1. Curso de Biología Ingeniería Bioquímica Manejo y uso del microscopio Dr. Cesar Soria Fregozo

2. 1770 1878 Leewenhoek S.XX

3. Fue inventado hacia el año 1600 En 1590 dos artesanos holandeses, zachary y Franscis Jassen, inventaron el microscopio compuesto (un tubo con dos lentes convexas y amplificaba mas que las lupas existentes). Leewenhoek, a mediados del Siglo XVII, con microscopios simples de fabricación casera describió protozoarios, glóbulos rojos algunas bacterias y espermatozoides ( creador del microscopio simple). Abbe, en 1877, mejora la microscopía de inmersión usando aceite de cedro. A partir de 1930 la microscopía ha ido evolucionando, contando en la actualidad con diversos modelos y ópticas.

4. TIPOS DE MICROSCOPIO Microscopio Óptico M. estereoscopio M. de luz ultravioleta M. de polarización M. en campo oscuro M. de contraste de fases M. de luz polarizada M. de fluorescencia M. electrónico M. electrónico de transmisión y de barrido M. confocal M. de fuerza atómica

5. El microscopio es un instrumento que permite la observación de objetos y detalles de estructuras tan pequeñas y claras que no pueden ser observadas a simple vista. Las principales dificultades en la observación y estudio de estructuras biológicas son su REDUCIDO TAMAÑO Y SU EVENTUAL TRANSPARENCIA a la luz visible. El grado de visibilidad se amplía, por un conjunto de lentes, eficazmente colocados, que con la luz visible crean imágenes aumentadas de los objetos.

6. Los especimenes o muestras que se examinan con un microscopio óptico, son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa

7. Las imágenes que se obtienen son bidimensionales e invertidas. Los objetos a observar deben ser muy pequeños o cortados en láminas tan delgadas que la luz pueda atravesarlos.

8. ¿CUAL ES EL MICROSCOPIO MÁS USADO? El microscopio óptico o fotónico . El más simple de estos, es el de lente convexa (o convergente) y de distancia focal corta, los objetos pueden ser aumentados hasta 15 veces su tamaño

9. FORMACIÓN DE LA IMÁGEN

10. Imagen Real: Imágen que sólo se puede ver sobre una pantalla y se presenta invertida

11. ¿POR QUÉ SE INVIERTE LA IMAGEN AL PASAR POR LA LENTE CONVERGENTE?

12. 2F F F 2F Centro óptico Eje óptico Objeto dF ELEMENTOS DE LAS LENTES CONVERGENTES Objeto : se representa por una flecha pudiendo ubicarse en distintos puntos Punto focal (F) punto en que los rayos paralelos al eje óptico convergen en un punto a una determinada distancia focal ( dF ). La abreviatura 2F se refiere a dos veces la distancia focal. Imagen real : imagen donde los rayos procedentes del objeto convergen. Imagen virtual : imagen donde los rayos parecen converger sin hacerlo realmente. Es recta, es decir, en la misma dirección del objeto.

14. Formación de imágenes en lentes convergentes La formación de la imagen se modifica dependiendo si el objeto se coloca: Mas allá de 2F Sobre 2F Sobre 2F Sobre F Entre F y la lente

15. Objeto más allá de 2F . Imagen real, invertida, localizada entre F y 2F, más pequeña que el objeto . 2F F Objeto Imagen 2F F

16. Objeto en 2F . Imagen real, invertida, del mismo tamaño que el objeto. 2F F Objeto Imagen

17. 2F F objeto Imagen Objeto entre 2F y F . Imagen real, invertida, localizada más allá de 2F, ligeramente ampliada

18. F 2F Objeto Objeto en F . No hay imagen.

19. La parte óptica del microscopio fotónico compuesto consta de dos lentes convergentes (objetivo y ocular) con una distancia focal reducida, siendo la del objetivo mucho menor respecto a la del ocular

20. F 2F A B A´ B´ Imagen “objeto” Lente Objetivo Objeto El objeto AB se ubica a una distancia de trabajo ligeramente mayor que F, es decir:

21. El microscopio óptico (fotónico) compuesto, que puede ser monocular o binocular, permite obtener aumentos de 100 a 1500 veces.

22. Trichomonas vaginalis a 100 aumentos Amiba a 250 aumentos Células sanguíneas Penicillium a 1500 aumentos Closterium (alga) a 600 aumentos Alga dulceacuícola a 400 aumentos Paramecium a 600 aumentos Bacterias a 1500 aumentos ¿Qué puede verse a través del Microscopio Óptico ?

23. Así, el objetivo forma una primera imagen A´ B´ que sirve como “objeto” para la lente ocular. La ubicación de este “objeto” debe estar a una distancia ligeramente menor que F, o sea, entre F y la lente

25. TUBO BRAZO Tornillos Macro y Micrométrico Oculares Objetivos Platina Condensador Fuente de iluminación Pie o Base

26. Pinzas y/ o “carro” Revolver Tornillo de condensador* Tornillo de Platina* Cabezal o Tubo Fuente de Luz

27. Es una placa metálica, suele ser cuadrada y se halla en un plano normal al eje del tubo. El portaobjetos con la preparación que se desea observar se coloca encima de la platina, junto a unos encajes que tiene para esto, quedando sujeta mediante una pieza curva (carro) o por las pinzas En el centro lleva una perforación por cual pasa la luz. La preparación se desplaza sobre la platina mediante dos tornillos. A veces posee 2 reglillas con escalas que permiten orientar a otros en la observación de algún elemento en especial La platina

28. La cremallera Los tornillos , asociados al “ carro” de la platina y al condensador , permiten el movimiento de estos. La acción del tornillo del condensadores de subir o bajar. Los tornillos asociados al “carro” mueven la preparación, hacia los lados o hacia delante y atrás. Estos tornillos auxilian en el enfoque de la imagen o a localizar la muestra o especimen.

29. TORNILLO MACROMÉTRICO Y TORNILLO MICROMÉTRICO Tornillo Macrométrico: Mueve, también la platina, se usa para localizar el enfoque grueso de la preparación Tornillo micrométrico. Permite movimientos muy cortos en un ajuste fino del enfoque para lograr una observación precisa

30. Escala de nonios o vernier, se ubica en la platina y es una pequeña medida, derivada del pie, tiene 10 divisiones. Se usa para ubicar y medir a organismos observados.

31. X Y Pinzas sujetadoras de portaobjetos Platina Ubicación de organismo a través de ejes coordenados

32. Comprende a los lentes oculares, a los lentes objetivos ya los dispositivos de iluminación. COMPONENTES ÓPTICOS

33. Lámparas eléctricas Espejo Se les puede ajustar la intensidad de luz FUENTE DE LUZ

34. La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Fuente de Luz: Proporciona la luz que llega hasta el objeto a estudiar y el sistema óptico del microscopio: Puede ser por un espejo (plano por un lado y cóncavo por el otro) o luz incorporada (un foco de luz eléctrica ocupando el sitio del espejo.)

35. El condensador es la lente que concentra el haz luminoso hacia la preparación. I lumina la lente del objetivo, su abertura numérica debe ser suficientemente alta para suministrar el cono de luz requerido. Posee, en su parte inferior, un anillo para alojar filtros de colores o de luz natural. El condensador

36. En la parte inferior del condensador hay una abertura regulable, o diafragma-iris controlado por una palanca lateral. La apertura y el cierre del diafragma regula la cantidad de luz que ingresa hacia la preparación DIAFRAGMA

37. Las lentes de los microscopios se encuentran dispuestas de forma tal, que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular

39. El ocular se compone de dos lentes. La lente inferior recoge la imagen del objetivo, la reduce y la reforma dentro del ocular a nivel del limitador del campo visual. La lente superior forma una imagen virtual aumentada para ser vista. El aumento de los oculares puede ser de X 4, X10,X12 y X15 . Lentes

40. Estos, con diferentes aumentos están colocados en el revólver y pueden ser de 4X 10X 40X o lentes “secos” y el de 100X o lente de inmersión. El objetivo está compuesto de varios tipos de lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado , controla el aumento posible y la claridad de la imagen.

41. El Objetivo Es importante para producir una imagen clara de alta resolución, utilizar la lente adecuada

42. Oel: Señala uso de aceite de Inmersión 100 = Número de aumentos 1.25 = Apertura numérica 160 mm = Distancia Mecánica desde objetivo al ocular 0.17 mm = Espesor del cubreobjetos Anillo Superior Anillo Inferior Datos grabados en los tubos de los objetivos Oel 100/1.25 160/0.17

43. La amplificación de un objeto se logra multiplicando el aumento del lente objetivo por el aumento de la lente ocular. Por ejemplo: Aumento = 40 X 10 = 400 aumentos Lente objetivo de 40X Lente ocular de 10 aumentos

44. M uchas de las estructuras y eventos biológicos más interesantes son más pequeños de lo que podemos ver . El ojo humano tiene una resolución de cerca de 100 µm. En el cuadro de abajo se puede ver que de todas las estructuras listadas, sol o la célula vegetal está escasamente dentro de nuestro poder resolutivo

45. En microscopía resolver se refiere a separar. Así, el poder de resolución implica la capacidad de separar o discernir entre dos objetos muy cercanos entre sí. ¿MAYOR O MENOR PODER DE RESOLUCIÓN?

46. Menor poder de resolución Mayor poder de resolución ASÍ, DOS OBJETOS MUY CERCANOS SE PUEDEN VER COMO UNO SOLO SI LOS LENTES DEL MICROSCOPIO TIENEN UN BAJO PODER DE RESOLUCIÓN

47. - + PODER DE RESOLUCIÓN

48. MANEJO DEL MICROSCOPIO Para transportarlo es necesario sujetarlo por el brazo con una mano y por la base con la otra, colocándolo junto a su cuerpo (en el pecho) 1. Limpiar el espejo o lámpara, condensador y los lentes del microscopio. a.) Eliminar el polvo con ayuda de un pincel fino o aire a presión. b.) Frotar sin presionar, con papel de seda, usándolo solo una vez. 2) Para limpiar el aceite de inmersión, primero se quita el exceso y posteriormente se puede usar alcohol a 70% para removerlo por completo.

49. 2. Comprobar que sea el lente objetivo de menor aumento el que se encuentre en posición de observación. De no ser así gire el revolver para ubicarlo correctamente. 3. Abrir completamente el diafragma y observando a través del ocular, de modo que la luz reflejada se observe en un círculo uniformemente iluminado. Este constituye el "campo óptico

50. 4. Coloque el portaobjetos con la preparación sobre la platina sujetandolo con pinzas ex profeso diseñadas para ese fin en el equipo. 5.Observando lateralmente con el tornillo macrométrico acerque la preparación al lente objetivo hasta el punto limite, es decir donde tope.

51. 6. Observando por el ocular, con ayuda del tornillo micrométrico aleje la preparación hasta que parezca la imagen enfocada. 7.Para facilitar el enfoque puede hacer un ligero movimiento de izquierda a derecha con ayuda del carro de la platina para que por medio del movimiento poder apreciar la cercanía del punto de enfoque. 8. Para observar una muestra con el objetivo de 100x, se coloca una gota de aceite de inmersión encima de la lámina de la preparación antes de girar el revolver. Esto permite que la imagen se vea con nitidez para realizar la observación ya que este tipo de lentes requiere que el índice de refracción sea similar al del vidrio. No olvide limpiar el lente una vez concluidas sus observaciones. Terminada la observación, girar el revólver para colocar el objetivo de menor aumento en la primera posición de trabajo. 10. Retirar la preparación y dejar limpio el microscopio, secando la platina con cuidado