ỨNG DỤNG CỦA CHIẾT PHA RẮN SPE TRONG VIỆC NÂNG CAO KẾT QUẢ PHÂN TÍCH Y DƯỢC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH

1. “Ứng dụng của chiết pha rắn
SPE trong việc nâng cao kết
1
SPE trong việc nâng cao kết
quả phân tích y dược"

2. SPE là một công nghệ chuẩn bị mẫu có sử
dụng hạt rắn, vật liệu cơ bản dựa trên
nguyên lý của sắc ký, là quá trình phân bố
của các chất giữa 2 pha, trong đó lúc đầu
chất mẫu ở dạng lỏng (pha nước, hay
Chiết pha rắn là gì?
2
chất mẫu ở dạng lỏng (pha nước, hay
hữu cơ), chất chiết ở dạng rắn, dạng hạt
nhỏ và xốp đường kính 25 - 70 µm được
nhồi trong 1 loại thiết bị cột để tách các
thành phần khác nhau của 1 mẫu.
chiết pha rắn (Solid Phase Extraction ), hay chiết rắn-lỏng

3. Điều kiện chiết pha rắn SPEĐiều kiện chiết pha rắn SPE
Tính chọn lọc của pha tĩnh chiết.
Các chất chiết và dung môi rửa giải phải có độ sạch cao
Hệ số phân bố nhiệt động Kfb của cân bằng chiết phải lớn
Quá trình chiết phải xẩy ra nhanh và nhanh đạt cân bằng, nhưng
không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn
3
không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn
và chất phân tích.
Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch
Không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích trong quá trình chiết
bởi bất kỳ từ nguồn nào.
Sự chiết phải được thực hiện trong điều kiện nhất định phù hợp,
phải lặp lại được tốt và tất nhiên là càng đơn giản dễ thực hiện
thì càng tốt.

4. Kết hợp SPE với một số thiết bị hiện đạiKết hợp SPE với một số thiết bị hiện đại
4

5. MSMS EIC 20 ng/mL SalbutamolMSMS EIC 20 ng/mL Salbutamol –– 1 mL Urine 78:20:2 Elution Solvent1 mL Urine 78:20:2 Elution Solvent
(Dichloromethane:Isopropanol:Ammonium Hydroxide)(Dichloromethane:Isopropanol:Ammonium Hydroxide)
RT: 0.00 - 4.00
40
60
80
100
RelativeAbundance
0
20
40
60
80
100
RelativeAbundance
1.90
1.97
NL: 7.80E6
m/z= 221.60-222.60 F:
+ c ESI w Full ms2
240.10@32.00 [
65.00-500.00] MS 81
cerex
NL: 7.80E6
m/z= 221.60-222.60 F:
+ c ESI w Full ms2
240.10@32.00 [
65.00-500.00] MS 81
certify
50.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
Time (min)
0
20
40
60
80
100
RelativeAbundance
0
20
40
60
80
100
RelativeAbundance
0
20
40
RelativeAbundance
1.95
1.20
1.94
NL: 7.80E6
m/z= 221.60-222.60 F:
+ c ESI w Full ms2
240.10@32.00 [
65.00-500.00] MS 81
clean scrn
NL: 7.80E6
m/z= 221.60-222.60 F:
+ c ESI w Full ms2
240.10@32.00 [
65.00-500.00] MS 81
oasis
CLEAN SCREEN®

6. Abundance
2000000
4000000
6000000
Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3788.D
2000000
4000000
6000000
Abundance
Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3790.D
PC: CONDOA BEG-TMS CleanScreen10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS CleanScreen
So sánh k t qu thu h i Benzoylecgonine t 1ml nư c ti u ng a
( quá trình làm s ch đư ng n n b ng chi t pha r n)
6
5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00
0
Time-->
5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00
0
Time-->
5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00
0
2000000
4000000
6000000
Time-->
Abundance
Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3793.D
5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00
0
2000000
4000000
6000000
Time-->
Abundance
Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3795.D
PC: CONDOA BEG-TMS Cerex
10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS Cerex

7. Kỹ thuật chiết pha rắn
được coi là “bước nhảy
vọt” trong xử lý mẫu
N i dung
7
N i dung
1. Thi t b SPE
2. Cơ ch SPE
3. K thu t SPE
4. Tính kh thi c a k thu t SPE

8. THIẾT BỊTHIẾT BỊ
8

9. 9
Cartric, c t nh i đơn gi n

10. Chất nhồi cột SPEChất nhồi cột SPE
10

11. Thiết bị đi kèm SPEThiết bị đi kèm SPE
11

12. Thiết bị SPE kết nốiThiết bị SPE kết nối
12

13. Cơ chếCơ chế
13

14. 1. Phân cực1. Phân cực
2. Không phân cực2. Không phân cực
2.1.2.1. CácCác kiểukiểu tươngtương táctác chínhchính
3. Trao đổi ion3. Trao đổi ion
4. Cộng hóa trị4. Cộng hóa trị
5. Liên kết polyme5. Liên kết polyme
14

15. 2.2. Phân loại cơ chế2.2. Phân loại cơ chế
Pha
thường
Pha đảo
Cơ chế
Chiết rây
phân tử
Trao đổi
ion
Trao đổi
cation
Trao đổi
anion
15

16. 2.2.1.2.2.1. ChiếtChiết phapha thườngthường NPENPE
Tính năng chính pha tĩnh: ái lực mạnh, phân cực (liên kết H)Tính năng chính pha tĩnh: ái lực mạnh, phân cực (liên kết H)
Liên kết liên quan: piLiên kết liên quan: pi--pi và tương tác lưỡng cựcpi và tương tác lưỡng cực
Chất hấp phụ:Chất hấp phụ: -- silica, diol, diethylamino, cyanopropylsilica, diol, diethylamino, cyanopropyl
Ứng dụng tách:Ứng dụng tách: -- Chất béo, chất phụ gia giàu, carbohydrates,Chất béo, chất phụ gia giàu, carbohydrates,
16
Ứng dụng tách:Ứng dụng tách: -- Chất béo, chất phụ gia giàu, carbohydrates,Chất béo, chất phụ gia giàu, carbohydrates,
phenols, vitamins tan trong dầuphenols, vitamins tan trong dầu
Phân tích:Phân tích: -- amines, hydroxyls, carbonyls, vòng thơm, các dịamines, hydroxyls, carbonyls, vòng thơm, các dị
tố (O, S, N, P)tố (O, S, N, P)
Hỗn hợp:Hỗn hợp: -- Không phân cực, hữu cơKhông phân cực, hữu cơ
Dung môi rửa giải:Dung môi rửa giải: -- Trung bình đến phân cực caoTrung bình đến phân cực cao

17. 2.2.2.2.2.2. ChiếtChiết phapha đảođảo RPERPE
Tính năng chính pha tĩnh: Kỵ nước, không phân cựcTính năng chính pha tĩnh: Kỵ nước, không phân cực
Lực liên kết: Lực Vabvander, lực phân tánLực liên kết: Lực Vabvander, lực phân tán
Chất hấp phụ:Chất hấp phụ: -- C2, C3,C4, iC4, tC4, C5, C6, C7, C8,C2, C3,C4, iC4, tC4, C5, C6, C7, C8,
C10, C12, C18, C20, C30 phenyl, cyclohexylC10, C12, C18, C20, C30 phenyl, cyclohexyl
17
Ứng dụng:Ứng dụng: -- Dược phẩm, Thuốc trừ sâuDược phẩm, Thuốc trừ sâu
Phân tích:Phân tích: -- Chất trung tính hoặc proton hóa, vòng thơm,Chất trung tính hoặc proton hóa, vòng thơm,
chuỗi ankylchuỗi ankyl
Nền mẫu (maxtric):Nền mẫu (maxtric): -- Sinh học, nước, dung dịch đệmSinh học, nước, dung dịch đệm
Dung môi rửa giải:Dung môi rửa giải: -- Không phân cực đến phân cực yếuKhông phân cực đến phân cực yếu

18. Nguyên lý pha đảoNguyên lý pha đảo
18

19. 2.2.3. Chiết rây phân tử (loại cỡ, gel)2.2.3. Chiết rây phân tử (loại cỡ, gel)
CácCác chấtchất hấphấp thuthu làlà cáccác hạthạt silicagensilicagen cócó diệndiện tíchtích bềbề mặtmặt
lớn,lớn, trêntrên bềbề mặtmặt hạthạt silic,silic, cócó cáccác maomao quảnquản kíchkích thướcthước lỗlỗ
lớn,lớn, 275275--300300AAoo..
ÁpÁp dụngdụng:: ChiếtChiết táchtách cáccác hợphợp chấtchất cócó khốikhối lượnglượng lớnlớn cỡcỡ
19
20002000DD
TươngTương táctác:: ĐiĐi vàovào lỗlỗ xốpxốp nhờnhờ tươngtương táctác phânphân cực,cực, kỵkỵ nướcnước
hayhay traotrao đổiđổi ionion.. ThíThí dụdụ chấtchất hấphấp thụthụ kỵkỵ nướcnước kiểukiểu butylbutyl vớivới
hàmhàm lượnglượng CacbonCacbon nạpnạp khoảngkhoảng 66%%,, loạiloại kháckhác làlà cócó gắngắn
nhómnhóm traotrao đổiđổi ionion ––COOH,COOH, hàmhàm lượnglượng CC khoảngkhoảng 1212,,22%%

20. CộtCột chiếtchiết C8C8 vàvà polymepolyme
((ápáp dụngdụng chiếtchiết phapha đảođảo))
20
Time (minutes)Time (minutes)
00 44 88 1212 1616 2020
Time (minutes)
00 44 88 1212 1616 2020
C8C8
ColumnColumn
CopolymericCopolymeric
ColumnColumn

21. Ảnh hưởng của độ dài chuỗiẢnh hưởng của độ dài chuỗi
(Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE)(Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE)
1
2
3
4
5
3.0e
4
2.0e
1
2
3
4
53.0e
4
2.0e
21
Butabarbital 64%
Amobarbital 87%
Pentobarbital 88%
Secobarbital 89%
Glutethimide 78%
96%
94%
94%
96%
98%
C18 C2
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8
4
1.0e
4
0
4
1.0e
4
0
0 2 4 6 8
endogenous
peaks:
area = 71,628
endogenous
peaks:
area = 11,257

22. 1
2
3
4
5
IST
D
3.0e
4
2.0e
4
1
2
3
4
5
IST
D
3.0e
4
2.0e
4
ẢnhẢnh hưởnghưởng củacủa loạiloại mạchmạch
((KếtKết quảquả sausau khikhi làmlàm sạchsạch mẫumẫu bằngbằng SPE)SPE)
22
Butabarbital 93%
Amobarbital 97%
Pentobarbital 98%
Secobarbital 98%
Glutethimide 96%
1
2
3
4
5
28%
73%
84%
98%
70%
Ct4 Cn4Cn4Cn4Cn4
1
0 2 4 6 8 10
1.0e
4
0
0 2 4 6 8 10
1.0e
4
0
Đ nh n i sinh
area = 18,271
Đ nh n i sinh:
area = 1,336

23. 2.2.4.2.2.4. CơCơ chếchế traotrao đổiđổi ionion
Tương tác ion xảy ra giữa chất hấp phụ và chất phân tích
Duy trì pH thích hợp cho quá trình phân tích
Liên kết ion đủ mạnh, giữ lại chất phân tích
Loại bỏ các chất bẩn bằng dung môi thích hợp
23
Loại bỏ các chất bẩn bằng dung môi thích hợp
Dung môi rửa giải có lực kéo mạnh hơn hoặc thay đổi pH
Cơ chế rửa giải bằng cách đồng thời phá vỡ tất cả các tương tác
Có 2 loại trao đổi ion là trao đổi cation và trao đổi anion

24. pKa, pH & trạng thái ion hóapKa, pH & trạng thái ion hóa
2<2< 1<1< at pKaat pKa 1>1> 2>2>
% hợp chất ở trạng thái ion
Ch cCh c Tr ngTr ng tháithái ionion
24
AcidAcid Anion (Anion (--)) 11 99 5050 9191 9999
BaseBase Cation (+)Cation (+) 9999 9191 5050 99 11
Phase Modification Key feature
SB (SAX) quaternary amine strongly basic anion exchanger
SA (SCX) benzenesulphonic acid strongly acidic cation exchanger
PCA (WCX) propylcarboxylic acid weakly acidic cation exchanger
PSA propylsulphonic acid very strong cation exchanger

25. Chiết trao đổi cation
Chất trao đổi cation tích điện âm
Chất phân tích mạng điện tích dương
Hình thành liên kết mới
Chất hấp phụ
– Benzenesulfonic acid (mạnh)
– Propylsulfonic acid (mạnh)
25
– Propylsulfonic acid (mạnh)
– Carboxylic acid (yếu)
Áp dụng: Dược phẩm, thuốc diệt cỏ
Phân tích
– Amines
– Pyrimidines (cations)
Nền mẫu – nước
Dung môi rửa giải trung hòa chất phân tích

26. Chiết trao đổi anion
Chất hấp phụ trao đổi anion mang điện tích dương
Chất phân tích có tính axit mang điện tích âm
Hình thành liên kết
Chất hấp phụ
– Amin bậc 1, 2
– Aminopropyl (yếu)
– Quaternary amine (mạnh)
26
– Quaternary amine (mạnh)
– Diethylamino (yếu)
Áp dụng: phosphates, thuốc có tính axit, axit hữu cơ, axit béo, vitamins
Phân tích
– Phosphates
– Carboxylic acids
– Sulfonic acids (cations)
Nền mẫu – nước
Dung môi rửa giải có tính axit để trrung hòa chất phân tích

27. Cột trao đổi anion
Silica Backbone
Quaternary Amine anion exchanger
Acetate counter ion
(Standard anion exchanger carries Cl-
)
CAQAX
27
Độ chọn lọc CHQAX
Silica Backbone
Quaternary Amine anion exchanger
Acetate counter ion
(Standard anion exchanger carries Cl-
)

28. Kh năng thay th c a các ion
Cations Anions
Ba2+
8.7
Ag2+
7.6 Benzene Sulfonate 500
Pb2+
7.5 Citrate 220
Hg2+
7.2 I -
175
Cu+
5.3 Phenate-
110
Sr2+
4.9 HSO4
-
85
Ca2+
3.9 CIO3
-
74
Ni2+
3.0 NO3
-
65
Cd2+
2.9 Br-
50
Cu2+
2.9 CN -
28
2+ -
Strong Cation Exchanger
SO-
3
Si
Độ chọn lọc ion
28
Cu 2.9 CN 28
CO2+
2.8 HSO -
27
Zn2+
2.7 BrO 27
Cs2+
2.7 NO2 24
Rb+
2.6 CI -
22
K+
2.5 HCO3
-
6.0
Fe2+
2.5 IO33
-
5.5
Mg2+
2.5 Formate -
4.6
Mn2+
2.3 Acetate -
3.2
NH4
+
1.9 Propionate -
2.6
Na+
1.5 F -
1.6
H+
1.0 OH -
1.0
Li+
0.8
Benzenesulfonic Acid (BCX)
Strong Anion Exchanger
Quaternary Amine (QAX)
Si
- Si - (CH2)3 N
+
(CH3)3

29. Polymer đư c th hóa b
m t
(-CH-CH2)n-
N-CH3
C=O
R
R
29
C=O
CH3
R

30. Polymer đư c th hóa b
m t
(-CH-CH2)n-
N-CH3
C=O
R
R
C=O
CH3
SO3H or CH2N+R3
SO3H or
CH2N+R3

31. 5
43
2
1
2
3 4
5
ẢnhẢnh hưởnghưởng củacủa pHpH đếnđến khảkhả
năngnăng thuthu hồihồi khikhi dùngdùng cộtcột SPESPE
31
1
pH 6 pH 5Ibuprofen
Meprobamate
Glutethimide
Phenobarbital
Phenytoin
1
2
3
4
5

32. Kỹ thuậtKỹ thuật
32
Kỹ thuậtKỹ thuật

33. Quy trình chiết SPEQuy trình chiết SPE
Hoạt hóa cột
Đưa mẫu phân tích lên cột
33
Loại tạp chất
Rửa giải (giải hấp) chất phân
tích

34. Bước 1
Hoạt
hóa cột
Làm ướt vật liệu nhồi
Loại không khí trong các khoảng
trống trong lớp chất của cột
34
hóa cột
sắc ký
Không được để chất trong cột bị
khô
…

35. Bước 2
Mẫu phân
tích được
Chất phân tích được đưa lên cột
Một vài thành phần ảnh hưởng
khác cũng có thể bị giữ lại
Các thành phần không tương
35
tích được
chảy qua
cột
Các thành phần không tương
tác bị loại ra làm sạch chất phân
tích

36. Bư c 3
Loại bỏ các
chất gây
Giữ lại chất phân tích
Nếu mẫu là dung dịch nước, sử
dụng dung dịch đệm hoặc hỗn
hợp nước-dung môi hữu cơ
36
chất gây
ảnh hưởng Nếu mẫu hoà tan trong dung
môi hữu cơ thì khi rửa cột có
thể sử dụng chính dung môi đó

37. Bước 4
Giải hấp
chất phân
Dung môi được chọn đặc trưng
để phá vỡ tương tác giữa chất
phân tích và chất hấp phụ với
mục đích rửa giải được chất
phân tích với hiệu quả cao
37
chất phân
tích bằng
dung môi
thích hợp
phân tích với hiệu quả cao
Dung môi sử dụng rửa giải đồng
thời càng ít chất gây ảnh hưởng
tới phép phân tích càng tốt.

38. MeprobamateMeprobamate
NHNH22 CC
OO
OO CHCH22 CC
CHCH33
CHCH33
OO CC
OO
CHCH22 NHNH22
38
Polar Drug
Copolymeric DAU Column

39. Ảnh hưởng của dung môi rửaẢnh hưởng của dung môi rửa
giải đến độ thu hồigiải đến độ thu hồi
Hexane/Ethyl Acetate Methylene Chloride
11 22
39
Ibuprofen
Meprobamate22
11
11 22
11 22

40. Amphetamine StructuresAmphetamine Structures
CHCH22 CHCH NHNH
22
CHCH33
AmphetamineAmphetamine
pKa = 9.9pKa = 9.9
MethamphetamineMethamphetamine
40
CHCH22 CHCH NHNH22
CHCH33
CHCH33
CC CC NN CHCH33
OHOH CHCH33
HH HH HH
MethamphetamineMethamphetamine
pKa = 9.9pKa = 9.9
EphedrineEphedrine
pKa = 9.6pKa = 9.6

41. Ảnh hưởng của dung môi rửaẢnh hưởng của dung môi rửa
giải đến độ thu hồigiải đến độ thu hồi
1 d-Amphetamine
2 d-Methamphetamine
3 PPA
4 Pseudoephedrine
5 Meperidine
6 Lidocaine
7 PCP
22
33
44
41
7 PCP
8 Methadone
9 Propoxyphene
10 Cocaine
11 Codeine
12 Diazepam
13 Nordiazepam
14 Chlordiazepoxide
Elution:
MeCl2 / IPA / NH4OH
(78/20/2)
11
33

42. 1 d-Amphetamine
2 d-Methamphetamine
3 PPA
4 Pseudoephedrine
5 Meperidine
6 Lidocaine
7 PCP
Ảnh hưởng của dung môi rửaẢnh hưởng của dung môi rửa
giải đến độ thu hồigiải đến độ thu hồi
42
7 PCP
8 Methadone
9 Propoxyphene
10 Cocaine
11 Codeine
12 Diazepam
13 Nordiazepam
14 Chlordiazepoxide
Elution:Elution:Elution:Elution:
EA / NH4444OH
(98/2)
11
22
33
44

43. ROBINUL
(GLYCOPYRROLATE)
FROM EQUINE
URINE BY SPE-LCMSMS
500 mg / 14 mL
Hoạt hóa cột
1. 2 x 2.5 ml MeOH
2. 2 x 2.5 ml đệm phosphat (0.1M, pH 7.0)
Chuẩn bị mẫu
1. 5 ml nước tiểu + 3 ml đệm phosphate (0,1M , pH 7.0)
2. Thêm 12.5 (ng) of mepenzolate (chuẩn nội)
3. Thêm 5 ml H2O
4. Lắc, ly tâm 5 phút (800v/phút)
5. Đưa dịch trong lên cột SPE
43
Loại tạp
1. 5 ml MeOH
2. 5 ml H2O
Rửa giải
4 ml MeOH + 4 ml ammoni
acetate (0,5M, pH 3.0)
GLYCOPYRROLATE

44. LCMSMS of GlycopyrrolateLCMSMS of Glycopyrrolate
44

45. Ví dụ
Chiết nhanh
hàm lượng
45 Chuẩn bị mẫu
1 mL sản phẩm rau quả hòa tan trong 2 ml nước.
Điều kiện cột
Cột C18 SPE (nhồi khoảng 3ml) được hoạt hóa với 1 mL
methanol và một thể tích tương đối nước cất
Thêm mẫu/rửa:
Đưa mẫu phân tích lên cột khoảng 5 mL, nước cất được sử
dụng loại bỏ đường và axit hữu cơ.
chất sơ trong
sản phẩm rau
dụng loại bỏ đường và axit hữu cơ.
Rửa giải:
Chất khô [anthocyanines, flavonoids, tannins and/or
alkaloids] được rửa giải với một lượng metanol.Thêm một
chút propanol-2 sẽ cho kết quả tót hơn.
Phân tích
Dùng quang phổ để phân tích dịch chiết.
Sử dụng bản mỏng TLC.

46. Đưa mẫu lên
trên cột tách
46

47. Rửa loại bỏ
chất bẩn
47

48. Rửa giải
48

49. Thảo luậnThảo luận
49
Thảo luậnThảo luận

50. 4.1. Phạm vi ứng dụng4.1. Phạm vi ứng dụng
Môi trườngMôi trường
»» Nước, đấtNước, đất
Dược phẩm, y họcDược phẩm, y học
»» Thuốc, nước tiểu, máuThuốc, nước tiểu, máu
50
»» Thuốc, nước tiểu, máuThuốc, nước tiểu, máu
Thực phẩmThực phẩm
»» Nước hoa quả, bảo quản, sữaNước hoa quả, bảo quản, sữa
Hóa sinhHóa sinh
»» Nước, nước tiểuNước, nước tiểu

51. LLELLE SPESPE
DùngDùng 200200--500500 mlml dungdung môimôi
QuáQuá trìnhtrình lắclắc liênliên tụctục
Dùng 2Dùng 2 -- 20 ml dung môi20 ml dung môi
Quá trình lọcQuá trình lọc
4.2. So sánh phương pháp4.2. So sánh phương pháp
HìnhHình thànhthành nhũnhũ tươngtương
ĐộĐộ chọnchọn lọclọc thấpthấp
ThờiThời giangian 11 -- 22 giờgiờ // mẫumẫu
Quá trình lọcQuá trình lọc
Không hình thành nhũ tươngKhông hình thành nhũ tương
Độ chọn lọc caoĐộ chọn lọc cao
Thời gian 10Thời gian 10 -- 20 phút / mẫu20 phút / mẫu
51

52. 4.2. Ưu điểm4.2. Ưu điểm
Có tính chọn lọc đối với một nhóm hợp chất phân tíchCó tính chọn lọc đối với một nhóm hợp chất phân tích
Cân bằng chiết nhanh đạt được và có tính thuận nghịch,Cân bằng chiết nhanh đạt được và có tính thuận nghịch,
Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất,Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất,Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất,Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất,
Thao tác đơn giản và nhanh hơn các kỹ thuật chiết khác,Thao tác đơn giản và nhanh hơn các kỹ thuật chiết khác,
Trong quá trình chiết luôn luôn có cả sự làm giầu chất phân tích,Trong quá trình chiết luôn luôn có cả sự làm giầu chất phân tích,
Chất chiết pha rắn không đắt (khoảng 50.000 đ.VN/1cột chiết)Chất chiết pha rắn không đắt (khoảng 50.000 đ.VN/1cột chiết)
52

53. Ưu điểmƯu điểm
Tinh chế nguyên liệu loại tạp chấtTinh chế nguyên liệu loại tạp chất
Kết hợp với nhiều phương pháp khác cho kết quả cao:Kết hợp với nhiều phương pháp khác cho kết quả cao:
SPE + HPLC, SPE + GCMSSPE + HPLC, SPE + GCMSSPE + HPLC, SPE + GCMSSPE + HPLC, SPE + GCMS
Thu hồi các chất phân tích với hiệu suất caoThu hồi các chất phân tích với hiệu suất cao
Dễ tự động hóa, phù hợp với sắc kDễ tự động hóa, phù hợp với sắc kyy
Giảm lượng dung môi hữu cơ dẫn đến giảm giá thànhGiảm lượng dung môi hữu cơ dẫn đến giảm giá thành
53

54. 4.3. Vi chiết pha rắn4.3. Vi chiết pha rắn
54

55. Khái niệm
Dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích X giữa hai
pha không trộn lẫn vào nhau trong đó pha mẫu chứa chất X
là chất lỏng, còn pha chiết là chất rắn.
Pha chiết (que chiết) là các hạt chất rắn xốp cỡ hạt vàiPha chiết (que chiết) là các hạt chất rắn xốp cỡ hạt vài
micromet được tẩm lên thanh que nhỏ kim loại hay PE
(1x4mm) tạo thành lớp màng chất chiết dầy khoảng 0,3-
0,5mm bao xung quanh tạo ra que chiết.
Que chiết được để trong hệ xylanh và kim tiêm có thể cắm
qua chiết vào qua nút cao su của bình chứa mẫu cần chiết. 55

56. Kiểu chiết và cơ chế chiếtKiểu chiết và cơ chế chiết
Kiểu chiết
Không gian mẫu
(chất ở dạng lỏng)
Cơ chế chiết
Hấp phụ pha thường
(chất chiết pha thường)(chất ở dạng lỏng)
Không gian hơi
(chất dễ hóa hơi)
(chất chiết pha thường)
Hấp phụ pha ngược
(chất chiết pha ngược)
56

57. Các bướcCác bước
57

58. 58

59. 59

60. 60

61. 61

62. 62

63. 63

64. 64

65. 65

66. THANKS!THANKS!THANKS!THANKS!
66

67. TAX Column % Recovery of PbTAX Column % Recovery of Pb
at Various Concentrationsat Various Concentrations
80
100
120
67
0
20
40
60
80
0.250 ppm 0.050 ppm 1.00 ppm 2.00 ppm

68. Metal Recoveries on Various PhasesMetal Recoveries on Various Phases
Cu (ll)Cu (ll) Zn (ll)Zn (ll) As (V)As (V) Sn (Vl)Sn (Vl) Se (lV)Se (lV) Hg (ll)Hg (ll) Cr (lll)Cr (lll)
PSAPSA 5.505.50 4.474.47 0.000.00 9.119.11 23.8223.82 57.0757.07 3.393.39
BCXBCX--HLHL 18.0118.01 19.2119.21 0.000.00 29.4329.43 0.620.62 58.9758.97 9.819.81
68
CCXCCX 0.670.67 0.030.03 0.000.00 16.9916.99 0.000.00 10.6610.66 0.550.55
TAXTAX 3.733.73 3.583.58 0.000.00 33.6933.69 0.000.00 23.9723.97 0.550.55
THXTHX 10.0210.02 0.780.78 0.670.67 29.1029.10 11.4211.42 58.9758.97 0.460.46
NAXNAX 5.925.92 2.612.61 0.000.00 2.202.20 21.0321.03 46.8046.80 0.850.85

69. 69

70. 70

71. 71

72. 72

73. 73

74. 74

75. SolubilitySolubility
Best wash solvents are those in whichBest wash solvents are those in which
the compound of interest is insoluble.the compound of interest is insoluble.
75
Example:Vancomycin
Insoluble in Methanol
Wash: 100% methanol
Soluble in H2O
Elution: 80:20 methanol/H2O

76. Technical Document P-105
Purification of Small Molecule Libraries
Desalting Samples Using Pharmasil™ Reverse Phase SPE
Principle: The generation of small molecule libraries for screening against
biological targets has emerged as an area of intense interest in the
pharmaceutical industry. SPE has been demonstrated to expedite work up and
purification of organic molecules synthesized in solution, and in the
automated construction of small molecule libraries. Samples that have been
synthesized in aqueous salt, buffer solutions, or low polarity organic solvents
containing salts may require the removal of those salts prior to analysis.
Pharmasil TM Reverse Phase SPE can be used to desalt these libraries.
76
Pharmasil TM Reverse Phase SPE can be used to desalt these libraries.
Application: This application details the use of Pharmasil™ CEC18, a
highly loaded reverse phase sorbent, for desalting synthetic mixtures. In
combinatorial chemistry and organic synthesis salts are sometimes present in
the reaction mixtures. Once the reaction is complete, it is usually necessary to
separate the products of the reaction from the salts. If the salt is not removed
it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical
equipment. This can be done using a highly loaded reverse phase SPE
column to selectively remove the salt from the reaction mixture.

77. Advantages of Pharmasil™
Based Sorbents
• Complete removal of salts
• Clean background
• High recoveriesO
Si
CH3
CH3H3C
Chemistry of Pharmasil™ CEC18 SorbentChemistry of Pharmasil™ CEC18 Sorbent
77
• High recoveries
• High levels of purification of anaytes
• Applicable to a broad range of
compounds
• Simple easy to develop methods
Si
O
O
O
Si
CH3
CH3H3C
(CH2)17 CH3

78. Purification Profile
This profile is based on the use of a Pharmasil™ CEC18 500 mg column (columns are available with varying
volumes). This column is capable of removal of salts. The method can be scaled up as necessary by using columns
of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately
The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own
specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in
methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.
Sample Pre-treatment
Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using desalting columns is to
adjust the pH of the compound of interest so that it is totally molecular. This may require the addition of an acid or
base. Desalting can be done out of low polarity organic solvents such as hexane or methylene chloride as long as the
compound of interest is protonated.
Column Conditioning
Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.
78
Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.
Column Equilibration
Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH to be >9
If sample is an acid, you want the pH to be<2.5
Apply the sample to the column under gravity. The salts will flow through the column and the sample will stick to
the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The
critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the compound of exceeds the
capacity of the sorbent you will not get the highest recovery. If you think this is a problem use a larger bed mass.
Product Purification
Wash the column with 1ml of DI water or hexane.
Product Elution
Elute compound of interest with 1ml of methanol, ethyl acetate, or the organic solvent of your choice.

79. Technical Document P-102
Purification of Small Molecule Libraries
TIN (Sn) Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPE
Principle:Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biologicalThe generation of small molecule libraries for screening against biological
targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Iontargets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion
exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purificationexchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification
of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction ofof organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of
small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over moresmall molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more
traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLCtraditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC
is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of moleculesis that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules
solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.
79
solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.
Application:Application: This application details the use of Pharmasil™ TAX, a highly loadedThis application details the use of Pharmasil™ TAX, a highly loaded
weak cation exchange sorbent, for the removal of tin catalysts from organic synthesisweak cation exchange sorbent, for the removal of tin catalysts from organic synthesis
mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis tin compounds aremixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis tin compounds are
common catalysts. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate thecommon catalysts. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the
products of the reaction from the catalysts. If the catalyst is not removed it canproducts of the reaction from the catalysts. If the catalyst is not removed it can
interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This caninterfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can
be done using a highly loaded weak cation exchanger to selectively remove the tinbe done using a highly loaded weak cation exchanger to selectively remove the tin
catalyst from the reaction mixture.catalyst from the reaction mixture.

80. Chemistry of Pharmasil™ TAX Sorbent
Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents
Si
H2
C
H2
C
H2
C N
CH2
COOH
CH2CH2 N(CH2COOH)2
80
Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents
• Complete removal of tin catalyst
• Clean background
• High recoveries
• High levels of purification of anaytes
• Applicable to a broad range of compounds
• Simple easy to develop methods

81. Purification Profile
This profile is based on the use of a Pharmasil™ TAX 500 mg column (columns are available with varying
volumes). This column is capable of removal of up to50mg of tin. The method can be scaled up as necessary by
using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately
The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own
specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in
methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.
Sample Pre-treatment
Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to
adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of an acid or
buffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound
of interest is ionized... Tin catalysts are strong cations and are charged across the complete pH range.
Column Conditioning
Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.
81
Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.
Column Equilibration
Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH at 7-8.
If sample is an acid, you want the pH at 3-4.
Sample Application
Apply the sample to the column under gravity. The tin will stick to the column. The volume of the sample is not
important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity
of the sorbent. If the concentration of the tin of exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest
removal of tin. If you think this is a problem use a larger bed mass.
Product Purification
Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.
Product Elution
Elute compound of interest with 1ml of methanol.

82. Technical Document P-103
Purification of Small Molecule LibrariesPurification of Small Molecule Libraries
Palladium (Pd) Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPEPalladium (Pd) Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPE
Principle:Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biologicalThe generation of small molecule libraries for screening against biological
targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Iontargets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion
exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purificationexchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification
of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction ofof organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of
small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over moresmall molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more
traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLCtraditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC
is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of moleculesis that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules
solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.
82
is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of moleculesis that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules
solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.
Application:Application: This application details the use of Pharmasil™ TAX, a highly loadedThis application details the use of Pharmasil™ TAX, a highly loaded
weak cation exchange sorbent, for the removal of palladium catalysts from organicweak cation exchange sorbent, for the removal of palladium catalysts from organic
synthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis palladiumsynthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis palladium
compounds are common catalysts. Once the reaction is complete, it is usuallycompounds are common catalysts. Once the reaction is complete, it is usually
necessary to separate the products of the reaction from the catalysts. If the catalyst isnecessary to separate the products of the reaction from the catalysts. If the catalyst is
not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analyticalnot removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical
equipment. This can be done using a highly loaded weak cation exchanger toequipment. This can be done using a highly loaded weak cation exchanger to
selectively remove the tin catalyst from the reaction mixture.selectively remove the tin catalyst from the reaction mixture.

83. Chemistry of Pharmasil™ TAX SorbentChemistry of Pharmasil™ TAX Sorbent
Advantages of Pharmasil™ Based SorbentsAdvantages of Pharmasil™ Based Sorbents
Si
H2
C
H2
C
H2
C N
CH2
COOH
CH2CH2 N(CH2COOH)2
83
Advantages of Pharmasil™ Based SorbentsAdvantages of Pharmasil™ Based Sorbents
• Complete removal of palladium catalyst• Complete removal of palladium catalyst
• Clean background• Clean background
• High recoveries• High recoveries
• High levels of purification of anaytes• High levels of purification of anaytes
• Applicable to a broad range of compounds• Applicable to a broad range of compounds
• Simple easy to develop methods• Simple easy to develop methods

84. Purification ProfilePurification Profile
This profile is based on the use of a Pharmasil™ TAX 500 mg column (columns are available with varyingThis profile is based on the use of a Pharmasil™ TAX 500 mg column (columns are available with varying
volumes). This column is capable of removal of up to50mg of palladium. The method can be scaled up as necessaryvolumes). This column is capable of removal of up to50mg of palladium. The method can be scaled up as necessary
by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionatelyby using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately
The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its ownThe following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own
specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments inspecific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in
methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.
Sample PreSample Pre--treatmenttreatment
Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is toSamples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to
adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of an acid oradjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of an acid or
buffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compoundbuffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound
of interest is ionized.of interest is ionized..... Palladium catalysts are strong cations and are charged across the complete pH range. AdjustPalladium catalysts are strong cations and are charged across the complete pH range. Adjust
the sample to pH 9 with buffer or ammonium hydroxide.the sample to pH 9 with buffer or ammonium hydroxide.
Column ConditioningColumn Conditioning
Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.
84
Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.
Column EquilibrationColumn Equilibration
Condition the column with buffer of pH 9.Condition the column with buffer of pH 9.
Sample ApplicationSample Application
Apply the sample to the column under gravity. The palladium will stick to the column. The volume of the sample isApply the sample to the column under gravity. The palladium will stick to the column. The volume of the sample is
not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration andnot important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and
capacity of the sorbent. If the concentration of the palladium exceeds the capacity of the sorbent you will not get thecapacity of the sorbent. If the concentration of the palladium exceeds the capacity of the sorbent you will not get the
highest removal of palladium. If you think this is a problem use a larger bed mass.highest removal of palladium. If you think this is a problem use a larger bed mass.
Product PurificationProduct Purification
Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.
Product ElutionProduct Elution
Elute compound of interest with 1ml of methanol.Elute compound of interest with 1ml of methanol.

85. Technical Document PTechnical Document P--104104
Purification of Small Molecule LibrariesPurification of Small Molecule Libraries
TFAA Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPETFAA Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPE
Principle:Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biologicalThe generation of small molecule libraries for screening against biological
targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Iontargets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion
exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purificationexchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification
of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction ofof organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of
small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over moresmall molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more
traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLCtraditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC
85
traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLCtraditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC
is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of moleculesis that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules
solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.
Application:Application: This application details the use of Pharmasil™ CHQAX, a highly loadedThis application details the use of Pharmasil™ CHQAX, a highly loaded
quaternary amine exchange sorbent, for the removal of acid catalysts from organicquaternary amine exchange sorbent, for the removal of acid catalysts from organic
synthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis TFAA is asynthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis TFAA is a
common catalyst. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate thecommon catalyst. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the
products of the reaction from the catalyst. If the catalyst is not removed it can interfereproducts of the reaction from the catalyst. If the catalyst is not removed it can interfere
with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be donewith further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done
using a highly loaded quaternary amine exchanger to selectively remove the acidusing a highly loaded quaternary amine exchanger to selectively remove the acid
catalyst from the reaction mixture.catalyst from the reaction mixture.

86. Chemistry of Pharmasil™ CHQAX SorbentChemistry of Pharmasil™ CHQAX Sorbent
Advantages of Pharmasil™ Based SorbentsAdvantages of Pharmasil™ Based Sorbents
Si
H2
C
H2
C
H2
C N (CH3)3OH
+ -
86
• Complete removal of acid catalyst• Complete removal of acid catalyst
• Clean background• Clean background
• High recoveries• High recoveries
• High levels of purification of anaytes• High levels of purification of anaytes
• Applicable to a broad range of compounds• Applicable to a broad range of compounds
• Simple easy to develop methods• Simple easy to develop methods

87. Purification Profile
This profile is based on the use of a Pharmasil™ CHQAX 500 mg column (columns are available with varying
volumes). This column is capable of removal of up to 50mg of TFAA. The method can be scaled up as necessary
by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately.
The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific
requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore
think of the following profile as a beginning rather than a final method.
Sample Pre-treatment
Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to
adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of a pH 7 buffer.
Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound of
interest is ionized... acid catalysts are strong anions and are charged across the complete pH range.
Column Conditioning
Condition the column with 1 ml of methanol followed by 1 ml of DI water.
87
Condition the column with 1 ml of methanol followed by 1 ml of DI water.
Column Equilibration
Condition the column with pH 7 buffer.
Application
Apply the sample to the column under gravity. The TFAA will stick to the column. The volume of the sample is not
important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity
of the sorbent. If the concentration of the TFAA exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest
removal of TFAA. If you think this is a problem use a larger bed mass.
Product Purification
Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.
Product Elution
Elute compound of interest with 1ml of methanol.

88. 88