Artículo hecho en colaboración con la Facultad de Medicina de la UAS

1. Boletín Médico - Facultad de Medicina UAS
Artículo Original
Determinación de la actividad de macrófagos
peritoneales mediante la producción de óxido
nítrico en ratones expuestos crónicamente al
plaguicida metamidofos
Dra. en C. Blanca Rosa Noriega Ortega1, M. en C. Ernesto Armienta Aldana2, Biól. José
Ángel Cervantes Pompa2, Dr. en C. Eduardo Armienta Aldana3
1
Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Sinaloa. 2 Departamento de Histología y
Embriología, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Sinaloa. 3 Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad
Autónoma de Sinaloa.
RESUMEN
Objetivo. El objetivo del presente trabajo fue determinar la actividad de macrófagos peritoneales mediante la producción de oxido nítrico en ratones
expuestos crónicamente al plaguicida metamidofos (O,S-dimetil fosforoamidotioato).
Material y Métodos. Se utilizaron ratones de la cepa Balb/c, se determinó la DL50 del plaguicida metamidofos, la actividad de macrófagos se valoró
mediante la determinación de la secreción de oxido nítrico en animales expuestos (2.6 mg/kg, s. c. c/3° día) y testigos en diferentes tiempos de exposición
4, 24, 28 y 36 semanas.
Resultados. Los fagocitos mononucleares provenientes de ratones tratados con metamidofos secretan más ON ( 3.70 ± 1.0 µM/ml ) que las células
provenientes de grupos testigos ( 1.4 ± 0.39 µM/ml ) ( p<0.001 ).
Conclusión. La exposición crónica del plaguicida organofosforado metamidofos en ratones Balb/c incrementa en macrófagos peritoneales la secreción
de ON.
Palabras clave: macrófagos, oxido nítrico, metamidofos.
ABSTRACT
Objective. In the present work were determinate peritoneal macrophage activity by production of nitric oxide chronic exposed mice with methamidophos
pesticide (O,S-dimethyl phosphoramidothioate).
Material and Methods. Were used Balb/c mice. LD50 of methamidophos was determined. Macrophage activity was measure by determination of nitric
oxide control and experimental mice (2.6 mg/kg, s. c. c/3° day) at different times of exposition 4, 24, 28 and 36 weeks.
Results. Phagocytes mononuclear of exposed mice with methamidophos were secreted more NO (3.70 ± 1.0 µM/ml ) that not exposed cells ( 1.4 ± 0.39
µM/ml ) ( p<0.001 ).
Conclusions. Chronic exposed at pesticide methamidophos in Balb/c mice increased level of NO in peritoneal macrophage.
Key Words: macrophages, nitric oxide, methamidophos.
Bol Med UAS, Num. 18 Vol.2 • agosto - octubre de 2007 7

2. Boletín Médico - Facultad de Medicina UAS
INTRODUCCIÓN de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iONS) o
Los plaguicidas son productos químicos con diversos constitutiva, esta enzima genera el ON a partir de la guanina
mecanismos de acción 1 . Los organofosforados son nitrogenada de la L-arginina 12-13 . La producción de ON es
mundialmente los más utilizados en la agricultura, entre los un determinante esencial en la señalización autócrina y
que se encuentra el metamidofos, el cual produce inhibición parácrina. Participa en una gran variedad de actividades como
de la acetilcolinesterasa. Desafortunadamente ninguno de los por ejemplo, en la neurotransmisión, en la homeostasis
plaguicidas utilizados en la actualidad está exento de efectos vascular, en la destrucción de microorganismos, así mismo
tóxicos en animales y humanos, y como todo producto puede servir como molécula citotóxica en el camino de
químico, su toxicidad depende de la dosis y tiempo de necrosis y en las células del sistema inmune regula la apoptosis
exposición. Algunos plaguicidas pueden influir en la respuesta tanto en sentido positivo como negativo, además es mediador
inmune 2-6. El sistema inmune se define como aquel que de citostasis inducida por Mϕs 14-16 .
mantiene la integridad molecular del individuo, reconoce lo El metamidofos es un plaguicida organofosforado de
propio de lo no propio y conserva la homeostasis del los más utilizados en la agricultura por su efectividad y por
hospedero para consigo mismo, como para con el medio no acumularse en el medio ambiente, a pesar de esto, no
ambiente. Para lograr lo anterior el sistema inmune esta dotado existe información del efecto que puede tener sobre el sistema
de una serie de factores solubles y de un componente celular inmune específicamente en el sistema Mϕs y su respectiva
compuesto de células de la serie mieloide y linfoide 7 . producción de ON; por lo que en el presente trabajo se valoró
El sistema de células monocito-macrófagos (Mϕs), la respuesta inmune por determinación de la actividad de
primera línea de defensa contra agentes patógenos y células macrófagos peritoneales mediante la producción de óxido
tumorales, se originan en la médula ósea a partir de las células nítrico en ratones expuestos crónicamente al plaguicida
formadoras de granulocitos-monocitos (GM-CFU) de la serie metamidofos.
mieloide, a través del torrente sanguíneo migran a diferentes
tejidos de donde se diferencian gracias a la combinación de MATERIAL Y MÉTODOS
citocinas y factores de crecimiento como el factor estimulante Químico
de colonias de macrófagos (M-CSF) a osteoclastos, células El plaguicida OGF metamidofos de nombre comercial
de Langerhans, microglias, Mϕs peritoneales, pleurales y Tamaron® 600 formulado como líquido soluble a base de
alveolares, células de Kupffer y Mϕs asociados a tumor 8 . metamidofos (O,S-dimetil fósforoamidotioato) se obtuvo de
Las células Mϕs participan principalmente en tres actividades: los laboratorios Bayer de México, para su uso agrícola
homeostasis, inflamación y inmunológica. Para efectuar estas (metamidofos al 48.3 % eqiv. a 600 g de i.a./L; categoría
actividades los monocitos-macrófagos participan en toxicológica: II). Antes de su aplicación se disolvió en solución
numerosas funciones fundamentales tales como inflamación, de cloruro de sodio (NaCl 0.85 M).
fiebre, fagocitosis, activación de células T, selección de función
de las células T, reorganización de tejidos, lesión de tejidos y Animales de Experimentación
actividad tumoricida. Los Mϕs se encuentran en los tejidos Se utilizaron grupos de 10 ratones Balb/c machos de 3
como residentes, en estado que se considera de reposo, esto meses de edad, de 22 a 25 gramos de peso para cada prueba.
significa que aunque son capaces de ejercer las funciones que Los ratones se mantuvieron en jaulas de polipropileno con
les corresponden, estas son ejecutadas con toda la capacidad. temperatura controlada de 23±2ºC y humedad relativa de
En la actualidad se conoce que para alcanzar su máxima 85±5 por ciento, con ciclos de 12 horas de luz fluorescente
capacidad deben ser activados generalmente por de espectro de luz solar (vita-lite) y se alimentaron con alimento
lipopolisácarido (LPS) e interféron gamma (INFγ) generando comercial para ratones (purinas) y agua.
diferentes productos de secreción 9-11 . El sistema Mϕs
produce óxido nítrico (ON) un oxidante que tiene un par de
Patrón de Exposición
electrones no apareados, el ON por sí mismo no se considera
Para determinar la dosis del plaguicida a la cual fueron
un radical libre oxidante, sin embargo, reacciona con el O2
expuestos los animales de experimentación, se determinó
molecular para formar O2. -, H2O2 y otras variedades reactivas.
mediante una curva dosis-respuesta. Se usaron varios grupos
En el Mϕs el ON es producido por acción de moléculas
de 10 ratones, para encontrar la dosis letal media (DL50) del
inductoras, con el INFγ, factor de necrosis tumoral alfa
plaguicida con diferentes concentraciones siguiendo el método
(TNFα), IL-1 y el LPS. Cuando estas moléculas se unen a sus
de Miller y Tainter 17 .
respectivos receptores activan factores de transcripción en el
Mϕs, tales como el factor NF-kB, induciendo la transcripción
8 Bol Med UAS, Num. 18 Vol.2 • agosto - octubre de 2007

3. Boletín Médico - Facultad de Medicina UAS
a) Ratones expuestos: Se aplicó el plaguicida en una
dosis de 2.6 mg/Kg, a un grupo de 10 ratones a las 4, 24, 28
y 36 semanas, diluido en cloruro de sodio por vía subcutánea
cada tercer día.
b) Ratones testigos. Se trabajaron con las mismas
características, pero sin exposición al plaguicida.
Inducción de Óxido Nítrico y Cultivo de
Macrófagos
Obtención de macrófagos peritoneales (MP): para tal
efecto todos los animales fueron inyectados por vía
intraperitoneal (i.p.) con 1 ml de tioglicolato estéril. A las 96
horas después los MP se obtuvieron mediante lavado de la
cavidad peritoneal se utilizó solución salina balanceada de
Hanks (SSBH) pH 7.4 a 4 °C con 2 % de albumina humana.
Posteriormente, estás células se lavaron en tres ocasiones y se Análisis Estadístico
resuspendieron en medio de cultivo RPMI-1640 adicionado La información se represento mediante el promedio ±
con 10 % de suero fetal de ternera y antibióticos (RPMI-S). la desviación estándar de los valores obtenidos de 10
observaciones independientes del grupo testigo y el expuesto
Se valoró la viabilidad de los macrófagos con el colorante de
durante las 36 semanas del experimento. La comparación
exclusión azul de tripano (>95 %), además se confirmó la
estadística entre los grupos se efectuó mediante la prueba t
estirpe celular mediante la ingestión de partículas de latex, no
Student, con un valor significativo de p<0.001 tanto para el
se aceptaron poblaciones con menos del 90 % de pureza.
grupo testigo como para el expuesto.
Para valorar la inducción de ON y cultivo de MP se empleó
la descrita por Nathan (1992).
RESULTADOS
A fin de permitir la adherencia de los MP, se incubaron
El estado de activación de los MP procedentes de
1 × 106 células/ml por 2 horas en cajas de cultivo de 24
ratones expuestos al metamidofos se valoró mediante la
pozos (NUNC) en un volumen de 1 ml de RPMI-S a 37 °C determinación de la secreción de ON, nuestros resultados
en atmósfera de CO2 al 5 %, se lavaron las placas para retirar muestran claramente que los fagocitos mononucleares
las células no adherentes y se incubaron nuevamente en las provenientes de ratones tratados con metamidofos secretan
mismas condiciones durante 24 horas con 1 ml del mismo más ON ( 3.70 ± 1.0 µM/ml ) que las células provenientes
medio de cultivo adicionado de 100 U/ml de INFγ y 5 mg/ de grupos testigos ( 1.4 ± 0.39 µM/ml ) ( p<0.001 ), sin
ml de lipopolisacárido (LPS) para estimular la secreción de embargo esta capacidad de secretar ON disminuye
ON. Al término de la incubación cuidadosamente se paulatinamente con las semanas de exposición al metamidofos,
recuperaron 400 µl de sobrenadante de cultivos de MP. Se pero continua significativamente mayor que en el grupo
valoró la cantidad de nitritos en el sobrenadante de los cultivos control, así pues a la semana 36 solamente se alcanza a detectar
con el reactivo de Griess en un espectrofotómetro a 543 nm 2.59 ± 0.39 µM/ml de ON ( p<0.001 ) (gráfica 1).
de longitud de onda (λ).
A las monocapas de macrófagos de animales expuestos
crónicamente con el plaguicida metamidofos y estimulados
con LPS + INFγ se les consideró el grupo experimental.
Este grupo fue acompañado de los siguientes controles:
monocapas de MP cultivados únicamente con medio de
cultivo, macrófagos activados a los cuales se les añadió el
bloqueador NG monometil-L-arginina 25 µM (NMMA), el
cual inhibió la producción de ON. Los resultados se hicieron
por triplicado y los datos representan los promedios de 10
experimentos independientes y se expresan como µM/ml
(Ver diagrama de flujo).
Bol Med UAS, Num. 18 Vol.2 • agosto - octubre de 2007 9

4. Boletín Médico - Facultad de Medicina UAS
CONCLUSIONES En el caso del plaguicida metamidofós se desconocía si
Los macrófagos juegan un importante papel en el este organofosforado pudiera ocasionar efectos negativos
sistema inmune, representa la primera línea de defensa contra sobre el sistema inmune específicamente en el sistema Mϕs y
agentes patógenos y células tumorales en el organismo 8. su respectiva producción de ON, no obstante se sabía que es
Participan en numerosas funciones fundamentales tales como un producto altamente tóxico, induce la formación de
inflamación, fiebre, fagocitosis, activación de células T, micronúcleos, neuropatía retardada, ocasiona serios daños
selección de función de las células T, reorganización de tejidos, histopatológicos en hígado, mutagenicidad, produce efectos
lesión de tejidos y actividad tumoricida entre otras actividades en hormonas masculinas y un aumento en la prevalecía de
en el organismo. Estás células cuando están activadas secretan aneuploidía en los espermas 24. Nuestras observaciones
una gran variedad de componentes entre ellos el ON producto muestran que conforme pasa el tiempo de exposición al
que interactúa con una gran variedad de células de diferentes plaguicida estas células secretan mayor cantidad de ON esto
orígenes 9-11. El ON desempeña una importante función en indica un estado de actividad diferente al de reposo en que
procesos fisiológicos y patológicos del sistema inmune, generalmente se encuentran estas sin que podamos afirmar
cardiovascular y nervioso. Es sintetizado en grandes cantidades con nuestros resultados un estado completo de activación.
por macrófagos activados, para la eliminación de bacterias, Sin embargo, nuestras observaciones nos permiten pensar
virus y protozoarios, así como de células tumorales 14. También que los macrófagos son blanco del metamidofos y que
participa en procesos de homeostasis, regulación del flujo resultaría por demás interesante un estudio ad doc al respecto
sanguíneo, neurotransmisión, modulación de la función y que la exposición crónica al metamidofos en ratones Balb/
pulmonar y de la motilidad ciliar 16. Sin embargo, una excesiva c incrementa en macrófagos peritoneales la secreción de ON.
y no regulada producción de ON se ha relacionado como
un importante factor contribuyente en muchas enfermedades REFERENCIAS
en el ser humano tales como: choque vascular, diabetes, artritis, 1.- Routt Reigart J, Roberts JR. Reconocimiento y manejo de los
inflamación crónica, Alzheimer, Huntington, isquemia cerebral, envenenamientos por pesticidas. 5a edición. Editorial U.S. Enviromental
Parkinson, epilepsia, esclerosis lateral amiotrófica y demencias Protection Agency 1999; 40-54.
relacionadas con el sida 18-22. Actualmente se considera que el 2.- Vial T, Nicolas B, Descotes J. Clinical immunotoxicity of pesticides. J
Toxicol Environ Health 1996; 48:215-229.
ON es capaz de generar daño en el ADN y otras
3.- Thomas PT. Pesticide-induced immunotoxicity: are Great Lakes
biomoléculas y de esta forma mediar el surgimiento y residents at risk. Environ Health Perspect 1995; 103:55–61.
desarrollo tumoral 23 . El metabolismo del ON genera 4.- Tiafenbach B, Lange P. Studies on the action of dimethoate on the
productos como los nitritos, nitratos, radicales libres y immune system. Arch Toxicol J 1980; 4:167.
nitrosotioles 16. Numerosos procesos patológicos que van 5.- Allien AC, Koller LD, Polloch GA. Effect of toxaphene exposure on
desde daños celulares hasta la muerte celular se deben al immune resposes in mice. Veterinary Med J Toxicol Environ Health
aumento de radicales libres en el organismo 24. 1983; 11:1.
Se ha observado que ciertos plaguicidas pueden inducir 6.- Seth PK, Jaffery FN, Khanna VK. Toxicology. Ind J Pharmacol 2000;
un daño en el sistema inmune específicamente en los 32: s134-s151.
macrófagos y un aumento en la producción de ON 18,25-26. El 7.- Langman RE. The immune system. Academic Press, IMC, San Diego
California. 1989.
toxafeno, compuesto organoclorado, en ratones produce
8.- Dunn DL, Baarke RA and Williams JD. Macrophages and
depresión de la respuesta inmune con disminución de la translymphatic absorption represent the first line of host defense of the
capacidad fagocítica de los macrófagos 5. El dieldrín, otro peritoneal cavity. Arch Surg 1987; 122: 105-110.
organoclorado, inhibe la resistencia natural a la Salmonella 9.- Topley N, Mackenzie RK, Williams JD. Macrophages and mesothelias
thyphimurium en cepas de ratones resistentes y semirresistentes cells in bacterial peritonitis. Immunobiology 1996; 195: 563-573.
a este microorganismo 27-28. La acción secuencial de los 10.- Jackson PG, Evans Stephen RT. Intraperitoneal macrophages and
organofosforados induce el fenómeno de sensibilidad química tumor immunity: a review. J of Surg Oncology 2000; 75: 146-154.
múltiple por la inactivación de la acetilcolinesterasa y esto 11.- Nathan CF. Secretory products of macrophages. J Clin Invest 1987;
induce a su vez un aumento en la estimulación de los receptores 79 (2): 319-326.
muscarínicos lo cual provoca un incremento en la producción 12.- Roitt y Cols. Immunology, 4a ed. San Luis, Mosby, 1996.
13.- Murray PR, Rosenthal KS, Koba YG, Pfaller MA. Microbiología Médica.
de ON 18,25. Los organofosforados afecta el balance ionico
4a ed. Mosby, 2002.
intracelular particularmente la homeostasis de calcio, el cual 14.- Pozo D, Bitzer-Quintero OK, Osuna C, García-Pergañeda A, Calvo
parece ser un blanco de los mediadores de ON 26. JR, Ortiz GG, Guerrero JM. Producción de óxido nítrico y su
modulación en el sistema inmune y el sistema nervioso. Arch Neurocien
1998; 3 (2): 84-94.
10 Bol Med UAS, Num. 18 Vol.2 • agosto - octubre de 2007

5. Boletín Médico - Facultad de Medicina UAS
15.- Meij JTA, Haselton CL, Hillman KL, Muralikrishnan D, Ebadi M, Yu L. 23.- Upham BL, Wagner JG. Toxicant induced oxidative stress in cancer.
Differential mechanisms of nitric oxide and peroxynitrite induced cell Toxicol Sci 2001; 64:1-3.
death. Mol Pharmacol 2004; 66: 1043-1053. 24.- Noriega BR, Armienta E, Cervantes JA. Evaluación de estrés oxidativo
16.- Serrano C, Valero A, Picado C. Óxido nítrico nasal. Arch Bronconeumol en ratones expuestos crónicamente a un plaguicida organofosforado.
2004; 40 (5): 222-230. Boletín Médico de la Facultad de Medicina 2007; 2 (15) : 8 -11.
17.- Miller LC, Tainter ML. Graphical method for determination of LD50. 25.- Jeyarasasingam G, Yeluashvili M, Quik M. Nitric oxide is involved in
Proc Soc Exp Biol Med 1944; 57: 261-271. acetylcholinesterase inhibitor induced myopathy in rats. J Pharmacol
18.- Pall ML. NMDA sensitization and stimulation by peroxynitrite, nitric Exp Ther 2000; 295 (1): 314-320.
oxide and organic solvents as the mechanism of chemical sensitivity in 26.- Casares FM, Mantione KJ. Pesticides may be altering constitutive
multiple chemical sensitivity. FASEB J 2002; 16: 1407-1417. nitric oxide release, thereby compromising health. Med Sci Monit
19.- Díaz D. Óxido nítrico, mutagénesis y cancer. Rev Cubana Invest 2006; 12 (10): RA235-240.
Biomed 2004; 23 (3): 184-189. 27.- Jolicoeur P, Fournier M, Krzystyniak K. Suppression of microbicidal
20.- Qureshi GA, Baig S, Sarwar M, Parvez SH. Neurotoxicity, oxidative activity of peritoneal exudate by sublethal dieldrin exposure of outbred
stress and cerebrovascular disorders. Neurotoxicol 2004; 25: 121- and inbred mice. Pesticide-Biochemistry and phisiology. Index-
138. veterinarius 1990; 31: 203-212.
21.- Queiroz CES, Soares JA, Leonardo RT, Carlos IZ, Dinelli W. 28.- Bachowski S, Xu Y, Stevenson DE, Walborg, Jr EF, Klauning JE.
Evaluation of cytotoxicity of two endodontic cements in a macrophage Role of oxidative stress in the selective toxicity of dieldrin in the mouse
culture. J Appl Oral Sci 2005; 13 (3): 237-242. liver. Toxicol and Applied Pharmacol 1998; 150: 301-309.
22.- Shavali S, Combs CK, Ebadi M. Reactive macrophages increase
oxidative stress and alpha-synuclein nitration during death of
dopaminergic neuronal cells in co-culture: relevance to Parkinson´s
disease. Neurochemical Research 2006. 31(1):85-94.
Bol Med UAS, Num. 18 Vol.2 • agosto - octubre de 2007 11