Acidos nucleicos

1. ÁCIDOS NUCLEICOS
Constituyen el grupo de biomoléculas descubierto más recientemente (Friedrich Miescher,
1869) (Figura 1a). Su función biológica no quedó plenamente demostrada hasta 1944 (75
años después de su descubrimiento), año en que Avery, McLeod y McCarty por un lado y
Hershey y Chase por otro, demostraron que el DNA era la molécula portadora de la
información genética.
Los AN son polímeros lineales en los que la unidad repetitiva, llamada nucleótido, está
constituída por:
• una pentosa (la ribosa o la desoxirribosa)
• una base nitrogenada (purina o pirimidina)
• ácido fosfórico
La unión de estas bases a una pentosa constituye un nucleósido. La unión de tipo éster
entre un nucleósido y el ácido fosfórico se llama nucleótido (Figuras 1a y 1b).
Existen 2 tipos de ácidos nucleicos (AN): el ácido desoxirribonucleico (DNA) y el ácido
ribonucleico (RNA), y están presentes en todas las células. El DNA y el RNA se
diferencian porque (Figura 2):
• el peso molecular del DNA es generalmente mayor que el del RNA
• el azúcar del RNA es ribosa, y el del DNA es desoxirribosa
• el RNA contiene la base nitrogenada uracilo, mientras que el DNA presenta
timina
• la configuración espacial del DNA es la de una doble hebra helicoidal,
mientras que el RNA está formado, casi siempre, por una sola hebra lineal
LAS BASES NITROGENADAS
Las bases púricas tienen la estructura fundamental del heterociclo purina. Las bases
pirimidínicas derivan del anillo de pirimidina. Las bases púricas que se encuentran en
los AN (tanto DNA como RNA) son la adenina y la guanina. Las bases pirimidínicas de
los AN son uracilo y citosina en el RNA y timina y citosina en el DNA (Figuras 3a y
3b).
En ciertos casos aparecen otros tipos de bases nitrogenadas en los AN. En el RNA
transferente (RNAt) se encuentran a menudo bases como la N2-metilguanina, la N6-
metiladenina, la hipoxantina o el dihidroxiuracilo. En el DNA también se puede encontrar
5-metilcitosina o 5-hidroximetilcitosina (Figura 4).
Todas las bases mencionadas contienen la función lactama, que es una amida interna.
Esta función se puede convertir en la función lactima (imida interna) mediante un proceso
de isomería intramolecular denominado tautomería (Figura 5). En las condiciones
fisiológicas, el equilibrio está casi completamente desplazado hacia la forma lactama.
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2. Las bases nitrogenadas tienen poco interés bioquímico como sustancias libres, salvo en las
vías biosintéticas y degradativas de los AN. Una excepción importante es el ácido úrico
(Figura 6), un derivado púrico que constituye el producto final de la degradación de las
purinas. Normalmente se elimina por la orina, pero en circunstancias patológicas puede
cristalizar originando cálculos renales o la gota.
NUCLEÓSIDOS
Los nucleósidos son β-N-glicósidos de ribosa o desoxirribosa, en los que el sustituyente
en posición β del carbono 1 de la pentosa es una base púrica o pirimidínica (Figura 1a).
Los nucleósidos que contienen ribosa se llaman ribonucleósidos y los que contienen
desoxirribosa son los desoxirribonucleósidos. Por convención, la numeración de los
carbonos del anillo de la pentosa incluye un apóstrofo para diferenciarlos de los átomos de
los anillos de la base nitrogenada. Los ribonucleósidos más importantes son la adenosina
(A), guanosina (G), timidina (T), uridina (U) y citidina (C). Los desoxirribonucleósidos
reciben los mismos nombres, pero con el prefijo desoxi: desoxiadenosina (dA),
desoxiguanosina (dG), etc. (Figura 1b).
Los nucleósidos tienen poco interés bioquímico como sustancias libres, salvo en las vías
biosintéticas y degradativas de los AN. Una excepción importante es la S-
adenosilmetionina (SAM), que se forma por condensación de adenosina y metionina y es
un agente metilante muy enérgico (Figura 6).
NUCLEÓTIDOS
Los nucleótidos son ésteres fosfóricos de nucleósidos. El fosfato confiere carácter ácido a
la molécula y normalmente se encuentra esterificado al hidroxilo en posición 5', aunque,
excepcionalmente, también pueden hacerlo en 3' o en 2' (Figura 7). Los nucleótidos se
representan con la letra mayúscula correspondiente al nucleósido del que derivan más la
letra p minúscula, que repesenta al grupo fosfato y se antepone a la letra mayúscula de la
base si el fosfato está esterificado en posición 5' o se pone detrás si el fosfato está
esterificado en posición 3'. Así, el símbolo pA denota la adenosina-5'-fosfato, y el símbolo
Ap a la adenosina-3'-fosfato.
A veces, los nucleótidos contienen más de un grupo fosfato, unidos entre sí mediante un
enlace anhidro. En este caso, cada grupo se representa por una letra p. De esta forma, pAp
representa a la 5',3'-adenosina difosfato, ppA representa a la adenosina-5'-difosfato (ADP)
y pppA a la adenosina -5'-trifosfato (ATP).
Los nucleótidos trifosfato son particularmente importantes en el metabolismo, ya que la
hidrólisis de los enlaces fosfato (de alta energía) proporciona la energía necesaria para
impulsar multitud de procesos celulares. Las 3 moléculas de ácido fosfórico se distinguen
mediante los prefijos α, β y γ (Figura 8). Cada tipo de nucleótido trifosfato parece haberse
especializado en rutas metabólicas distintas:
• La energía libre almacenada en el ATP se utiliza para desarrollar trabajo mecánico
(contracción muscular), osmótico (transporte activo), químico (biosíntesis) y
eléctrico (transmisión del impulso nervioso)
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3. • La guanosina-5'- trifosfato (GTP, pppG) interviene en la síntesis de proteínas
• La uridina-5'- trifosfato (UTP, pppU) interviene en el metabolismo de los
glícidos
• La citosina-5'- trifosfato (CTP, pppC) interviene en el metabolismo lipídico
Los nucleótidos cíclicos, en los que el ácido ortofosfórico esterifica dos hidroxilos (el 3' y
el 5') de la misma ribosa, actúan como segundos mensajeros en la respuesta hormonal.
Los más comunes son la adenosina-3',5'-monofosfato o AMP cíclico (AMPc) la
guanosina-3',5'-monofosfato o GMP cíclico (GMPc) (Figura 9).
Otros nucleótidos actúan como coenzimas o grupos prostéticos:
• Los flavina-nucleótidos son grupos prostéticos de enzimas de
oxidorreducción. La flavina-mononucleótido (FMN) está compuesta por la
base flavina y el azúcar ribitol. La FMN puede unirse al AMP para formar la
flavina-adenina-dinucleótido (FAD), que también es un grupo prostético
(Figura 10).
• Otros nucleótidos que actúan como coenzimas en reacciones de
oxidorreducción son la nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD),
compuesta de la nicotinamida, AMP y ribosa, y la nicotinamida-adenina-
dinucleótido-fosfato (NADP), que además contiene ácido fosfórico (Figura
11).
• La coenzima A está compuesta por ácido pantoténico (una vitamina), β-
mercaptoetilamina y una molécula de ADP (Figura 12). Interviene en
reacciones de acilación, en las que el grupo acilo entrante se incorpora a la
coenzima A mediante un enlace tioéster, muy reactivo.
POLINUCLEÓTIDOS
Los polinucleótidos son cadenas lineales de nucleótidos unidas por enlaces fosfodiéster.
En este tipo de enlace, los grupos fosfato están esterificados a los hidroxilos 5' y 3' de dos
nucleótidos consecutivos (Figuras 13a y 13b).Cada polinucleótido contiene un OH libre
en el grupo fosfato en posición 5' (extremo 5') y un OH libre en posición 3' (extremo 3').
En la cadena de un polinucleótido se pueden distinguir dos partes:
• el esqueleto azúcar-fosfato: es la parte común a todos los polinucleótidos de igual
longitud. Consiste en una secuencia alternante de pentosas y ácido fosfórico,
unidos entre sí mediante enlaces de tipo éster. Es la parte más hidrofílica de la
molécula y está cargada negativamente (Figuras 13a y 13b).
• la secuencia de bases nitrogenadas: es lo que distingue a un polinucleótido de
otro. Por convención, la secuencia de bases de un polinucleótido se escribe
siempre en la dirección 5'→ 3' (Figuras 13a y 13b).
Los dos polinucleótidos que se pueden encontrar en los seres vivos son el ácido
ribonucleico (RNA) y el ácido desoxirribonucleico (DNA).
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4. En la síntesis de DNA o de RNA (Figura 14):
• El nucleótido que se añade a la cadena de polinucleótido debe estar en
forma trifosfato, ya que para formar el enlace fosfodiéster se necesita energía
• El enlace fosfodiéster se forma entre el OH del grupo fosfato α del
nucleótido trifosfato entrante y el grupo OH en posición 3' del último
nucleótido de la cadena de polinucleótido
• Cuando se forma el enlace fosfodiéster se libera un grupo pirofosfato (Pi-Pi)
ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA)
Es el AN más abundante en la célula. Una célula típica contiene 10 veces más RNA que
DNA. El azúcar presente en el RNA es la ribosa. Esto indica que en la posición 2' del
anillo del azúcar hay un grupo hidroxilo (OH) (Figura 13a). Por este motivo, el RNA es
químicamente inestable, de forma que en disolución acuosa se hidroliza fácilmente
(Figura 15). En el RNA la base que se aparea con la A es U, a diferencia del DNA, en el
cual la A se aparea con T. En la mayor parte de los casos es un polímero monocatenario,
en el que, en ciertos casos, se pueden observar zonas en su secuencia con apareamientos
intracatenarios. Recientemente se han descubierto RNA bicatenarios.
Puede purificarse fácilmente y se distinguen varios tipos de RNA en función, sobre todo,
de sus pesos moleculares:
• El RNA heterogéneo nuclear (RNAhn) es un RNA de alto peso molecular,
presente en el núcleo de las células eucariotas. Se le considera como precursor de
los demás tipos de RNA que se encuentran en el citoplasma ya que es el RNA que
se origina directamente durante el proceso de transcripción. Por este motivo se
le suele llamar también transcrito primario. La fragmentación del RNAhn para
formar otros tipos de RNA constituye la maduración o procesamiento del RNA
(en inglés, splicing) (Figura 16).
• El RNA pequeño nuclear (RNAsn) está presente en el núcleo, y es de pequeño
tamaño. Aparentemente, tiene actividad catalítica (se trata, por tanto de una
ribozima) e interviene en los procesos de maduración del RNAhn (Figura 17).
• El RNA transferente (RNAt) tiene un peso molecular aproximado de 25 kDa (75-
90 nucleótidos). Se conocen unos 60 RNAt distintos, y se encuentran en todas las
células. Pueden contener nucleótidos poco usuales (ácido pseudouridílico, ácido
inosílico) e incluso bases características del DNA como la timina. Presenta un
plegamiento complejo, denominado plegamiento en hoja de trébol, en el que la
cadena de polinucleótido presenta alternancia de zonas lineales y zonas apareadas.
Cada RNAt posee un triplete de bases denominado anticodón, que se une por
complementariedad de bases a un codón del RNA mensajero. Por su extremo 3'
están unidos a un aminoácido. Es, por tanto, una molécula clave en el proceso de
traducción (o síntesis de proteínas) ya que determina qué aminoácido se va a
incorporar en la secuencia de una proteína durante el proceso de traducción
(Figura 18).
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5. • El RNA ribosómico (RNAr) está presente en los ribosomas, orgánulos
intracelulares implicados en la síntesis de proteínas. Se conocen 3 ó 4 tipos
distintos de RNAr. Su estructura presenta un plegamiento complejo que le
permite asociarse tanto a las proteínas integrantes de los ribosomas como a otros
RNAr y participar en el proceso de traducción (Figura 19). También presentan
actividad catalítica.
• El RNA mensajero (RNAm) se sintetiza sobre un molde de DNA y sirve de pauta
para la síntesis de proteínas. Su peso molecular es alto y contiene únicamente los
nucléotidos A, U, G y C. Sus extremos 5' y 3' sufren diversas modifiaciones para
evitar su degradación. Además de codificar la secuencia de una proteína,
contiene las señales para el inicio y la terminación de la síntesis proteica (Figura
20a). Es el Código Genético quien establece la correspondencia entre los codones
del RNA mensajero y el aminoácido que codifican (Figura 20b).
• El RNA vírico (RNAv) es el que constituye el patrimonio genético de ciertos virus
como el bacteriófago MS2, el virus del mosaico del tabaco, el poliovirus, el virus
de la rabia, el virus de la gripe o el virus del SIDA (Figura 21).
• El RNA interferente pequeño (RNAsi) se ha descubierto recientemente. Se trata
de segmentos cortos de RNA bicatenario que se asocian a una proteína
denominada RISC. El complejo RISC-RNAsi se asocia a un RNAm con una
secuencia complementaria a una de las hebras del RNAsi. Esta asociación provoca
la destrucción del ARNm y de esta manera se regula la expresión del gen a nivel
post-transcripcional (Figura 22). Este mecanismo se denomina "silenciamiento
génico" y sus descubridores (Andrew Z. Fire y Craig C. Mello) recibieron el
Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2006.
Es muy probable que el RNA fuese el primer biopolímero que apareció sobre la Tierra.
En un ambiente similar al que debió existir en la Tierra primitiva pudieron formarse
espontáneamente cadenas cortas de RNA, pero no de DNA o proteínas. Además, se
conocen casos en los que las moléculas de RNA se cortan y empalman por sitios
específicos, en ausencia de proteínas. Estas moléculas de RNA con actividad catalítica se
denominan ribozimas. Estos primitivos mecanismos de maduración del RNA
contribuyeron probablemente a que se consiguiera con éxito la primera síntesis de
proteína dirigida por una cadena de polinucleótidos (un gen) (Figura 23). En una etapa
posterior, a partir del RNA se formaría el DNA, que llegaría a convertirse en un depósito
seguro de información genética, ya que se trata de una molécula químicamente más
estable.
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6. ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)
Los primeros estudios físicos del DNA mediante la técnica de difracción de rayos X
fueron realizados por Maurice Walkins y Rosalind Franklin a primeros de la década de
1950. Estos estudios pusieron de manifiesto que (Figura 24):
• la molécula de DNA es una cadena extendida con una estructura altamente
ordenada
• la molécula de DNA es helicoidal y tiene 20 Å de diámetro
• la hélice del DNA está compuesta por dos hebras helicoidales
• las bases de los nucleótidos están apiladas con los planos separados por una
distancia de 3,4 Å
El análisis químico del contenido molar de las bases de DNA procedente de diversos
organismos reveló que en todos los casos [A]=[T] y que [G]=[C], o lo que es lo mismo,
[A+G]=[T+C] ([purinas]=[pirimidinas]). Esta es la llamada ley de Chargaff (Figura 25).
En 1953, James Watson y Francis Crick combinaron los datos químicos y físicos del
DNA, y propusieron un modelo en el que las dos hebras están enrolladas una alrededor de
la otra formando una doble hebra helicoidal. Las dos cadenas de polinucleótido se
mantienen equidistantes, al tiempo que se enrollan en torno a un eje imaginario. Cada
hebra tiene una orientación diferente: A cada lado de la doble hélice de DNA, el extremo
3'-OH de una de las hebras se enfrenta al extremo 5' de la otra. En otras palabras, las dos
hebras son antiparalelas. La doble hélice es dextrógira. Esto quiere decir que si alguien
mira a la molécula a lo largo de su eje longitudinal, en cualquier dirección, cada hebra
sigue una trayectoria en el sentido de las agujas del reloj a medida que se aleja del
observador (Figura 26a).
En este modelo, el esqueleto azúcar-fosfato (la secuencia alternante de desoxirribosa y
fosfato, unidos por enlaces fosfodiéster 5'-3') sigue una trayectoria helicoidal en la parte
exterior de la molécula mientras que las bases se dirigen desde la cadena al eje central
imaginario. Las bases de una hebra están enfrentadas con las de la otra, formando los
llamados pares de bases (PB). Las dos bases que forman un PB están en el mismo plano y
dicho plano es perpendicular al eje de la hélice. Las parejas formadas son siempre una
purina y una pirimidina, de forma que ambas cadenas están siempre equidistantes, a unos
11 Å una de la otra. Los PB adoptan una disposición helicoidal en el núcleo central de la
molécula, ya que presentan una rotación de 36º con respecto al par adyacente (Figura
26b), de forma que hay 10 PB por cada vuelta de la hélice. Las bases se unen entre sí
mediante puentes de hidrógeno. La A se empareja siempre con la T mediante dos
puentes de hidrógeno, mientras que la C se empareja siempre con la G por medio de 3
puentes de hidrógeno (Figura 26c).
El apareamiento de bases es una de las características más importantes de la estructura
del DNA porque significa que las secuencias de bases de ambas hebras son
complementarias. Este hecho tiene implicaciones muy profundas con respecto al
mecanismo de replicación del DNA, ya que la separación de las dos hebras del DNA y la
síntesis de las hebras complementarias da lugar a dos moléculas iguales a la original.
La hélice presenta dos surcos helicoidales externos, uno de ellos ancho y profundo
(surco mayor) y el otro estrecho y poco profundo (surco menor). Las proteínas que
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7. interaccionan con el DNA lo hacen, mayoritariamente, por el surco mayor, que es lo
suficientemente amplio como para permitir que las moléculas proteicas entren en contacto
con las bases (Figura 27).
Esta estructura descrita por Watson y Crick es la que adopta el DNA en condiciones de
humedad elevada (92% de humedad relativa) y corresponde al B-DNA. Sin embargo, el
DNA puede adoptar otras estructuras (Figura 28):
• A-DNA: Es la estructura que adopta cuando está menos hidratado (65-75% de
humedad relativa). En este caso, el diámetro de la molécula es mayor y los pares
de bases están más juntos y ya no son perpendiculares al eje de la molécula,
sino que adoptan un ángulo de unos 20º.
• Z-DNA: Es una estructura que se encuentra cuando alternan purinas y pirimidinas
en la secuencia. En este caso, el diámetro de la molécula es menor y las cadenas
principales de la molécula discurren en "zig-zag" (de ahí su nombre) con una
trayectoria levógira.
Esta estructura de doble hélice del DNA no es la más habitual. En las células eucariotas,
el DNA forma la cromatina. En la cromatina, el DNA se enrolla en torno a unas proteínas
llamadas histonas empaquetándose de forma muy compacta (Figura 29). En procariotas,
así como en las mitocondrias y cloroplastos, el DNA se presenta en forma circular, en la
que la doble hélice se cierra por sus extremos. Este DNA circular puede presentar diversos
grados de superenrrollamiento (Figura 30). En virus, el DNA puede presentarse como una
doble hélice cerrada, como una doble hélice abierta o simplemente como una única hebra
lineal.
En cuanto a la composición de bases en el DNA, la relación A=T y C=G siempre se
cumple, pero no hay regla que rija las concentraciones totales de G+C y de A+T.
Normalmente la composición de bases de una molécula de DNA de un organismo se
expresa como su contenido en G+C. En organismos superiores, este valor está próximo a
0,5, pero en los organismos inferiores (bacterias) este valor varía mucho de un género a
otro. Así, en el género Clostridium es de 0,27; en Sarcina es de 0,76 y en Escherichia es
de 0,5.
FACTORES QUE DETERMINAN LA ESTRUCTURA DEL DNA
La estructura helicoidal del DNA se mantiene gracias a interacciones no covalentes. Por
un lado, el apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece
interacciones hidrofóbicas entre éstas, y por otro lado, cada base está unida a su pareja
mediante puentes de hidrógeno (Figura 31). Esta configuración ordenada, que es
presumiblemente la que se encuentra en la naturaleza, se denomina estructura nativa. Si
se calienta un DNA de doble hebra desaparecen las interacciones no covalentes que
estabilizan su estructura helicoidal nativa y las dos hebras se separan y adoptan un estado
desorganizado denominado estructura desnaturalizada. La transición entre el estado
nativo y el desnaturalizado se conoce como desnaturalización. El DNA desnaturalizado,
por tanto, es de una sola hebra. Si se deja enfriar una disolución de DNA monocatenario
(desnaturalizado), se vuelve a formar el DNA nativo (de doble hebra). Este proceso recibe
el nombre de renaturalización del DNA (Figura 31).
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8. La forma más corriente de desnaturalizar el DNA es por calentamiento. Otro agente
desnaturalizante es el pH elevado porque cambia la carga de algunos grupos que forman
parte de los puentes de hidrógeno. En agua destilada (con una fuerza iónica muy
reducida) también se produce la separación de las hebras. Este fenómeno se debe a que en
agua muy pura, la fuerte repulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfato no es
contrarrestada por los correspondientes contraiones (Na+, Mg+2).
Las bases de los ácidos nucleicos absorben fuertemente la luz de 260 nm. La cantidad de
luz absorbida depende de la proximidad entre las bases. Cuando las bases están muy
próximas entre sí (como en el DNA de doble hebra) absorben menos luz que cuando se
encuentran en un DNA de hebra sencilla o que en el caso de las bases nitrogenadas libres
en disolución. Así, si una disolución de DNA de doble hebra tiene una A260 = 1, la misma
concentración de una disolución de DNA de una sola hebra presenta una A260 =1,37, y la
misma concentración de bases nitrogenadas libres tiene una A260 de 1,6.
La desnaturalización del DNA se puede detectar observando el aumento de la absorción
de luz ultravioleta con una longitud de onda (λ) de 260 nm (A260) que se produce al
aumentar la temperatura. Este aumento en la A260 a medida que se desnaturaliza el DNA
se llama efecto hipercrómico. El efecto inverso (disminuye A260 al renaturalizarse el
DNA) se llama efecto hipocrómico.
La gráfica que representa la medida de A260 en función de la temperatura se llama curva
de fusión del DNA (Figura 32a). Esta curva presenta las siguientes características:
• La A260 permanece constante hasta temperaturas bien por encima de las
fisiológicas. En este intervalo, la molécula está en forma de doble hebra.
• El aumento de A260 tiene lugar en un estrecho rango de temperaturas (6-8 ºC). La
A260 empieza a aumentar cuando comienzan a romperse las uniones entre las
bases en varios segmentos de la molécula. El número de PB que se rompen
aumenta con la temperatura, y con ella la A260. Al final del tramo ascendente, las
dos hebras se mantienen juntas por unos cuantos PB.
• La A260 máxima es aproximadamente un 37% mayor que el valor inicial, y
corresponde al estado en que las dos hebras están completamente separadas.
Un parámetro muy útil para caracterizar la evolución de la fusión es la temperatura a la
que el aumento de la A260 ha llegado a la mitad de su camino. Esta temperatura se llama
temperatura de fusión (Tm). Se ha comprobado que la Tm aumenta con el contenido
de G+C. Como el par de bases G-C está unido por tres puentes de hidrógeno (a diferencia
del par A-T que sólo presenta 2) se requiere una temperatura más alta para
desnaturalizarlo (Figura 32b). Los reactivos que incrementan la solubilidad de las
bases disminuyen la Tm, ya que reducen la interacción hidrofóbica que las mantiene
unidas. De esto se deduce que tanto los puentes de hidrógeno como las interacciones
hidrofóbicas cooperan para formar una estructura estable. Si se reduce o elimina
cualquiera de estas interacciones, la estabilidad disminuye y la Tm es menor (Figura 32b).
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9. Una disolución de DNA desnaturalizado puede ser tratada de forma que recupere su
configuración nativa. El proceso se llama renaturalización, y se obtiene un DNA
renaturalizado. Para que tenga lugar la renaturalización deben cumplirse dos requisitos:
• La concentración salina debe ser alta ([NaCl] entre 0,15 y 0,5 M) para eliminar la
repulsión entre los grupos fosfato de las dos hebras.
• La temperatura deber ser lo suficientemente elevada como para romper los
puentes de hidrógeno intracatenarios producidos al azar en el DNA
monocatenario, y lo suficientemente baja como para estabilizar los apareamientos
correctos entre las bases de hebras distintas. La temperatura óptima de
renaturalización es de unos 20 a 25 ºC por debajo de la Tm.
La renaturalización es un fenómeno de unión al azar y, por tanto, una molécula de DNA
renaturalizada no tiene por qué estar formada por las hebras originales (Figura 33). Si
mezclamos un DNA marcado con el isótopo 15N con otro que contenga el isótopo normal
14N y los desnaturalizamos, durante la renaturalización se forman 3 tipos de moléculas de
doble hebra: un 25% con 14N en las dos hebras, un 25% con 15N en las dos hebras y un
50% con una hebra 14N y otra 15N.
Cuando el DNA renaturalizado se forma a partir de moléculas de DNA de distinto origen
o a partir de una molécula de DNA y otra de RNA, la renaturalización se conoce como
hibridación (Figura 33).
PROPIEDADES BIOLÓGICAS DEL DNA
En las células eucariotas, el DNA está presente en el núcleo, así como en mitocondrias y
cloroplastos. Cada cromosoma eucariota contiene una única molécula de DNA cuya masa
molecular es enorme: aproximadamente de 2 × 106 dalton por µm de longitud. En
procariotas, el DNA se encuentra en el citoplasma celular. Tanto en unos como en otros,
la molécula de DNA es el soporte material de los caracteres hereditarios de una
especie y es trasmitida íntegramente a la progenie. El modelo de Watson y Crick explica
las propiedades biológicas del DNA:
• Resistencia a la alteración de las bases (mutación): Si aparece una base
incorrecta, su emparejamiento se ve impedido, y la doble hélice se altera. Estos
errores pueden ser reparados por medio de diversos mecanismos celulares, ya que
la hebra complementaria conserva la información (Figura 34).
• Duplicación del material genético (replicación): Las células hijas tienen la
misma dotación genética que su progenitora. Para obtener esta duplicación exacta,
basta la separación de las dos cadenas de la doble hélice y la síntesis de las
complementarias (Figura 35).
• Expresión de la información genética (transcripción): La complementariedad
de bases permite a la célula utilizar una hebra de DNA como molde para sintetizar
una molécula de RNA con la misma secuencia que su hebra de DNA
complementaria (Figura 36a). En los organismos eucariotas, el transcrito primario
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10. sufre un proceso de maduración que genera los principales tipos de RNA celulares:
RNAm, RNAr y RNAt (Figura 36b).
LOS ÁCIDOS NUCLEICOS COMO MATERIAL GENÉTICO
Hasta mediados de los años 40 había fuertes controversias sobre la naturaleza química del
material hereditario. Si alguna biomolécula podía ser candidata a ser el material genético,
éstas eran las proteínas con su estructura tan compleja y variada. Moléculas tan simples y
repetitivas como los ácidos nucleicos no eran, a priori, candidatos idóneos como
portadores del material genético. Esta controversia fue resuelta en la década de los 40
mediante dos brillantes experimentos.
1.- EXPERIMENTO DE AVERY, McLEOD Y McCARTY
En 1928, Frederick Griffith (1879-1941) describió el fenómeno de transformación por
neumococos. Se distinguen dos tipos de neumococos:
• Los neumococos de tipo R (rugoso) forman colonias de aspecto rugoso sobre un
medio sólido, y son poco virulentos, de modo que si se le inyectan a un ratón, éste
sobrevive (Figura 37).
• Los neumococos de tipo S (liso) forman colonias de aspecto liso y brillante sobre
un medio sólido, y provocan infecciones letales. Se caracterizan por poseer una
cápsula de polisacáridos en la superficie celular que las protege del sistema
inmunitario del huésped y provocan infecciones que matan al animal en 3 ó 4 días.
Estos neumococos son sensibles a la temperatura y se les puede matar por
calentamiento (Figura 37).
Si a un ratón se le inyectan neumococos de tipo S muertos (sometidos a calentamiento),
el animal sobrevive (Figura 37), pero si se le inyectan conjuntamente neumococos vivos
de tipo R y neumococos muertos de tipo S, se produce la muerte del ratón, y de la
infección se pueden extraer neumococos vivos del tipo S (Figura 37).
La conclusión de Griffith fue que los neumococos de tipo S muertos contenían un "factor
de transformación" que había convertido a los neumococos R vivos en neumococos S
vivos que había provocado la muerte del animal.
En 1944, Avery, McLeod y McCarty (Figura 38) demostraron que el factor de
transformación del neumococo era el ácido desoxirribonucleico (DNA). Su estrategia
consistió en hacer un fraccionamiento de las biomoléculas presentes en los neumococos
de tipo S muertos. Trabajaban con cultivos puros de neumococo R a los que añadían
distintos componentes de neumococos S muertos (los polisacáridos de la pared, las
proteínas, el RNA y el DNA). Sólo se producía el fenómeno de transformación cuando
se añadía a los neumococos R el DNA de los neumococos S muertos. Este DNA era
captado por los neumococos R vivos y los transformaban en neumococos S vivos y
letales.
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11. Esta conclusión se vio reforzada por otra serie de experimentos encaminados a demostrar
que la fracción que contenía el DNA de los neumococos S muertos no estaba
contaminada por otros tipos de biomoléculas. Se inyectó al ratón:
• neumococos R vivos + DNA de neumococos S muertos + proteasas (enzimas
que destruyen las moléculas de proteína): el ratón muere
• neumococos R vivos + DNA de neumococos S muertos + ribonucleasas
(enzimas que destruyen el RNA): el ratón muere
• neumococos R vivos + DNA de neumococos S muertos + desoxirribonucleasas
(enzimas que destruyen el DNA): el ratón sobrevive
Esta serie de experimentos no deja lugar a dudas sobre la naturaleza del factor de
transformación, que es un DNA y no una proteína como se sospechaba en aquella época.
2.- EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE
Los bacteriófagos (o fagos) son virus que atacan a las bacterias. Los fagos de la serie T-
par (T2, T4 y T6) atacan a la enterobacteria Escherichi coli. Estos fagos constan de una
cabeza proteica que alberga en su interior una molécula de DNA. De la cabeza surge un
tallo que acaba en una serie de filamentos (Figura 39). Tanto el tallo como los filamentos
están formados por proteínas. Como estos fagos contienen únicamente DNA y proteínas,
el problema de determinar cuál de los dos alberga la información genética se aborda de
forma más directa que en el experimento anterior.
El virus es capaz de reconocer a determinadas proteínas de la superficie de las bacterias
susceptibles y se unen a ellas. Una vez fijados a la superficie celular, inyectan el
contenido de la cabeza (el DNA) en el interior de la bacteria. Este DNA se aprovecha de
la maquinaria biosintética de la bacteria para crear varios cientos de copias de sí mismo y
de las proteínas que componen el virus. Una vez completada la síntesis, el DNA y las
proteínas se ensamblan para formar nuevas copias del virus. Al final del proceso, la
bacteria se destruye (lisis) y los nuevos virus son liberados al medio donde pueden iniciar
nuevos ciclos de infección. Toda esta serie de acontecimientos constituyen el llamado
ciclo lítico del fago (Figura 39).
Como los virus de la progenie heredan los caracteres fenotípicos del virus primitivo,
Hershey y Chase diseñaron un sistema para averiguar si la información necesaria para
crear nuevas copias del virus era transmitida por el DNA o por las proteínas. Utilizaron
técnicas de marcaje radioactivo para construir dos poblaciones de bacteriófagos T2
distintas (Figura 40):
• Una población de fagos creció en un medio que contenía 35S. El 35S marca a las
proteínas que contienen residuos de Cys o Met y por lo tanto, esta población
contiene proteínas radioactivas y DNA no radioactivo, ya que el DNA no
contiene S
• La segunda población de virus creció en un medio que contenía 32P. El 32P marca
los ácidos nucleicos, pero no a las proteínas, de forma que esta población contiene
DNA radioactivo y proteínas no radioactivas
Ambos tipos de virus fueron utilizados por separado para infectar a células de E. coli
susceptibles. Después de la infección y antes de que se completara el ciclo lítico
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12. sometieron a las células a una fuerte agitación mecánica (con una batidora de vaso) para
desprender de la superfice de la célula a todos los virus que pudiesen estar adheridos, y
después, por centrifugación, separaron las células de las partículas víricas. Las células,
más pesadas que las envolturas víricas y con el material genético del virus en su interior,
se acumularon en el fondo del tubo. A continuación midieron la radioactividad asociada
a las células.
Las células presentaban radioactividad únicamente cuando se hacía el experimento
con la población de fagos que creció en presencia de 32P (y cuyo DNA era radioactivo).
Cuando se realizaba el experimento con la población de fagos que creció en presencia de
35S (y cuyas proteínas eran radioactivas), las células no contenían radioactividad (Figura
40). Como los virus que surgen de ambos ciclos líticos son absolutamente normales, este
experimento indica que las características genéticas del fago han sido comunicadas a
la progenie mediante el DNA, no mediante la proteína.
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