pruebas bioquimicas

Pruebas bioquímicas dePruebas bioquímicas de
identificaciónidentificación
Bioq. María de los Ángeles SosaBioq. María de los Ángeles Sosa

Pruebas de IdentificaciónPruebas de Identificación
rápidasrápidas
1.1.Prueba de la catalasaPrueba de la catalasa
2.2.Prueba de la coagulasaPrueba de la coagulasa
3.3.Prueba de PYRPrueba de PYR
4.4.Prueba de oxidasaPrueba de oxidasa

Pruebas de Identificación paraPruebas de Identificación para
Cocos Gram +Cocos Gram +
1.1. DNasaDNasa
2.2. Prueba del manitol saladoPrueba del manitol salado
3.3. Bilis esculinaBilis esculina
4.4. CAMPCAMP
5.5. Hidrólisis del hipuratoHidrólisis del hipurato
6.6. Voges –ProskauerVoges –Proskauer
Pruebas de sensibilidad a ATBPruebas de sensibilidad a ATB
1.1. Disco de OptoquinaDisco de Optoquina
2.2. Disco de novobiocinaDisco de novobiocina
3.3. Disco de BacitracinaDisco de Bacitracina

Prueba de la catalasaPrueba de la catalasa
FundamentoFundamento: Detecta la presencia de la enzima: Detecta la presencia de la enzima
catalasa.catalasa.
ProcedimientoProcedimiento: En portaobjetos colocar sobre una: En portaobjetos colocar sobre una
colonia unas gotas de Hcolonia unas gotas de H220022 3 %.3 %.
HH220022 HH220 + 00 + 022
Liberación de burbujas rápida y sostenidaLiberación de burbujas rápida y sostenida indicaindica
la producción de oxígeno molecularla producción de oxígeno molecular = prueba (+)= prueba (+)
ConsideracionesConsideraciones::
No Agar sangre (No Agar sangre (peroxidasa en los eritrocitos).peroxidasa en los eritrocitos).

Prueba de la coagulasaPrueba de la coagulasa
FundamentoFundamento: Detecta un factor de agregación “clumping: Detecta un factor de agregación “clumping
factor” en la superficie de la bacteriana.factor” en la superficie de la bacteriana.
ProcedimientoProcedimiento:: se coloca una colonia sospechosa dese coloca una colonia sospechosa de
pertenecer a una especie depertenecer a una especie de StaphylococcusStaphylococcus y sey se
emulsifica en una gota de plasma de conejo.emulsifica en una gota de plasma de conejo.
InterpretaciónInterpretación: “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto =: “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto =
prueba (+).prueba (+).
Si el resultado es negativo ensayar la producción deSi el resultado es negativo ensayar la producción de
coagulasa en tubo.coagulasa en tubo.
Utilizar plasma con EDTA y no citratado, yaUtilizar plasma con EDTA y no citratado, ya
que organismos capaces de metabolizar el citratoque organismos capaces de metabolizar el citrato
(Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+).(Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+).
Las pruebas (-) luego de 4 hs de incubaciónLas pruebas (-) luego de 4 hs de incubación
a 35ºC, dejar a temperatura ambiente y leer luego de 18-a 35ºC, dejar a temperatura ambiente y leer luego de 18-
24 hs a fin de evitar la fibrinólisis que producen algunas24 hs a fin de evitar la fibrinólisis que producen algunas
cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35ºC.cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35ºC.

Prueba del PYR:Prueba del PYR:
Fundamento:Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utilizadetecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza
como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), paracomo sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para
la identificación rápida de enterococos.la identificación rápida de enterococos.
ProcedimientoProcedimiento: Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir: Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir
un disco de PYR.un disco de PYR.
Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C.Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C.
Tiempo de lectura: 5 minutos.Tiempo de lectura: 5 minutos.
InterpretaciónInterpretación::
Disco rosado o rojo (+)Disco rosado o rojo (+)
Disco y/o solución amarillo a incoloro (-).Disco y/o solución amarillo a incoloro (-).
ConsideracionesConsideraciones: Algunas especies de: Algunas especies de StaphylococcusStaphylococcus y losy los
estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva.estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva.

Prueba de la DNAsaPrueba de la DNAsa
Fundamento:Fundamento: ElEl S. aureusS. aureus produce una DNAasaproduce una DNAasa
termoestable que hidroliza DNA.termoestable que hidroliza DNA. La producción deLa producción de
DNAsa puede determinarse incorporando ácidoDNAsa puede determinarse incorporando ácido
desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo .desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo .
ProcedimientoProcedimiento: Se inocula el microorganismo: Se inocula el microorganismo enen
manchas densas sobre agar DNAmanchas densas sobre agar DNA y después de 18 a 24y después de 18 a 24
hs de incubación. Revelar con HCl al 1%, que precipitahs de incubación. Revelar con HCl al 1%, que precipita
el DNA nativo del medio.el DNA nativo del medio.
InterpretaciónInterpretación: colonias rodeadas por una zona clara: colonias rodeadas por una zona clara
donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado =donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado =
prueba (+)prueba (+)

Agar Manitol saladoAgar Manitol salado
FundamentoFundamento: el medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5: el medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5
%), rojo de fenol y peptonas.%), rojo de fenol y peptonas.
ProcedimientoProcedimiento: Sembrar la cepa e incubar: Sembrar la cepa e incubar 18 a 24 hs a 35ºC.18 a 24 hs a 35ºC.
Crecimiento y virajeCrecimiento y viraje
S. aureusS. aureus
Crecimiento sin viraje.Crecimiento sin viraje.
S. epidermidisS. epidermidis
La alta concentración de sal inhibe otros microorganismos exceptoLa alta concentración de sal inhibe otros microorganismos excepto
enterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no paraenterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no para
aislamiento).aislamiento).

Prueba de la bilis-esculina:Prueba de la bilis-esculina:
Fundamento:Fundamento: Se basa en la capacidad de ciertas bacteriasSe basa en la capacidad de ciertas bacterias
(estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia(estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia
de 1-4% de sales biliares.de 1-4% de sales biliares.
ProcedimientoProcedimiento: Se inocula el microorganismo: Se inocula el microorganismo en la superficie deen la superficie de
un pico de flauta. Incubarun pico de flauta. Incubar 24 hs.24 hs.
InterpretaciónInterpretación: La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa: La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa
y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma uny esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma un
complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrólisis de esculina secomplejo de color negro con Fe 3+ .La hidrólisis de esculina se
observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hsobserva como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs
de incubación a 35ºC, raramente se requieren 48 hs de incubaciónde incubación a 35ºC, raramente se requieren 48 hs de incubación
hasta que la hidrólisis sea aparente.hasta que la hidrólisis sea aparente.
ConsideracionesConsideraciones: Es importante que el medio contenga 40% de: Es importante que el medio contenga 40% de
bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo quebilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que
lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococoslleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos

Prueba de CAMPPrueba de CAMP
Fundamento:Fundamento: Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMPLos estreptococos grupo B secretan el factor CAMP
que interactúa con la ß-hemolisina secretada por una cepa ß-que interactúa con la ß-hemolisina secretada por una cepa ß-
hemolítica dehemolítica de S. aureusS. aureus (ATCC 25923) lo que causa un(ATCC 25923) lo que causa un
acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis.acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis.
ProcedimientoProcedimiento: En placa de agar sangre sembrar una estría de la: En placa de agar sangre sembrar una estría de la
cepa decepa de S. aureusS. aureus y perpendicularmente a ésta (lo más cercay perpendicularmente a ésta (lo más cerca
posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo enposible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en
estudio.estudio.
Tiempo y Tº de incubaciónTiempo y Tº de incubación:: Incubar 24 hs a 35ºC en aerobiosisIncubar 24 hs a 35ºC en aerobiosis
(en CO2 aumentan los falsos positivos).(en CO2 aumentan los falsos positivos).
InterpretaciónInterpretación: El sinergismo se observa como un área de ß-: El sinergismo se observa como un área de ß-
Hemólisis en forma de “punta de flecha” en la zonaHemólisis en forma de “punta de flecha” en la zona
de desarrollo más cercana a ambas estrías.de desarrollo más cercana a ambas estrías.

Prueba del hipurato de sodioPrueba del hipurato de sodio
Fundamento:Fundamento: Ciertas cepas son capaces de hidrolizar el hipuratoCiertas cepas son capaces de hidrolizar el hipurato
de sodio. La producción de hipuricasa resulta en la hidrólisis delde sodio. La producción de hipuricasa resulta en la hidrólisis del
hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina.hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina.
ProcedimientoProcedimiento::
Inocular un tubo con medio hipurato de sodio con elInocular un tubo con medio hipurato de sodio con el
microorganismo. Incubar 24 hs a 35ºC. Centrifugar. Pipetear 0.8 mlmicroorganismo. Incubar 24 hs a 35ºC. Centrifugar. Pipetear 0.8 ml
el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico 7%.el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico 7%.
Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con elInocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con el
microorganismo. Incubar 2 hs a 35ºC. Agregar 0.2 ml de Ninhidrina.microorganismo. Incubar 2 hs a 35ºC. Agregar 0.2 ml de Ninhidrina.
La formación de un precipitado denso y persistente por 10 minutosLa formación de un precipitado denso y persistente por 10 minutos
= prueba (+) Benzoato de sodio= prueba (+) Benzoato de sodio
La aparición de un color púrpura profundo = prueba (+) glicina.La aparición de un color púrpura profundo = prueba (+) glicina.

Hidrólisis de hipuratoHidrólisis de hipurato

Prueba de la susceptibilidad aPrueba de la susceptibilidad a
lala NovobiocinaNovobiocina
Fundamento:Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a laSe basa en que ciertas bacterias son sensibles a la
novobiocina.novobiocina.
ProcedimientoProcedimiento: Se inocula el microorganismo: Se inocula el microorganismo enen agar Muelleragar Mueller
Hinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos deHinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de
Novobiocina (5 µg).Novobiocina (5 µg).
InterpretaciónInterpretación: Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro: Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro
mayor o igual a 16 mmmayor o igual a 16 mm
StaphylococcusStaphylococcus RR
MicrococcusMicrococcus SS
Kirby Bauer (Difusión en disco)Kirby Bauer (Difusión en disco)
Inoculo sin incubación previaInoculo sin incubación previa
Tiempo de lectura: 24 hs.Tiempo de lectura: 24 hs.
Tº de incubación: 33º a 35ºTº de incubación: 33º a 35º

Prueba de la Bacitracina:Prueba de la Bacitracina:
Fundamento:Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a laSe basa en que ciertas bacterias son sensibles a la
bacitracina.bacitracina.
ProcedimientoProcedimiento: Se inocula el microorganismo: Se inocula el microorganismo en ASen AS según técnicasegún técnica
de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U).de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U).
InterpretaciónInterpretación: Sensible: Cualquier zona de inhibición del: Sensible: Cualquier zona de inhibición del
desarrollo.desarrollo.
ConsideracionesConsideraciones:: Kirby Bauer (Difusión en disco)Kirby Bauer (Difusión en disco)
Inoculo sin incubación previaInoculo sin incubación previa
Tiempo de lectura: 18 a 24 hs.Tiempo de lectura: 18 a 24 hs.
Tº de incubación: 33º a 35º en CO2Tº de incubación: 33º a 35º en CO2
Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa enRecordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en
las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% alas placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a
50% de falsos negativos.50% de falsos negativos.

Prueba de la BacitracinaPrueba de la Bacitracina

Prueba de la optoquinaPrueba de la optoquina

Pruebas de Identificación paraPruebas de Identificación para
enterobacteriasenterobacterias
1.1. Prueba OFPrueba OF
2.2. Prueba de la oxidasa o citocromooxidasaPrueba de la oxidasa o citocromooxidasa
3.3. TSITSI
4.4. SIM (Sulfhídrico- Indol- Movilidad)SIM (Sulfhídrico- Indol- Movilidad)
5.5. Rojo de metilo - Voges –ProskauerRojo de metilo - Voges –Proskauer
6.6. ONPG (O-nitrofenil-b-galactopiranosido)ONPG (O-nitrofenil-b-galactopiranosido)
7.7. CitratoCitrato
8.8. UreasaUreasa
9.9. Fenil-alanina-desaminasaFenil-alanina-desaminasa
10.10.DescarboxilasasDescarboxilasas

CITOCROMOOXIDASA OCITOCROMOOXIDASA O
PRUEBA DE LA OXIDASAPRUEBA DE LA OXIDASA
Fundamento:Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla enEl sistema citocromooxidasa, se halla en
microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.
Procedimiento:Procedimiento: Hacer una suspensión del microorganismo conHacer una suspensión del microorganismo con
solución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un discosolución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un disco
(disco comercial de papel impregnado de(disco comercial de papel impregnado de tetrametil-para-tetrametil-para-
difenilaminadifenilamina) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.
InterpretaciónInterpretación: Un cambio de color del disco a rosado o violeta =: Un cambio de color del disco a rosado o violeta =
prueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasaprueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa
negativo.negativo.
ConsideracionesConsideraciones Esta prueba no puede realizarse con coloniasEsta prueba no puede realizarse con colonias
que provengan de medios de cultivo que contenga hidratos deque provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de
carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debecarbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe
incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSAincubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA
(tripteina-soya-agar(tripteina-soya-agar))

PRUEBA DE OXIDACIÓNPRUEBA DE OXIDACIÓN
FERMENTACIÓN (O-F)FERMENTACIÓN (O-F)
Fundamento:Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativoDeterminan el metabolismo oxidativo o fermentativo
de un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el mediode un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el medio
O-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos deO-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de
carbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración decarbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración de
peptonas, hay menor producción de productos de oxidación a partirpeptonas, hay menor producción de productos de oxidación a partir
de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar losde los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los
ácidos débiles producidos por los microorganismos noácidos débiles producidos por los microorganismos no
fermentadores.fermentadores.
ProcedimientoProcedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la
siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno desiembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de
los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselinalos tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina
estéril.estéril.
Microorganismos oxidativo:Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tuboproducen ácido solo en el tubo
abierto, expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el tuboabierto, expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo
expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo.expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo.
Microorganismos fermentadoresMicroorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos.: producen ácido en los 2 tubos.
O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo.O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo.
Bacterias sacarolíticasBacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su: son inertes a este medio que conserva su
pH alcalino después de la incubación, conservando su colorpH alcalino después de la incubación, conservando su color
original.original.

Triple Azúcar HierroTriple Azúcar Hierro

TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERROTSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO
AGAR)AGAR)
Fundamento:Fundamento: Sirve para detectar laSirve para detectar la
fermentación de hidratos de carbono.fermentación de hidratos de carbono. El medioEl medio
contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosacontiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa
al 1% y peptonas; también tiene un indicadoral 1% y peptonas; también tiene un indicador
rojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciarrojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciar
la formación de SH2.la formación de SH2.
Procedimiento:Procedimiento: El medio se fracciona en picosEl medio se fracciona en picos
de flauta con una capa basal profunda (2 cm.de flauta con una capa basal profunda (2 cm.
por lo menos). Con el ansa en punta se siembrapor lo menos). Con el ansa en punta se siembra
porpor punción y estríapunción y estría..
El medio no inoculado es anaranjado-rojizo oEl medio no inoculado es anaranjado-rojizo o
rojo pálido. Incubar 24 hs a 35º C.rojo pálido. Incubar 24 hs a 35º C.

TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERROTSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO
AGAR)AGAR)
Fermentación de la glucosa (alcalino/ácido)Fermentación de la glucosa (alcalino/ácido)
Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendoPrimero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo
ácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamenteácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente
utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando lautilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la
glucosa que se halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs)glucosa que se halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs)
los microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con producción delos microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con producción de
amoníaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en elamoníaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en el
pico, quedando el fondo ácido.pico, quedando el fondo ácido.
Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido)Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido)
Como la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que laComo la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que la
glucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no seglucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no se
consumen quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo.consumen quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo.
3) No fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino). Un3) No fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino). Un
microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos demicroorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de
carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadascarbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadas
libran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose entonceslibran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose entonces
intensificación del color.intensificación del color.

Consideraciones del TSIConsideraciones del TSI
Es importante respetar elEs importante respetar el tiempotiempo de lectura, porque si el caso 1 sede lectura, porque si el caso 1 se
lee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo es. Silee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo es. Si
el 2 se lee después de las 24hs, los microorganismo ya se quedanel 2 se lee después de las 24hs, los microorganismo ya se quedan
sin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar las peptonassin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar las peptonas
y se alcaliniza el medio.y se alcaliniza el medio.
Con respecto alCon respecto al sulfhídricosulfhídrico pueden presentarse distintaspueden presentarse distintas
modalidades:modalidades:
Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formación de gas,Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formación de gas,
esto se puede dar enesto se puede dar en SalmonellaSalmonella, se lee: alc/ac (SH2) (gas), se lee: alc/ac (SH2) (gas)
También se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro: se lee:También se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro: se lee:
ac/ac (SH2).ac/ac (SH2).
Además se puede visualizar en el tubo la producción deAdemás se puede visualizar en el tubo la producción de gasgas porpor
parte del microorganismo, entonces en el medio se observanparte del microorganismo, entonces en el medio se observan
burbujas, resquebrajamiento, o si no todo el medio de cultivoburbujas, resquebrajamiento, o si no todo el medio de cultivo
aparece levantado.aparece levantado.

SIM (SULFHÍDRICO – INDOL –SIM (SULFHÍDRICO – INDOL –
MOVILIDAD)MOVILIDAD)
FundamentoFundamento: Es un medio semi-sólido transparente que pone en: Es un medio semi-sólido transparente que pone en
evidencia la movilidad, la producción de triptofanasa y de SH2. Contiene:evidencia la movilidad, la producción de triptofanasa y de SH2. Contiene:
Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se poneTriptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone
de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovacde manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac
Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2
ennegrecen el medio de cultivoennegrecen el medio de cultivo
Si los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido seSi los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido se
produce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en laproduce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la
punción.punción.
ProcedimientoProcedimiento: se inocula el microorganismo por: se inocula el microorganismo por punciónpunción con ansa decon ansa de
punta. Se deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo sepunta. Se deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo se
agregan unas gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar poragregan unas gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar por
las paredes del tubo.las paredes del tubo.
Triptófano (+)Triptófano (+): observar la interfase, la aparición de un color rojo fucsia: observar la interfase, la aparición de un color rojo fucsia
brillante por la formación de un complejo entre el indol y el p-brillante por la formación de un complejo entre el indol y el p-
dimetilaminobenzaldehido.dimetilaminobenzaldehido.
M (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medioM (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medio
M (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medioM (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medio
M (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estríaM (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estría
M (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero noM (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero no
ennegreciendo de todo el medio).ennegreciendo de todo el medio).

SIM
SH2+ Ind+
Mot+
SH2+ Ind-
Mot-
SH2- Ind+
Mot+
SH2- Ind-
Mot-

Prueba de VP y RMPrueba de VP y RM

ROJO DE METILO – VOGESROJO DE METILO – VOGES
PROSKAUER:PROSKAUER:
Fundamento:Fundamento: El acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en laEl acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la
fermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de ciertofermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto
numero de vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producciónnumero de vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción
de acetoína (acetil-metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. Ende acetoína (acetil-metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. En
presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilopresencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilo
y ely el αα naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo.naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo.
ProcedimientoProcedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos
pruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva apruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a
incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs..incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs..
Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para laLuego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la
de VP.de VP.
Rojo de metiloRojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la
superficie del medio aparece un color rojo intenso es RM (+) =superficie del medio aparece un color rojo intenso es RM (+) =
microorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pHmicroorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pH
menor a 4,4.menor a 4,4.
VPVP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es
esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacudeesencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude
suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de colorsuavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de color
rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).

ONPG (O-NITROFENIL-β-ONPG (O-NITROFENIL-β-
GALACTOPIRANÓSIDO)GALACTOPIRANÓSIDO)
Fundamento:Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa yLo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa y
permeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir depermeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir de
la lactosala lactosa
La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en laLa permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la
célula bacteriana.célula bacteriana.
Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer deHay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de
permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en realidad son lactosas (+).permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en realidad son lactosas (+).
Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-)Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-)
Procedimiento:Procedimiento: Hacer un inóculo con SF estéril, agregar un disco de papelHacer un inóculo con SF estéril, agregar un disco de papel
comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.
InterpretaciónInterpretación: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo
es productor de β-galactosidasa= prueba (+).es productor de β-galactosidasa= prueba (+).
ConsideracionesConsideraciones
Se hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, seSe hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, se
agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs.agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs.

CITRATOCITRATO
Fundamento:Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellosSirve para poner de manifiesto aquellos
microorganismos que utilizan el citrato como únicamicroorganismos que utilizan el citrato como única
fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol.fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol.
Procedimiento:Procedimiento: El color original del medio es verde, yEl color original del medio es verde, y
se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembrase encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra
se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC.se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC.
InterpretaciónInterpretación: Si el microorganismo utiliza citrato, se: Si el microorganismo utiliza citrato, se
produce alcalinización del medio de cultivo pasando ésteproduce alcalinización del medio de cultivo pasando éste
a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva paraa color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para
el citrato.el citrato.

UreasaUreasa
Positivo Negativo

UREA:UREA:
microorganismo que poseen la enzima ureasa.microorganismo que poseen la enzima ureasa.
Procedimiento:Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flautaEl medio fraccionado en pico de flauta
contiene urea y rojo de fenol como indicador, el colorcontiene urea y rojo de fenol como indicador, el color
original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembraoriginal del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra
se realiza con ansa de punta tanto en profundidad comose realiza con ansa de punta tanto en profundidad como
en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C.en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C.
InterpretaciónInterpretación: Si el microorganismo es productor de: Si el microorganismo es productor de
ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco,ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco,
consecuentemente produce alcalinidad que seconsecuentemente produce alcalinidad que se
manifiesta porque el medio toma un color fucsia.manifiesta porque el medio toma un color fucsia.

FENIL-ALANINA-DESAMINASAFENIL-ALANINA-DESAMINASA::
microorganismo que poseen la enzimamicroorganismo que poseen la enzima FENIL-FENIL-
ALANINA-DESAMINASA.ALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con unEl medio se prepara con un
pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre lapico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la
superficie del medio de cultivo.superficie del medio de cultivo.
Procedimiento:Procedimiento: Se siembra sobre la superficie delSe siembra sobre la superficie del
medio solamente, se incuba 24 hs a 35º C, se revelamedio solamente, se incuba 24 hs a 35º C, se revela
con cloruro férrico.con cloruro férrico.
InterpretaciónInterpretación: El color original es amarillo, si el: El color original es amarillo, si el
microorganismo es productor de la enzima, al agregarmicroorganismo es productor de la enzima, al agregar
sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone desobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de
manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.

AMINOÁCIDOS:AMINOÁCIDOS:
DESCARBOXILASAS:DESCARBOXILASAS:
Fundamento:Fundamento: Las descarboxilasas son enzimas sustrato-Las descarboxilasas son enzimas sustrato-
específicas (presentes o no en los microorganismos) capaces deespecíficas (presentes o no en los microorganismos) capaces de
reaccionar con la porción carboxilo (COOH) de AA formandoreaccionar con la porción carboxilo (COOH) de AA formando
aminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida comoaminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida como
descarboxilación, forma C02 como producto secundario. Cadadescarboxilación, forma C02 como producto secundario. Cada
descarboxilasa es específica para un aminoácido.descarboxilasa es específica para un aminoácido.
Lisina, arginina y ornitina son los aminoácidos evaluados de rutinaLisina, arginina y ornitina son los aminoácidos evaluados de rutina
en la identificación de enterobacterias.en la identificación de enterobacterias.
El medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con másEl medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con más
frecuencia. El aminoácido se agrega a la base. El color original esfrecuencia. El aminoácido se agrega a la base. El color original es
lila.lila.
Procedimiento:Procedimiento: Se inoculan por punción 2 tubos y se sellan conSe inoculan por punción 2 tubos y se sellan con
aceite mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no.aceite mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no.
InterpretaciónInterpretación: Si el aminoácido es descarboxilado, se forman: Si el aminoácido es descarboxilado, se forman
aminas alcalinas y el medio pasa a violeta más intenso. Si no esaminas alcalinas y el medio pasa a violeta más intenso. Si no es
descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por ladescarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por la
formación de ácidosformación de ácidos

Lisina Hierro Agar (LIA)Lisina Hierro Agar (LIA)
LIA – SH2 - LIA + SH2 - LIA + SH2 -

LIA:
Agar de ensayo para la demostración simultánea de lisina decarboxilasa
(LD) y de la formación de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificación
de enterobacterias.
► La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas
que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al
violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol,puesto que la
descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a
6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio
decultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo
puede utilizarse para la diferenciación de bacterias que fermentan
glucosa.
► Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa,
producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al
violeta. La formación de H2S produce una coloración negra debido al
sulfuro de hierro producido.

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