Bài giảng quy trình chiết xuất và định tính Flavonoid và Saponin dành cho sinh viên Đại Học Lạc Hồng

1. DƯỢC LIỆU CHỨA
FLAVONOID
Bộ môn dược liệu - 2018

2. Mục tiêu học tập
1. Chiết xuất và định tính flavonoid bằng phản ứng
hóa học
2. Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng

3. 3
O
O
O
O
O
eu-flavonoid
là glycosid = đường + genin
(C6 - C3) - C6 diphenyl propan
BA
Định nghĩa flavonoid…
iso-flavonoid neo-flavonoid

4. Định tính Flavonoid
1. Phản ứng của vòng γ -pyron
vòng  -pyron vòng pyrilium
(quan trọng/định tính)
Tác nhân khử
(Mg/HCl, Zn/HCl,NaBH4,…)
2. Phản ứng của OH phenol và nhân thơm
- Tác dụng với kiềm tạo các phenolat
- Tạo phức chất có màu và/hoặc tủa với các ion kim loại
đa hóa trị như Fe3+, Al3+, Pb2+,….
- Phản ứng với thuốc thử diazonium tạo hợp chất azoic có
màu đỏ cam đến đỏ.

5. Định tính Flavonoid
3. Anthocyanidin
- Các anthocyanidin có màu thay đổi tùy pH môi trường:
+ môi trường acid => đỏ
+ môi trường trung tính => tím
+ môi trường kiềm => xanh
- Phản ứng cyanidin (Mg + HCl), AC cũng cho màu đỏ (do môi
trường có tính acid)

6. 1. Chiết xuất
Mẫu Dược liệu Thành phần định tính
H Bột hoa Hòe Flavonol
Đ Hạt Đậu đen Anthocyanidin
T Bột Rễ Tranh Mẫu chứng không có Flavonoid

7. 1,0 g dược liệu
dịch chiết
+ 25 ml cồn 96%/ BM 5ph
(riêng mẫu Đ dùng cồn 25%)
1. Chiết xuất
+ Lọc qua bông

8. 1. Dung dịch NaOH 1% (phản ứng tăng màu)
2. Dung dịch FeCl3 1% (phản ứng tạo phức)
3. Dung dịch chì acetat trung tính (phản ứng tạo phức)
4. Thuốc thử diazonium
Với mỗi dược liệu, lấy 5 ống nghiệm (5 ống thử + 1 ống chứng)
làm phản ứng với các thuốc thử sau:
2. Định tính nhóm OH phenol và nhân thơm

9. + 2ml d. chiết
+ NaOH 1%
1 2
+ 2ml d. chiết
+ FeCl3 1%
3
+ 2 ml d. chiết
+ chì acetat 1%
-Lắc đều, quan sát màu , tủa và so sánh với ống chứng
-Phản ứng dương tính khi có sự tăng màu và/hoặc tạo tủa
4
+ 2 ml d. chiết
+ vài giọt NaOH 10%
+ 1-2 giọt TTdiazonium
2. Định tính nhóm OH phenol và nhân thơm

10. 3. Phản ứng của vòng γ-pyron (Phản ứng Cyanidin)
+ ít bột Mg kim loại
+ 2 ml dịch chiết
+ 1 ml HCl đđ
- Phản ứng dương tính khi tạo dung dịch màu đỏ

11. 4. Phản ứng của nhóm anthocyanidin
Quan sát và so sánh màu của 3 ống nghiệm???
+ 2 ml d.chiết Đ
+ 1 giọt HCl 1%
+ 2 ml d.chiết Đ
+ 1 giọt NaOH 1%
+ 2 ml d.chiết Đ
1 2 3

12. DƯỢC LIỆU CHỨA
SAPONIN

13. Mục tiêu học tập
1. Chiết xuất được saponin từ dược liệu cho định tính.
2. Định tính được saponin trong mẫu dược liệu dựa trên
tính chất chung của saponin.

14. Saponin (saponosid) là một nhóm các glycosid có phần
genin có cấu trúc triterpen hay steroid có 27 carbon
gặp rộng rãi trong thực vật và 1 số động vật ở biển
Định nghĩa Saponin
Solanin

15. Tính chất chung của saponin
Làm vỡ hồng cầu ngay ở những
nồng độ rất loãng
Kích ứng niêm mạc gây hắt
hơi, đỏ mắt
Độc với cá
Có thể tạo phức với cholesterol
Làm giảm sức căng bề mặt, tạo
nhiều bọt khi lắc với nước

16. Định tính Saponin
+ 1 g dược liệu
+ 20 ml cồn 70%
BM 5ph Lọc bông
Dịch chiết
Chiết xuất

17. Định tính tạo bọt
Cho 10 ml dịch chiết
Cô còn khoảng 1/3
Dịch chiết đậm đặc
+ 10 giọt dịch chiết đậm đặc
+ 10 ml nước cất
• Quan sát lớp bọt
• Đánh giá kết quả: Bọt bền trong 15 phút: (+);
30 phút: (++); 60 phút: (+++).
Lắc mạnh trong 1 phút
(= 30 lần)

18. Phản ứng Lierbermann – Burchard
+ 2 ml anhydric acetic
+ 2 ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan.
Lọc/gạn vào
ống nghiệm khô
Cho 5 ml dịch chiết
Cô cắn
+1-2 ml H2SO4 đđ
Vòng ngăn cách
màu hồng -> tím
Nghiêng ống
nghiệm trên giá

19. 19
Mỗi tiểu nhóm sẽ thực hiện:
 Chiết xuất và định tính xác định Flavonoid:
Nhóm lẻ: + Nụ hoa Hòe + Hạt Đậu đen
Nhóm chẵn: + Nụ hoa Hòe + Cỏ Tranh
 Chiết xuất và định tính xác định Saponin:
Nhóm lẻ: Bồ kết
Nhóm chẵn: Ngũ gia bì
Thực hành

20. Tổng kết Flavonoid

21. Định tính với các thuốc thử
1. Dung dịch NaOH 1% (phản ứng tăng màu)
Tạo phenolat, Δ’ có Δ liên hợp => phản ứng tăng màu
2. Dung dịch AlCl3 1% trong MeOH (phản ứng tạo phức)
Là thuốc thử tăng màu, khảo sát cấu trúc flavonoid bằng UV
(UV 365 nm) => số lượng và vị trí nhóm OH
3. Dung dịch FeCl3 1% (phản ứng tạo phức)
Flavonoid + FeCl3  phức xanh (nâu, lá, đen).
- càng nhiều OH (đ.biệt là o-di-OH): màu càng đậm

22. 4. Dung dịch chì acetat trung tính (phản ứng tạo phức)
Tủa vàng nhạt đến sậm với các flavonoid có ortho-di-OH phenol.
Màu thay đổi tùy số lượng và vị trí các nhóm thế.
5. Thuốc thử diazonium
Flavonoid / Na2CO3 + TT diazonium  đỏ cam/đỏ
Các flavonoid (+) khi:
- có H ortho hay para / -OH
- H này không bị cản trở lập thể

23. Dịch chiết đậu đen
NaOH
1% AlCl3 1%
FeCl3
1%
chì acetat
tt
TT
diazonium
2. Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm

24. Dịch chiết Hòe
NaOH
1% AlCl3 1%
FeCl3
1%
chì acetat
tt
TT diazonium
2. Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm

25. Dịch chiết rễ tranh
NaOH
1% AlCl3 1%
FeCl3
1%
chì acetat
tt
TT
diazonium
2. Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm

26. DC Hòe DC Bưởi DC Rễ tranh
3. Phản ứng của vòng γ-pyron (Phản ứng Cyanidin)

27. Mẫu chứng NaOH 1% HCl 1%
4. Phản ứng của nhóm anthocyanidin (Đậu đen)

28. Tổng kết Saponin

29. Định tính tạo bọt
 Được xác định là có bọt bền khi:
• Để lâu trên 15 phút.
• Lớp bọt cao khoảng 0,5 cm trở lên.
 Khả năng tạo bọt của mỗi dược liệu là khác nhau.

30. Phản ứng Lierbermann – Burchard
Saponin steroid
Saponin triterpen
Âm tính

31. Sắc ký lớp mỏng
Soi bột dược liệu

32. SẮC KÝ LỚP MỎNG
• Bản mỏng: silica gel F254
• Pha động: hệ hỗn hợp
dung môi
• Mẫu: pha trong dung môi
thích hợp

33. 34
Chuẩn bị:
Hệ dung môi, bình sắc ký
- Bình sắc ký: khô, lót sẵn giấy lọc quanh lòng bình.
- Dung môi pha theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký.
Đậy nắp kín. Đặt ở nơi bằng phẳng, để yên 30’ để bão
hòa dung môi

34. Chấm điểm Chấm vạch
Chuẩn bị:
Bản mỏng: Sử dụng bút chì vẽ vạch xuất phát, kết
thúc, vạch cần chấm
35
MT STMTc MT STMTc

35. Đưa mẫu lên bản mỏng và khai triển:
- Sử dụng mao quản chấm mẫu lên bản mỏng tại vị
trí đã đánh dấu. Kiểm tra mẫu chấm trên UV 254
- Đưa bản mỏng vào bình sắc ký, đậy nắp kín. Chú ý
không được mở nắp, di chuyển bình trong quá trình
khai triển
36

36. Phát hiện:
UV254, UV365,
Thuốc thử: Alkaloid: dragendorff Polyphenol: FeCl3
Anthraquinon: KOH/cồn HCHC: TTVS
37

37. KẾT QUẢ
38
Ghi nhận số vết, màu sắc và Rf của các vết

38. Sắc ký lớp mỏng
• Bản mỏng sillicagel 2,5x10 cm
39
• Dịch chấm sắc ký: dịch chiết mẫu thử,
Chất chuẩn Rutin
• Dung môi khai triển :
EA - H20 – Acid acetic 70:20:10
• Phát hiện: UV 254 và 365 nm, TT FeCl3 1%
X Rutin
 Thực hành
- Mẫu thử: nhóm lẻ: nụ hoa hòe + đậu đen
nhóm chẵn : : nụ hoa hòe + cỏ tranh
- Mẫu chuẩn: Rutin
Hòe
Quan sát, nhận xét sắc ký đồ: số vết, vị trí vết, màu sắc
Cho biết dịch chiết nào có chứa Rutin?

39. Soi bột Hòe
Hạt phấn
Lông che chở đa bào Sợi mô cứng
Hạt phấn

40. Soi bột Hòe
Mảnh biểu bì đài hoa Mảnh biểu bì đài hoa
Mảnh mạch xoắn

41. Kết quả SKLM