, y es la razón por la cual el paciente diabético elimina frecuentemente
grandes cantidades de orina (poliuria). Esta última está ocasionada por la alta
concentración de glucosa en sangre y forma parte de la triada sintomática clásica
del diabético: Polifagia, Polidipsia y Poliuria.

MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
MÉTODO DIRECTO
EXPERIMENTO 2
Esta medición se lleva a cabo mediante el dispositivo llamado OSMÓMETRO. Este
requiere de una membrana semipermeable y aunque las que más se acercan a la
perfección son las de ferrocianuro de cobre y las de pergamino, por ser más fácil de
conseguir, se utilizará una membrana dialítica de colodión (celulosa) que nos dará
una medida aproximada de la presión osmótica.


El osmómetro consiste en un compartimiento que contiene una solución de
sacarosa 1M teñida con rojo neutro y el cual es el cuerpo de una jeringa
hipodérmica de 5 mL de capacidad y la cual presenta una banda de hule inferior que
permite la fijación de una membrana de celofán, humedecida previamente durante 5
a 10 minutos. Mientras que la banda superior sirve para sellar el orificio de llenado de
la cámara. Por la parte correspondiente al pivote, se le agrega el trocar metálico de
un catéter el cual se introduce en el extremo de un capilar de polietileno. El extremo
de esta cámara se sumerge en un vaso de precipitados con agua.
• Una vez hecho esto se marca el nivel de la sacarosa en el tubo capilar,
• leyendo cada 15 minutos el nivel ascendido hasta que se detenga el proceso.
• Anote sus resultados en la tabla.
Nota: cualquier error en el montaje del osmómetro se manifestará por salida de
solución coloreada del dispositivo.

Tiempo Altura
min. mm
15

30

45

60

75

90

105

120

1)Grafique tiempo en las abscisas (eje x) y altura en milímetros en las
ordenadas (eje y).

CÁLCULO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA



La columna de sacarosa ejercerá finalmente una presión que se opone al paso
del agua (Presión Hidrostática). Calculando ésta, se puede conocer la presión
osmótica ya que ambas son iguales.
Esto se hace mediante la fórmula: π = hρ g
π = presión osmótica
h = altura a la que asciende la solución de sacarosa (en metros)
ρ = densidad de la solución de sacarosa (1.088 g/mL), (convertirla a kg/m3)
g = aceleración debida a la gravedad (9.81 m/s2)
Efectuando esta operación encontramos la presión osmótica en Pascales. Para
obtener atmósferas usamos la siguiente equivalencia:
1Pa
1Atm = ---------------
1.013 x 105

1)¿Cuándo deberá detenerse el proceso osmótico?
2)¿Depende sólo de la altura la presión osmótica? Explique.
3)¿Influye el radio del capilar en la presión osmótica? Explique.
4)¿La sacarosa y el colorante dializan?

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PORCENTUALES

Experimento 3
Utilice la cantidad de NaCl que se proporciona en un sobre con el material,
(rotulado en miligramos), prepare una cantidad determinada de solución de NaCl al
2% considerando que la pureza del reactivo es de 100%.
1)Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer la cantidad de
agua destilada que es necesario añadir al NaCl del sobre para que la solución sea al
2%.
2)Conserve esta solución ya que se utiliza en el experimento 4

Considerando que la solución de NaCl es al 2% calcule las concentraciones siguientes:

Molaridad
Normalidad
MEq/ml
mg/ml
moles %
Osmolaridad

DIÁLISIS

Ejemplo de membranas dialíticas son el celofán y el colodión. Se deberá poner
particular atención al hecho de que este experimento es la base del tratamiento de
pacientes renales descompensados por medio de diálisis, la cual es útil también para


eliminar sustancias nitrogenadas, medicamentos en exceso o exceso de acidez en
sangre. Médicamente se refieren diversos tipos de diálisis de los cuales
mencionaremos la Hemodiálisis y la Diálisis peritoneal.

EXPERIMENTO 4
Como antecedente de este experimento prepare dos tubos de ensayo,

• coloque en uno de ellos 2 mL de NaCl al 2% y 5 gotas de AgNO3 (nitrato de
plata).
• Al otro tubo agréguele 2 mL de solución de almidón al 1% y 2 gotas de
solución de Lugol.
• Observe la reacción que ocurre en cada tubo.
• Rotúlelos como testigo de cloruros y testigo de almidón respectivamente.

Humedezca por inmersión en agua destilada durante 10 minutos la sección del
tubo de colodión o celofán de aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm de
diámetro y cierre un extremo atándolo con hilo de algodón.
• Llénelo con una mezcla de 1 mL de solución de NaCl al 2% preparado en el
experimento 3 y 10 mL de solución de almidón al 1%.
• Ate cuidadosamente el otro extremo del saco y suspéndalo en un vaso de
precipitados con agua destilada.
• Se determinará la presencia de almidón y de cloruros en el líquido del vaso de
precipitados que rodea al saco, a tiempo cero, a la hora y a las dos horas.
Pasado este tiempo repita las dos pruebas en el líquido contenido en el
saco.
1)¿Ha dializado el almidón a través de la membrana?
2)¿Dializó el cloruro de sodio?
3)Explique este fenómeno.

PREPARACION DE SOLUCIONES

EXPERIMENTO 5
Prepare 100 mL de solución 0.5M de ácido acético (CH3-COOH) tomando como
base los siguientes datos: El ácido acético tiene un peso molecular de 60, la pureza
del reactivo es de 99.7% y la densidad a 20°C es de 1.06 g/mL.
Una vez preparada consérvela para utilizarla en el experimento
siguiente.
1)Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer el volumen de
ácido acético concentrado que utilizó para preparar los 100 mL de dicha solución.
R = _________ mL de CH3-COOH.
2)Considerando que la solución es 0.5M calcule las concentraciones siguientes:

% (p/v) =
Normalidad =
mmoles/L =



gramos/L =
mEq % =
Os molaridad =
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN POR TITULACIÓN

EXPERIMENTO 6
En este experimento se utilizará la solución de ácido acético (CH3-COOH)
(solución problema) que se preparó en el experimento 5.

• En un matraz Erlenmeyer de 250 mL coloque 10 mL de la solución de ácido
acético problema, midiéndolos con la mayor exactitud posible.
• Añada 2 gotas de fenolftaleína y titule utilizando solución de NaOH 0.2N.
Recuerde que el punto de titulación se observará cuando persista por más de un
minuto un ligero color rosa.

1)¿Cuántos mL de NaOH 0.2N gastó para neutralizar los 10 mL de la solución
de ácido acético? R = _________ mL

2)De acuerdo con los resultados que obtuvo y considerando que la solución de
NaOH es exactamente 0.2N. ¿Cuál es la verdadera normalidad del ácido acético
problema?

3)Escriba el concepto de titulación ácido-base.



3. ELECTRÓLITOS y pH

C
uando una corriente eléctrica circula por una solución acuosa de cloruro de
sodio (NaCl), hay una transferencia de materia, la cual consiste en partículas
con carga llamadas iones. Los iones que se mueven hacia el ánodo (polo
positivo) son los aniones, los que migran hacia el cátodo (polo negativo) son los
cationes y hay liberación de hidrógeno y cloro, evidencia de la descomposición del
agua, proceso al cual se le llama electrólisis.
Las sustancias que permiten el paso de la corriente se conocen como
electrólitos y a los que no manifiestan esta propiedad como no electrólitos. A esta
capacidad de dar paso a la electricidad se le conoce como conductancia.
Los electrólitos de clasifican en fuertes y débiles según su potencia para
conducir la corriente eléctrica.
• Los electrólitos fuertes son los muy disociables como las sales minerales, los
hidróxidos de metales alcalinos, y los ácidos minerales. En los líquidos del
organismo encontramos como ejemplo de electrolitos fuertes al cloruro de sodio
(NaCl), cloruro de potasio (KCl) y cloruro de calcio (CaCl2), entre otros.
• Son electrólitos débiles la mayor parte de los compuestos orgánicos (como
los ácidos láctico, pirúvico, etc.), y los compuestos nitrogenados.
En el agua corporal hay muchos ejemplos de compuestos no electrólitos como
glucosa, urea y creatinina.
CONDUCTIVIDAD

La conductividad de las soluciones electrolíticas depende exclusivamente de las
moléculas disociadas, y por lo tanto depende del grado de disociación y de la
concentración de los electrólitos presentes. Entre mayor sea la concentración, mayor
será la conductividad, hasta un límite determinado en el cual se hace constante y
luego disminuye, explicándose esto porque cuando la concentración de cationes y
aniones es grande, interfieren entre sí y en tal caso los cationes tienen una menor
libertad para desplazarse debido a la interacción con los aniones cercanos en la
solución y viceversa.
Esta explicación se puede aprovechar para explicar la fuerza iónica de una
solución, ya que al no desplazarse libremente las moléculas en la solución, la
“concentración activa” o “actividad” de las soluciones es menor que la concentración
real, por lo tanto:
∑Cz 2

I = ---------
2

La fuerza iónica (I) es la semisuma del producto de la concentración
(C) del ión por la valencia (z)al cuadrado.
Se sabe que las fuerzas de atracción entre iones de carga con signos contrarios
disminuye rápidamente al crecer las distancias. En las soluciones concentradas, en


las que los iones se encuentran más cercanos, se hacen mayores y por lo tanto la
actividad se hace menor, en las soluciones muy diluidas la actividad y la
concentración efectiva son equivalentes entre sí.

ELECTRÓLISIS DEL AGUA
EXPERIMENTO 1
Coloque un cristalizador sobre un fondo blanco y agregue 50 mL de solución
de NaCl al 10%.
• Introduzca en la solución electrodos de carbón conectados a una fuente de
energía como el puente de Wheatstone o una pila.
• Observe la formación de gas, agregue entre los electrodos 5 gotas de azul de
bromofenol como indicador
• y observe los cambios de coloración en la solución cercana a los electrodos.
• Intente captar el olor en cada electrodo y descríbalo.

a)Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos.
b)Esquematice el proceso de la electrólisis del agua.

CONDUCCIÓN DE CORRIENTE EN ELECTRÓLITOS FUERTES Y DÉBILES
EXPERIMENTO 2
• Coloque la solución de ácido clorhídrico (HCl) 0.5M en un vaso de precipitados
en cantidad suficiente para que tenga contacto con los electrodos en una
tercera parte de su longitud.
• Introduzca los electrodos conectados a una fuente de energía y observe el paso
de la corriente eléctrica manifestado por la intensidad de la luz emitida por el
foco.
• Observe también la intensidad luminosa con relación a la distancia entre los
electrodos, sin ponerlos en contacto.
Repita el experimento usando ácido acético (CH3COOH) 0.5M.
• Anote sus resultados.

Intensidad
Solución Variación con la distancia
luminosa
HCl 0.5M
CH3COOH 0.5M

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE pH CONOCIDO
CON ELECTRÓLITOS FUERTES Y DÉBILES

Los ácidos o las bases se clasifican en débiles o fuertes según su grado de
disociación, así los electrólitos fuertes son los que están más disociados y por lo tanto
la concentración molar del ión hidrógeno o del ión hidroxilo en sus soluciones será
igual a la normalidad, lo que simplifica el cálculo de su pH.
pH = -log [H+] y pOH = -log [OH-]



Además en toda solución acuosa: pH + pOH = 14
Pero en el caso de los ácidos y bases débiles, los cuales están parcialmente
disociados, además de conocer la normalidad del ácido o base, deberá conocerse el
grado de disociación de la sustancia, o sea, la constante de disociación ácida Ka o
básica Kb, la cual es diferente para cada sustancia. En el cálculo del pH se deberá
aplicar la fórmula en la que se toman en cuenta la constante K de disociación
respectiva y la molaridad C de la solución.
pH = 1/2pKa – 1/2log C y pOH = 1/2 pKb – 1/2log C

EXPERIMENTO 3
Empleando la fórmula que corresponda, calcule las cantidades adecuadas para
preparar 250 mL de cada una de las siguientes soluciones:
• De ácido clorhídrico a partir de HCl al 37% de pureza y densidad de 1.18
g/mL.
• De pH = 1.3, 1.6 y 2

• De ácido acético a partir de CH3-COOH al 99.7% de pureza, densidad de 1.06
g/mL y pKa = 4.74.
• De pH = 3.02, 3.17 y 3.37
• Prepare el par de soluciones que le indique su profesor y consérvelas para el
siguiente experimento.

ACIDEZ VERDADERA Y ACIDEZ DE TITULACIÓN

EXPERIMENTO 4
Determine colorimétricamente (con papel indicador) el pH de cada una de las
soluciones que preparó en el experimento anterior. A continuación determine el pH
potenciométrico de cada una de ellas.
• Posteriormente, mida exactamente 20 mL de la solución de HCl que preparó,
colóquelos en un matraz Erlenmeyer,
• añada 2 gotas de solución de fenolftaleína y titúlela con NaOH 0.1N.
• A continuación mida exactamente 20 mL de la solución de CH3-COOH que
preparó, colóquelos en otro matraz Erlenmeyer,
• añada 2 gotas de solución de fenolftaleína y titúlela con NaOH 0.1N.
Con los datos obtenidos llene la tabla
TITULACIÓN
PH
Solució Gasto de NaOH 0.1N mL concentración
n teóric Colorimétri Potenciométric teóric Experiment (N tit x gasto)/V
o co o o al prob

HCl

CH3COOH



4. SOLUCIONES REGULADORAS

A
las soluciones reguladoras se les pueden añadir cantidades relativamente
grandes de ácidos o álcalis sin alterar de manera significativa su pH. Esta
acción amortiguadora se debe a la presencia en la solución de un sistema
formado por un ácido o una base débil y su sal correspondiente.
Si se toma como ejemplo una solución que contenga un ácido débil, al que
representaremos por HA y su sal, representada por BA los hidrogeniones existentes
en ella procederán únicamente de las moléculas ácidas, que se disocian como sigue:

+ -
HA -- H + A

El equilibrio de la reacción está dado por la siguiente ecuación:

+ -
[H ] [A ]
--------------------- = Ka
[HA]

Donde Ka es la constante de disociación del ácido. De esta ecuación se deduce
que la concentración de hidrogeniones es:
Ka [HA]
+
[H ] = ------------------
-
[A ]

La relación entre estas dos constantes es, sin embargo, tan sensiblemente
constante en condiciones ordinarias que podemos afirmar que la concentración de A-
es igual a la concentración de la SAL. Sustituyendo una expresión por otra en la
ecuación anterior tenemos:
[Ácido]
+
[H ] = Ka ---------------
[Sal]

Si se toman logaritmos negativos en ambos términos de la ecuación, (manipulación
matemática para manejar números muy pequeños o muy grandes), queda así:
[Ácido]
+
- log [H ] = - log Ka – log ---------------
[Sal]

+
Ahora bien, si -log [H ] es igual a pH, por analogía podemos decir que –log
de Ka es igual a pKa por lo que:



[Ácido]
pH = pKa – log ---------------
[Sal]

Por otra parte por las leyes de los logaritmos, las expresiones –log de
([Ácido]/[Sal]) y + log de ([Sal]/[Ácido]) son iguales y la segunda puede
reemplazar a la primera, de tal modo que hechas todas las modificaciones la ecuación
queda finalmente como sigue:
[Sal]
pH = pKa + log ----------
[Ácido]

Esta ecuación se conoce con el nombre de Ecuación de Henderson–
Hasselbalch y nos indica que el pH de una solución que contenga un ácido débil y
su sal está determinado por el valor de pKa (constante para cada ácido) y por el
logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentración de la sal entre la
concentración del ácido.
Por ejemplo, el valor de la constante de disociación Ka del ácido acético es de
1.8 x10-5. El valor de su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solución
reguladora que posea iguales cantidades de ácido acético y acetato de sodio en
concentración 0.1N, el pH de esa solución sería de:
0.1N
pH = 4.74 + log ---------- = 4.74
0.1N
Además de servir para la preparación de soluciones de pH conocido, las
soluciones reguladoras tienen dentro del organismo un papel de importancia capital
que es el de evitar que aumente o disminuya de manera importante la concentración
de iones hidrógeno, ya que la vida humana es posible en límites muy estrechos de
pH, es decir, para la sangre arterial un pH de 7.40 y para sangre venosa y líquidos
intersticiales 7.35.
Este último es menor por tener mas CO2 y por lo tanto mas H2CO3 producido
metabólicamente. Se sabe que los límites máximos de pH en los que por algunos
minutos puede permanecer el organismo sin sufrir muchas alteraciones son de 7.0 a
7.8. En los líquidos donde existen y actúan al mismo tiempo varios sistemas
amortiguadores, como sucede en la sangre, el ácido o la base que entra es
amortiguado por todos los sistemas presentes de manera proporcional a la eficacia de
cada uno de ellos.
La regulación fisicoquímica tiene lugar en todos los medios que contienen
reguladores, constituidos principalmente por ácidos o bases débiles y sus sales. Por
ejemplo el de fosfatos H2PO4-/HPO4= con un pKa2 de 7.2 (o de 6.8 a la
temperatura corporal), es el principal amortiguador intracelular.
El principal amortiguador extracelular en la sangre y líquidos intersticiales es
el sistema bicarbonato H2CO3/HCO3- con un pKa de 6.1.



En el interior del eritrocito, además del bicarbonato, el amortiguador de mayor
importancia es el de hemoglobina reducida / oxihemoglobinato (HHb/HbO2).
Otros sistemas son los de proteínas y aminoácidos.

Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existen excesos
de álcali ó ácido ya que un cambio del pH afecta la estructura y la actividad de las
proteínas, la distribución de otros iones entre las células y el líquido extracelular, la
actividad de hormonas y fármacos, etc.

APRECIACIÓN DEL PODER REGULADOR Y EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN

EXPERIMENTO 1
• Disponga 3 series de 4 tubos de ensayo cada una.
• Numere los tubos de cada serie del 1 al 4.
• Coloque en los tubos número 1 de cada serie 5 mL de agua destilada hervida.

• En los tubos número 2 coloque 5 mL de solución de cloruro de potasio (KCl)
0.5M

• En los tubos número 3 ponga una mezcla formada por 2 mL de solución de
fosfato diácido de potasio (KH2PO4) 0.01M y 3 mL de solución de fosfato
monoácido disódico (Na2HPO4) 0.01M.

• En los tubos número 4 ponga 2 mL de solución de KH2PO4 0.1M y 3 mL de
solución de Na2HPO4 0.1M.

1. A continuación compruebe en la serie 1 que el pH de las soluciones es
aproximadamente neutro, para ello agregue cinco gotas de indicador rojo
de fenol (rosa), a cada uno de los tubos de la serie y observe el color
característico amarillo o rojo correspondiente a un pH de 6.8 a 8.2.
2. A los cuatro tubos de la serie 2 adicione cinco gotas de verde de
bromocresol, indicador de zona ácida. A continuación agregue 10 gotas
de HCl 0.01M al tubo número 1 y observe el cambio de color que se
opera (de verde a amarillo).
3. Enseguida vea el número de gotas de la misma solución de HCl 0.01M
que es necesario agregar al tubo 2 de la serie en cuestión para igualar la
coloración (aunque no la intensidad) con el tubo número 1.
4. Ahora, cuente el número de gotas de solución de HCl 0.1M que es
necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloración con el tubo
número 1. (Cada una de estas gotas de HCl 0.1M equivale a 10 gotas de
HCl 0.01M)



1. Adicione a los cuatro tubos de la serie 3, cinco gotas de azul de timol,
indicador de zona alcalina que vira de amarillo a azul fuerte
correspondiendo a un pH 8.0 a 9.6).
2. A continuación agregue 10 gotas de solución de NaOH 0.01M al tubo
número 1 y observe también el cambio de coloración (de amarillo a
azul).
3. Determine el número de gotas de la misma solución de NaOH 0.01M
que es necesario agregar al tubo número 2 de esta serie para que
adquieran el mismo color del tubo número 1, (amarillo a azul).
4. A continuación, cuente el número de gotas de solución de NaOH 0.1M
que es necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloración
con el tubo número 1.

1)¿Qué indica el cambio de color en cada una de las series?

2)¿Cómo explicaría usted la diferencia en las cantidades de ácido y base que
deben agregarse a los tubos 2, 3 y 4 de las series correspondientes para igualar la
coloración con el tubo 1?

3) Recuerde que cada gota de las soluciones 0.1M equivale a 10 gotas de las
soluciones 0.01M.

CURVAS DE TITULACIÓN

Existen sustancias de mucha importancia en bioquímica como son los aminoácidos y
las proteínas los cuales tienen grupos titulables y que actúan como anfolitos
aceptando iones H+ o iones OH-. En este experimento se determinarán las curvas de
titulación de glicina con HCl y con NaOH.

EXPERIMENTO 2
• En un vaso de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solución de glicina
0.1N, agregue una barra magnética y colóquela sobre el agitador, tómeles el
pH y titule, como se indica en la tabla, con NaOH 0.1N.

• En otro vaso de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solución de glicina
0.1N, agregue una barra magnética y colóquela sobre el agitador, tómeles el
pH y titule, como se indica en la tabla, con HCl 0.1N.



Agregar HCl 0.1N Glicina 0.1N Agregar NaOH 0.1N Glicina
30 ml 0.1N 30 ml
ml Acumulativo pH ml Acumulativo PH
0 0 0 0
2 2 2 2
3 5 3 5
4 9 4 9
5 14 5 14
5 19 5 19
5 24 5 24
1 25 1 25
1 26 1 26
1 27 1 27
1 28 1 28
0.5 28.5 0.5 28.5
0.5 29 0.5 29

Grafique dando a los valores acumulativos de HCl signo negativo y a los de
NaOH signo positivo, en el eje de las x y el pH en el eje de las y.

1)En su gráfica, identifique los valores de pK1 y pK2.
2)Calcule el punto isoeléctrico sabiendo que:

pK1 + pK2
pI = -------------
2

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES REGULADORAS

EXPERIMENTO 3
Empleando la fórmula de Henderson Hasselbalch, calcule los volúmenes
necesarios para preparar soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le
indique su profesor, empleando fosfato diácido de potasio (KH2PO4) 0.1M y
fosfato monoácido de sodio (Na2HPO4) 0.1M (pK2 = 7.2); posteriormente
prepárelas y compruebe sus resultados midiendo el pH potenciométrico.

Explique la coincidencia o no, entre sus resultados y el cálculo teórico.



5.PROTEÍNAS

P
rincipales componentes del protoplasma y las membranas celulares, su nombre
deriva del griego protos que significa “primero”, “primordial” o fundamental,
contienen en su molécula C, H, O, N y en ocasiones P y S.
El nitrógeno constituye aproximadamente el 16%; por hidrólisis dan como producto
final αα aminoácidos, los cuales varían en número, cantidad y posición en cada
proteína. La proteína está determinada por cuatro niveles estructurales
• La estructura primaria depende del número y secuencia de aminoácidos
unidos por enlace peptídico (-CO-NH-) covalente.
• En la estructura secundaria la cadena polipeptídica puede enrollarse
formando estructuras helicoidales u otro tipo de conformación,
estabilizadas por puentes de hidrógeno
• La estructura terciaria es una cadena polipeptídica ya enrollada que adopta la
conformación más estable, o sea, sufre un súper enrollamiento.
• La estructura cuaternaria puede estar constituida por más de una cadena
polipeptídica y en la asociación de estas cadenas participan todos los tipos de
enlaces químicos, fuertes o débiles, debido a lo cual adoptan una estructura
tridimensional característica que les da actividad biológica.

Existen muchos tipos de proteínas en el organismo, cada una con una función
específica; algunas son estructurales, otras actúan como catalizadores u
hormonas, generan presión oncótica para mantener el balance
hidroelectrolítico, son mecanismos genéticos, de defensa, transportan gases,
electrones, solutos a través de la membrana, etc.
La actividad de una proteína depende de su conformación espacial, por lo
que agentes físicos y químicos que alteran los diferentes enlaces son capaces de
anularla. Algunos de los agentes desnaturalizantes más comunes son ácidos o
bases, detergentes, metales pesados, solventes orgánicos, alcaloides, calor,
radiaciones ultravioleta, rayos x, ondas ultrasónicas, sales inorgánicas,
sustancias orgánicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes
oxidantes, etc.
Las proteínas desnaturalizadas pierden su actividad, modifican su solubilidad
y precipitan. Tal como existen en la naturaleza se denominan proteínas nativas.

ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

Las propiedades fisicoquímicas y biológicas características de las proteínas se
deben a los aminoácidos que las constituyen y las reacciones coloridas que se utilizan
para su análisis en realidad detectan la presencia de un aminoácido específico.

Ensayaremos a continuación algunas de ellas.



REACCIÓN DE MILLÓN
Es específica para el grupo fenólico y por lo tanto, la dan positiva todas las
sustancias que poseen esta función, como el fenol, ácido salicílico, timol, tirosina y
todas aquellas proteínas que contengan tirosina.

EXPERIMENTO 1
Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno,
2 mL de una de las soluciones siguientes:

Tubo Proteína (al 2%)
1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

• Posteriormente añada 5 gotas del reactivo de Millón.
• Caliente ligeramente hasta que la solución hierva. ¡Precaución!.
• La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparición de un
precipitado blanco el cual por acción del calor se vuelve rojo.
La presencia de sales, así como soluciones muy alcalinas, pueden interferir en esta
reacción.

1)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo.
2)Explique en qué consiste el reactivo de Millón y cuál es el mecanismo que se
ha propuesto para esta reacción.

REACCIÓN DEL BIURET

Todas las moléculas que contengan dos o más uniones peptídicas, por lo
tanto todas las proteínas y péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva la
reacción del biuret. El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el
cual da positiva la prueba.
Cuando una proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre
(CuSO4) en solución alcalina se produce un color característico púrpura o violeta.
El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los átomos de
nitrógeno de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar las
proteínas y péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el
proceso de hidrólisis proteica, la reacción será negativa cuando la hidrólisis sea
completa.

EXPERIMENTO 2
Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 1 mL
de las siguientes soluciones:



Tubo Proteína (al 2%)
1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

• Añada 2 mL de solución de NaOH al 10% ¡Precaución!
• y 3 a 5 gotas de solución de sulfato de cobre CuSO4 al 1%.

Agite los tubos y observe la reacción que se produce en cada caso. La aparición de
una coloración violeta o rosa en no más de 20 minutos debe considerarse como
prueba positiva.

2)¿Se puede considerar la reacción del biuret como característica para todas las
proteínas? ¿Por qué?
3)Escriba la reacción.

REACCIÓN XANTOPROTÉICA

Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por
reacción del ácido nítrico sobre grupos bencénicos que poseen algunos
aminoácidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptófano. Por lo tanto, la
dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos aromáticos en su
molécula.

EXPERIMENTO 3
Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL
de una de las siguientes soluciones:

Tubo Proteína (al
2%)
1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

• Añada 1 mL de ácido nítrico (HNO3) concentrado °con cuidado!,
• caliente ligeramente y observe una coloración amarilla característica.
• Deje enfriar esta solución y añada cuidadosamente gotas de hidróxido de
amonio (NH4OH) concentrado, haciéndolas resbalar cuidadosamente por las
paredes del tubo, para estratificar.
• En la interfase se observará un anillo naranja.


2)¿Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas?
3)Explique por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO3.

REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Las proteínas que contengan los aminoácidos cisteína y cistina cuando se
tratan con álcalis concentrados, desprenden ácido sulfhídrico H2S, el cual se puede
reconocer por su olor fuertemente desagradable y característico, o bien, por la
formación de un precipitado negro de sulfuro de plomo (PbS).

EXPERIMENTO 4
Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2
mL de una de las siguientes soluciones:

Tubo Proteína (al
2%)
1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

• Agregue 2 mL de hidróxido de sodio (NaOH) al 10%. ¡Precaución!
• Caliente ligeramente.
• Añada a todos los tubos 0.5 mL de solución de acetato de plomo
(Pb(CH3COO)2).
• Coloque los tubos en baño maría a ebullición por 5 min.
El oscurecimiento de la solución o la formación de un precipitado negro indica la
presencia de aminoácidos azufrados.

1)Anote sus resultados en la tabla al final del capítulo.
2)Escriba la reacción química que se ha efectuado.
3)¿Qué sustancias pueden interferir en esta reacción?

REACCIÓN DE NINHIDRINA

Es una de las reacciones más sensibles para identificar aminoácidos en general,
ya que detecta una parte de aminoácido en 1 500 000 partes de agua. Aminoácidos
y muchas aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina da
coloración amarilla. Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración
cuantitativa de aminoácidos por colorimetría. La valoración de aminoácidos en
orina, por ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en algunas enfermedades
como hepatopatías, infecciones agudas o diabetes mellitus en las que se
presenta hiperaminoacidemia, estas se ven acompañadas por aminoaciduria



paralela. Algunas enfermedades metabólicas congénitas dan lugar a la eliminación
anormal de algunos aminoácidos en la orina (p. ej. fenilcetonuria).

EXPERIMENTO 5
Se utilizarán cuadros de papel filtro Whatman no. 1 de 2 x 2 cm, sobre los cuales se
colocarán gotas de las siguientes soluciones:

cuadro Sustanci
a:
1 Glicina
2 Peptona
3 Gelatina
4 Caseína
5 Albúmin
a

• ¡Precaución! Use guantes o pinzas para manipular el papel.
• Anote debajo de cada muestra el nombre del compuesto y
• añádale una gota de solución de ninhidrina en butanol al 0.1%.
• Coloque el papel en el horno a 110 °C durante 5 minutos.
• Describa el aspecto de la reacción

1)Anote sus resultados en la tabla al final del capítulo.
3)¿Qué sustancias dan positiva la reacción de la ninhidrina, además de las
proteínas, péptidos y aminoácidos?

Tabla de resultados de algunas propiedades químicas de las proteínas:

SUSTANCIA REACCIÓN
AMINOÁCID
MILL BIURE XANTOPROTÉIC NINHIDRIN
OS
ON T A
AZUFRADOS
A
GLICINA
PEPTONA
GELATINA
CASEÍNA
ALBÚMINA

ALGUNAS DE LAS PROPIEDADES FÍSICO – QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

Muchas de las propiedades químicas de las proteínas son comunes a varias
especies por que contienen el mismo tipo de aminoácidos, por lo que para
caracterizar una proteína es necesario estudiar sus propiedades fisicoquímicas las



cuales dependen del peso molecular, de su carga eléctrica neta y de la
conformación que adopte la molécula.

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

Cuando la estructura altamente ordenada de una proteína se somete a la acción
de agentes fisicoquímicos desnaturalizantes, queda reducida al llamado polímero
estadístico o cadena de aminoácidos y además pierde toda actividad biológica.
A continuación se consideran algunos de los agentes desnaturalizantes más
importantes como son los metales pesados, los ácidos fuertes y el alcohol.

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS

Las proteínas cuando se encuentran en solución a pH superiores a su punto
isoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los
correspondientes proteinatos insolubles. Tomaremos como ejemplo dos proteínas,
la peptona y la gelatina y observaremos su reacción, en forma simultánea frente a los
metales pesados : Hierro (Fe), Plata (Ag), Mercurio (Hg), y Plomo (Pb).

EXPERIMENTO 6
• Prepare una serie de 4 tubos de ensayo conteniendo 1 mL de peptona al 2% y
rotúlelos como P1 – P4 (por peptona).

• Prepare otra serie de 4 tubos, ésta vez con gelatina al 2%. Rotúlelos como G1 –
G4 (por gelatina)
• y agregue lo que se indica en la tabla.

Anote sus observaciones en la misma, evaluando por medio de cruces (de x a xxx
según la turbiedad del precipitado).

Serie Seri Observaciones:
P eG Metal Pesado:
Precipitado: Con exceso:
Tubos: Agregar 2 gotas de Serie Serie Serie Serie
solución al 2% de:
P G P G
1 1 FeCl3
2 2 AgNO3
3 3 HgCl2
4 4 Pb(CH3COO) 2

1)¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las
proteínas?
2)¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las
proteínas?



PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES

Los ácidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las proteínas formando
productos de desnaturalización insolubles conocidos como metaloproteínas.

EXPERIMENTO 7a
Coloque en 4 tubos de ensayo numerados, 3 mL de las siguientes soluciones:
peptona, gelatina, caseína y albúmina al 2% y añada un volumen igual de ácido
tricloroacético (CCl3COOH) al 5%.
1)Anote sus resultados al final del capítulo.
2)¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del ácido tricloroacético y en
general de cualquier ácido?

EXPERIMENTO 7b
Prepare dos tubos de ensayo y márquelos como orina normal y orina de
paciente nefrótico, coloque en ellos 3 mL de la orina correspondiente. Agregue
enseguida, resbalando cuidadosamente por la pared del tubo, para estratificar, 2 mL
de la mezcla HNO3 – metanol.

1)Observe lo que ocurre en la interfase y describa
2)¿Qué explicación le da al fenómeno?

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DEL ALCOHOL
EXPERIMENTO 8
Coloque en tubos de ensayo numerados, 2 mL de las siguientes soluciones:
peptona, caseína, gelatina y albúmina al 2%, estratificando cuidadosamente,
agregue 3 mL de alcohol de 96° (CH3CH2OH) y observe que ocurre en la interfase.
1)¿Observa turbidez en todos los tubos?
2)Anote sus resultados en la tabla:

Agente Ácido tricloroacético Alcohol de 96°
Sustancia (CCl3COOH) al 5% (CH3CH2OH)
Peptona
Gelatina
Caseína
Albúmina

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO
Las proteínas al igual que los aminoácidos son moléculas anfotéricas. Es decir,
pueden reaccionar con ácidos o con álcalis. En medio ácido las proteínas se combinan
con los iones hidrógeno y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberan
protones y quedan con carga negativa. El pH en el cual una proteína no posee carga


eléctrica neta se denomina punto isoeléctrico, a este pH la proteína presenta su
mínima solubilidad y generalmente precipita, teniendo además una viscosidad
máxima, propiedades que tomaremos en cuenta para el siguiente experimento.
EXPERIMENTO 9
Prepare una serie de 9 tubos de ensayo siguiendo las instrucciones de la tabla:
• Añada primero la caseína, posteriormente el agua y al final el ácido
acético.
• Agite todos los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitación que se
produce en cada tubo
• inmediatamente y después de 15’ y 30’.
1)Anote sus observaciones en la tabla valorando con cruces.
2)Calcule el pH teórico de cada tubo, aplicando la ecuación de Henderson -
Hasselbalch y anótelo en la tabla.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Caseína al 5% en acetato de sodio 0.1N m 1 1 1 1 1 1 1 1 1
l
Agua destilada m 8. 7. 8. 8. 8. 7. 5. 1. 7.4
l 4 8 8 5 0 0 0 0
Ácido acético 1N m - - - - - - - - 1.6
l
Ácido acético 0.1N m - - 0. 0. 1. 2. 4. 8. -
l 2 5 0 0 0 0
Ácido acético 0.01N m 0. 1. - - - - - - -
l 6 2
pH teórico
Observación a los 15 minutos
Observación a los 30 minutos



6. CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS

D
e acuerdo con la Ley de Acción de Masas, la velocidad de una reacción
química depende de la concentración de las sustancias que intervienen en la
reacción. Esta Ley establece que: “La magnitud de una reacción es
proporcional a la masa activa de las sustancias reaccionantes presentes en
ese momento”.
El término masa activa significa la concentración molecular o sea, la cantidad
presente por unidad de volumen. Si reaccionan:
V1
A + B C + D
V2
La velocidad V1 con que reaccionan A y B para producir C y D depende de la
concentración de cada reactivo y de la afinidad que tengan para reaccionar entre sí,
pero como esto se puede considerar constante, podemos decir que:
V1 = k1[A][B]

La velocidad V2 con que reaccionan C y D para producir A y B depende a su vez,
de la concentración de C y D y de la afinidad. Por lo tanto podemos decir también
que:
V2 = k2[C][D]

Cuando se alcanza el equilibrio químico, las dos velocidades son iguales. Es
decir:
V 1 = V2

Sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos:

k1[A][B] = k2[C][D]

k1 [C][D]
---- = ---------
k2 [A][B]
Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante podemos
decir que:

[C][D]
keq = ---------
[A][B]
Que es la expresión matemática de la Ley de Acción de Masas y keq se conoce
como Constante de Equilibrio.



COMPROBACIÓN DE LA LEY DE ACCIÓN DE MASAS

EXPERIMENTO 1
En un vaso de precipitados de 600 mL de capacidad, añada 100 mL de agua
destilada, 1 mL de solución de sulfocianuro de amonio (NH4SCN) 0.2M y 1 mL de
solución de cloruro férrico (FeCl3) 0.2M en HCl 0.1N mezclando hasta lograr la
homogeneidad.
Observará la aparición de una coloración roja, debida a la formación de
sulfocianuro férrico (Fe(SCN)3).
En cuatro vasos gerber, coloque en cada uno 25 mL de la mezcla reaccionante
anterior, después de haber agitado hasta completa homogeneidad, enseguida
agregue a cada vaso los reactivos descritos en la tabla siguiente:

Reactivo FeCl3 0.2M en HCl 0.1N ml NH4SCN 0.2M ml NH4Cl ml
Vaso
1 0.5 0.5 --
2 1.0 1.0 --
3 -- -- 5.0
4 Testigo --

2)Observe la intensidad de la coloración en cada vaso y de acuerdo a la Ley de
Acción de Masas y al principio de Le Chatelier trate de explicar sus resultados.

VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA

El orden de la reacción, tiene mas importancia que el tipo, cuando se estudia la
cinética, ya que nos indica la relación entre la velocidad y la concentración de los
reactivos, por lo que se clasifican en:

Reacciones de orden cero. Su velocidad no es afectada por la concentración.
• Está determinada por algún otro factor limitante como absorción de luz, velocidad de
difusión, etc.
Reacciones de primer orden. Su velocidad de reacción es directamente proporcional
• a la concentración de una de las sustancias reaccionantes
Reacciones de segundo orden. Su velocidad de reacción es proporcional
• a la concentración de dos sustancias reaccionantes.
Reacciones de tercer orden. Su velocidad de reacción es proporcional
• a la concentración de tres sustancias reaccionantes.

La mayor parte de las reacciones enzimáticas se caracterizan por seguir el modelo
correspondiente a las reacciones de primer orden. Matemáticamente la reacción
puede representarse así:
dc


----- = Ke
dt
dt = tiempo dc = concentración del material Ke = constante específica de
velocidad de reacción
Si representamos por a la concentración inicial de material y por x la cantidad
que ha reaccionado en el tiempo t, la expresión a-x significa concentración del
material en el tiempo t. La ecuación anterior puede expresarse en función de a, x y t
y al integrarla nos queda:

2.303 a
Ke =------------ x log --------
t (a – x)

Cuando se ha completado la descomposición de la mitad del material, la
ecuación se simplifica y queda:
2.303 (log 2)
Ke =-------------------------
t1/2
Donde t1/2 es el período de vida media, es decir, el tiempo necesario para que
se descomponga la mitad de una cantidad dada de material reaccionante.

VELOCIDAD DE DESCOMPOSICIÓN DEL H2O2
EXPERIMENTO 2
• Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, 5 mL de una
solución problema de peróxido de hidrógeno (H2O2)y 2 mL de ácido sulfúrico
(H2SO4) (1:6).
• Caliente la mezcla hasta casi ebullición ¡PRECAUCIÓN!
• y así en caliente, titule con una solución de permanganato de potasio (KMnO4)
0.01M.
El punto final de la titulación lo observará cuando persista un ligero color rosa, por
exceso de la solución de permanganato. El H2SO4 y el calentamiento tienen por
objeto impedir la formación de MnO2.
Haga esta determinación por duplicado y haga el promedio de las dos
determinaciones.
• A continuación prepare una mezcla de 50 mL de sangre desfibrinada al
0.06% y 50 mL de la solución problema de peróxido de hidrógeno.
• A los 5, 10, 20, 30 y 40 minutos tome alícuotas de 10 mL y transfiéralos a un
matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad,
• añada 2 mL de solución de H2SO4 (1:6) caliente hasta casi ebullición
• y titule con una solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0.01M en la
forma ya explicada.
1)Escriba las reacciones químicas que se han efectuado.
2)Resuma sus resultados en la siguiente tabla:



Tiempo/s KMnO4 0.01M/mL (a – x) moles/L log a/(a-x) Ke
0

300

600

1200

1800

2400

Para calcular la Ke a cada tiempo debe utilizar la ecuación:

2.303 a
Ke = ------------ x log --------
t (a – x)

1)Determine el orden de reacción gráficamente.

INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN
QUÍMICA

Desde hace muchos años se sabía en forma empírica que la velocidad de
muchas reacciones aumenta al aumentar la temperatura. Arrhenius encontró una
relación que expresa matemáticamente la forma como la temperatura afecta la
velocidad de una reacción, la cual está dada por la siguiente ecuación:
d(ln K) E
----------- = ----------
dt RT2
La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de
velocidad de una reacción es inversamente proporcional al cuadrado de la
temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases. E es la energía de
activación. Actualmente se considera que para que las moléculas puedan
reaccionar deben ser primero activadas, es decir, requieren una cantidad de
energía E. Integrando entre límites la ecuación de Arrhenius:
K2 E (t2 - t1)
log ------- = -------------
K1 2.3 (R t1 t2)

K2 E (t2 - t1)
log ----- = ---------------------
K1 2.3 (1.99) (t1 t2)
K2 0.219E (t2 - t1)


log ------- = ----------------------
K1 (t1 t2)

Si consideramos que E = 1200 calorías al aumentar la temperatura de 22°C a
32°C, tendríamos:
K2 0.219 x 1200 x (305 - 295)
log ------ = --------------------------------------- = 0.29
K1 (295 x 305)
K2
antilog log ------- = antilog 0.29
K1

K2
------- = 2
K1
Esto quiere decir que por cada 10°C de aumento la velocidad de la reacción se
duplica. En la mayor parte de las reacciones se observa este aumento bajo ciertas
temperaturas límites.

EXPERIMENTO 3
• Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad 0.25 g de yoduro de
potasio (KI) y añada 25 mL de solución de H2SO4 1:6.
• Agite hasta disolución completa y agregue agua destilada hasta completar 50
mL.
Esta solución se denominará Solución de ácido yodhídrico HI y se utilizará en
este experimento y en el siguiente.
Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL y agregue los reactivos
según la tabla que se muestra a continuación:

vaso 1 2 3 4 5
solución
HI ml 5 5 5 5 5
Na2S2O3 0.02N ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Almidón gotas 5 5 5 5 5
Preincubar 5 minutos a: 5 °C 25 40 60 90
°C °C °C °C
H2O2 al 0.2% ml 2 2 2 2 2

Deberá medir con la mayor precisión posible el tiempo desde el momento de
añadir el H2O2 al 0.2% hasta el momento en que aparece súbitamente un color
azul intenso.
1)Escriba las reacciones químicas que se han efectuado.
Temperatura °C Tiempo de aparición del color azul en
segundos:


3)Trace la gráfica de 1/tiempo de reacción en las ordenadas contra la
temperatura en las abscisas.

EFECTO DE LA [H+] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA

Se sabe que muchas reacciones químicas son afectadas por el pH del medio, las
moléculas deben ser activadas para que puedan reaccionar, el pH ácido favorece la
ionización y el estado iónico se puede considerar como un estado activado.

EXPERIMENTO 4
Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL de capacidad y
numérelos del 1 al 5 y agregue los reactivos según se indica en la tabla siguiente:

Vaso 1 2 3 4 5
Solución
HI ml 5 5 5 5 5
Na2S2O3 0.02N ml 1. 1. 1. 1. 1.5
5 5 5 5
Almidón gotas 5 5 5 5 5
H2O destilada ml 5
HCl 0.01N ml 5
HCl 0.1N ml 5
HCl 1N ml 5
HCl 2N ml 5
H2O2 al 0.2% ml 2 2 2 2 2


Tiempo de reacción
+
[H ] en segundos:
1 x 10-7
1 x 10-2
1 x 10-1
1
2

2)Según sus resultados trace una gráfica con el 1/tiempo en segundos en las
ordenadas y la concentración de H+ en las abscisas.

VELOCIDAD DE REACCIÓN Y CATALIZADORES



La velocidad de una reacción química es afectada por la presencia de
“sustancias extrañas”, catalizadores, que son capaces de acelerar la reacción al
disminuir la cantidad de energía de activación necesaria. Actualmente se considera
que el catalizador se combina con el sustrato formando un complejo intermediario
inestable y altamente reactivo. Supongamos la reacción:
A + B  AB
Esta reacción en condiciones normales se efectúa muy lentamente pero si se
añade un catalizador C apropiado, tenemos:
A + B + C  (AC) + B AB + C

Estas reacciones son rápidas y el catalizador puede ser usado una y otra vez.
Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgánica o bien sustancias orgánicas
complejas producidas por las células que son denominadas enzimas.

EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGÁNICO SOBRE
LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

La sacarosa es un disacárido no reductor, pero al hidrolizarse, cada molécula
libera una molécula de glucosa y una de fructosa, ambas reductoras. Basándose en
esto es posible visualizar y cuantificar la hidrólisis de la sacarosa midiendo la
concentración de azúcares reductores con algún reactivo apropiado.

EXPERIMENTO 5
Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solución de
sacarosa al 0.05M.
• Un tubo quedará como testigo
• y al otro se agregarán 3 gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) (1:6).
• Se ponen ambos tubos en baño maría a ebullición durante 15 minutos,
complete el volumen si es necesario.
Emplearemos el reactivo de Fehling para lo cual
• el tubo que contiene el H2SO4 se neutraliza con 1 ml hidróxido de sodio
(NaOH) al 10%
• y posteriormente se añaden 2 mL de la solución “A” y 2 mL de la solución “B”
del reactivo de Fehling mezclándolos perfectamente
• y se colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos
• al cabo de los cuales se sacan del baño y se dejan enfriar
• y se observa si existe un precipitado rojo de óxido cuproso (Cu2O) en ambos
tubos.

1)¿Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador? ¿Por qué?
EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLOGICO (ENZIMA) SOBRE
LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

Una de las principales diferencias entre los catalizadores inorgánicos y las
enzimas es que los primeros solo son capaces de acelerar un proceso con



temperaturas altas, mientras que las enzimas son capaces de hacerlo a temperaturas
considerablemente más bajas.
Para esta práctica emplearemos sacarasa, también conocida como invertasa
o fructofuranosidasa la cual es una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas.
Actúa hidrolizando los azúcares que contienen fructosa. Así hidroliza la estaquiosa
(tetrasacárido), la rafinosa (trisacárido), y alcanza su máxima velocidad con la
sacarosa (disacárido). Se puede medir la hidrólisis observando el cambio en la
rotación óptica o valorando el poder reductor de los productos obtenidos.

EXPERIMENTO 6
Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solución de
sacarosa 0.05M y 1 mL de solución reguladora de acetato de sodio 0.05M a pH de
4.7
• Un tubo quedará como testigo
• y al otro se le agregan 0.2 mL de la solución de invertasa (solución enzimática).
• Después de mezclar bien el contenido de ambos tubos se colocan en baño maría
a 40°C durante 15 minutos;
• cuando se ha completado el tiempo se les agregan a ambos tubos 2 mL de la
solución A y 2 mL de la solución B del reactivo de Fehling, mezclándolos
perfectamente.
• Se colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos al cabo de los cuales se
sacan del baño y se dejan enfriar.
• Observe si existe un precipitado rojo de óxido cuproso Cu2O en ambos tubos.

Compare este experimento con el anterior y explique que sucede.



7. ENZIMAS
FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

L
a vida depende de diversos catalizadores orgánicos denominados enzimas: (del
griego en = en, zymo = fermento). La mayor parte de las reacciones biológicas
serían cinéticamente insignificantes si no fuera por ellas. De naturaleza
proteica, son muy sensibles a cualquier cambio en temperatura, pH, fuerza iónica,
adición de sales, presencia de agentes oxidantes o reductores, presencia de
metales pesados, etc. Al desnaturalizarse se inactivan.

NATURALEZA QUÍMICA DE LAS ENZIMAS

Son proteínas simples o complejas. Su parte proteínica se denomina
apoenzima. Si su parte no proteinica se separa fácilmente se le denomina
coenzima. Las coenzimas están relacionadas con las vitaminas y no catalizan por sí
mismas, ya que se transforman durante la reacción en que intervienen y requieren de
otra enzima para regenerarse. Por otra parte, cuando se encuentra firmemente unida
por enlace covalente, no es posible separarla por diálisis y se le denomina grupo
prostético.
Varios factores afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas.
Algunos de ellos son: temperatura, pH, concentración de sustrato,
concentración de enzima e inhibidores.

Temperatura
Al incrementar la temperatura, se incrementa la energía cinética, lo que ocasiona una
mayor probabilidad de colisiones efectivas. La velocidad de las reacciones químicas
aumenta. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas elevadas.
La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura óptima, en la cual catalizan con una
velocidad máxima.
PH
La actividad de la mayoría de las enzimas depende del pH debido a la participación de
iones [H+] o iones [OH+] en las reacciones, además que se afecta la carga de los grupos
funcionales. La mayoría de las enzimas tienen un pH óptimo en el cual su actividad es
máxima.
Concentración de la enzima
La velocidad de una reacción aumenta en proporción directa a la concentración de la
enzima que la cataliza. La interacción enzima – substrato cumple la Ley de Acción de Masas.
Se emplea con frecuencia la velocidad de una reacción como medida de concentración de la
enzima manteniendo fija la concentración de substrato.
Concentración de sustrato
Si se trabaja con una concentración fija de enzima la velocidad inicial de reacción
aumenta al incrementar la concentración del sustrato. Con el tiempo se alcanza un máximo
cuando la enzima se satura y la adición de más sustrato ya no influye sobre la velocidad.
Inhibidores



EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La temperatura óptima para la gran mayoría de enzimas de animales
homeotermos, está alrededor de 37°C. Por cada 10 grados centígrados de
incremento en la temperatura se duplica la velocidad, esto se conoce como la relación
de van´t Hoff, o coeficiente de temperatura QT10. Pero esto ocurre únicamente si no
se rebasa la temperatura de desnaturalización, ya que cerca de los 60 °C la mayor
parte de las enzimas se inactivan y se ocasiona una disminución marcada en la
actividad catalítica, hecho que se aprovecha en la técnica de pasteurización.

EXPERIMENTO 1
Se prepara una serie de siete tubos como sigue:

Tubo
Reactivos 1 2 3 4 5 6 7
Sustrato almidón 8 mg/mL m --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
L
Solución reguladora de fosfatos m --- 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
0.02M, pH = 7 L
Agua destilada m 5 3 3 3 3 3 3
L
Preincubar 5 minutos a 25°C 5°C 25° 40° 50° 60° 92°
C C C C C
Enzima (sol. de amilasa) m --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
L

Conserve la solución de amilasa en baño de hielo.
• Todos los tubos se agitan muy bien y se colocan en sus respectivos baños
dejándolos durante 15 minutos al final de los cuales se les agrega, 1 mL del
reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico (este reactivo desarrolla un color rojo
caoba en presencia de azúcares reductores).
• Se agitan bien y se colocan en baño maría a ebullición por 10 minutos después
de lo cual se enfrían y se leen en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el
tubo no. 1 como blanco.
Con los datos obtenidos grafique la densidad óptica en las ordenadas y la temperatura
en las abscisas.
EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Tubo Temperatura Absorbancia
1 25 °C Blanco
2 5 °C
3 25 °C
4 40 °C
5 50 °C
6 60 °C
7 90 °C

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA


El pH es uno de los factores que más afectan la actividad de las enzimas, por
desnaturalización, o bien afectando su carga eléctrica.
El pH óptimo es aquel en el cual ciertos grupos funcionales poseen la carga apropiada
para asegurar la formación del complejo ES. Para la mayoría de las enzimas la activi
dad óptima se encuentra entre los valores de pH de 6 a 8. Sin embargo, para la pepsi
na del jugo gástrico es máxima a un pH de 1.5 que es muy ácido, o para la fosfatasa
alcalina que se encuentra en huesos y otros órganos y cuyo pH optimo es de 9.5.

EXPERIMENTO 2
Prepare una serie de 6 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la siguiente
tabla:
Reactivos Tubo
1 2 3 4 5 6
Sustrato (sol de almidón 8 mg/mL) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sol. reguladora al pH indicado 7 5 6 7 8 9
mL 4.5 4 4 4 4 4
Enzima (sol de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezcle e incube a 40°C por 15 minutos

• Terminado este lapso todos los tubos se agitan y se les agrega 1 mL de reactivo
de ácido dinitrosalicílico. Caliéntelos en un baño de agua hirviendo por 10
minutos. Este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares
reductores.
• Determine la concentración del azúcar reductor liberado, leyendo la densidad
óptica en el espectrofotómetro a 540 nm (Puede ser necesario diluir la mezcla
reaccionante 1 a 6 veces con agua antes de leer).

1)Basándose en sus resultados diga ¿Cuál es el pH óptimo de la amilasa?
2)¿Qué azúcar se libera en la hidrólisis de este polisacárido?
3)Resuma sus resultados en la siguiente tabla y trace con ellos la gráfica
correspondiente (D.O. contra pH)

pH y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
TUBO pH D.O.
1 7
2 5
3 6
4 7
5 8
6 9

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA Y DEL SUSTRATO SOBRE LA
VELOCIDAD DE REACCIÓN



Actualmente se acepta que la reacción enzimática se efectúa a través de la
formación de un complejo enzima – sustrato, lo cual puede representarse en forma
muy simplificada así: S + E [ES]  P + E
Si [E] es la concentración total de enzima y [ES] es la enzima combinada,
entonces [E – ES] es la concentración de enzima libre. Recordando la Ley de Acción
de Masas, tenemos:
V1 = K1 – [E – ES] [ES]; V2 = K2 – [ES]; V3 = K3 – [ES]

La velocidad de formación (Vf) del complejo [ES] depende de V1 mientras que la
velocidad de degradación (Vd) depende de V2 + V3. Por lo tanto en el equilibrio
tenemos: Vf = Vd es decir: V1 = V2 + V3
Sustituyendo sus valores nos queda:
K1[E – ES] [S] = K2[ES] + K3[ES]
Dividiendo ambos miembros entre K1 y [ES] nos queda:
K1[E – ES] [S] (K2 + K3)[ES]
---------------------------- = ------------------------------
K1[ES] K1[ES]
Simplificando:
[E – ES] [S] (K2 + K3)
--------------------- = ------------------ = KM constante de Michaelis
[ES] K1

La constante de Michaelis – Menten se utiliza como una medida de la afinidad
entre la enzima y el sustrato, aunque no es propiamente la constante de afinidad. La
constante de Michaelis – Menten (KM) se define como la concentración de sustrato
cuando la reacción adquiere la mitad de su velocidad máxima. Cuando esto sucede:
[E – ES] = [ES]
Y por lo tanto, sustituyendo: KM = [S]

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO
Si en una reacción enzimática se mantiene constante la concentración de la
enzima y todos los demás factores que pueden modificar la actividad, se observa
experimentalmente que al aumentar la concentración del sustrato, aumenta
progresivamente la velocidad de la reacción hasta llegar a un máximo (velocidad
máxima) después del cual ya no se afecta la velocidad aunque se trabaje a
concentraciones más altas de sustrato. En algunas enzimas se observa incluso una
disminución en la actividad si se aumenta demasiado la concentración de sustrato.

EXPERIMENTO 3
Prepare una serie de 8 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla:
Tubo
Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8
Sustrato (almidón 8 mg/mL) mL 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 7.5 7.5


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