Parte 06 del Módulo IV del Diplomado en Hematología y Banco de Sangre. Ponente: Dr. Carlos Esquerre Aguirre Fecha: 13 de Setiembre de 2015. Trujillo - Perú.

1. DIPLOMADO EN HEMATOLOGÍA Y
BANCO DE SANGRE
MÓDULO IV (13 de Setiembre de 2015)
CLASE 6

2. 2
INVESTIGACIÓN DE
ANTICUERPOS IRREGULARES

3. GENERALIDADES
 Los aloanticuerpos antieritrocitarios, diferentes
de los Ac naturales anti-A o anti-B se
denominan inesperados o irregulares.
 Un aloanticuerpo es aquél Ac que se produce
como resultado de la exposición de un
organismo a Ag extraños.
Desde el punto de vista de la medicina
transfusional, los Ac contra los Ag sanguíneos se
clasifica como: 3

4. GENERALIDADES
 Ac contra Aloantígenos: Los que se producen
contra Ag de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.
 Ac contra los propios Ag del individuo:
Autoanticuerpos contra Ag. eritrocitarios y
plaquetas y los producidos en enfermedades
autoinmunes.
De tal forma se considera a los anticuerpos
autoinmunes como anticuerpos irregulares o
adquiridos y a los aloanticuerpos los podemos dividir
en:
4

5. GENERALIDADES
 Regulares naturales: producidos con el
Sistema ABO (anti-A y anti-B).
 Irregulares naturales: anti A1, anti-M,
anti-N, anti-P1, anti-E, entre otros.
 Irregulares adquiridos o inmunes:
antisistema Rh-Hr (anti-D, anti-c, anti-C
y otros), anti-Kell, anti-Duffy.
5

6. GENERALIDADES
 Ac naturales regulares:
Preferentemente Ig M. Fijan
de manera eficiente el
complemento. Pueden
provocar lisis intravascular
insuficiencia renal e incluso
la muerte del paciente.
6
 Ac adquiridos o inmunes :
Generalmente Ig G.
Producen hemólisis
extravascular en el bazo o
en el hígado, mediante
fagocitosis del complejo
eritrocito + Ac.

7. 7
Son aquellos capaces de inducir reacción hemolítica con
acortamiento “in vivo” de la vida de los hematíes incompatibles o en
la EHRN.
Sinónimo: Aloanticuerpos.
Por estimulación antigénica:
– Transfusión de hematíes
– Embarazos o abortos
– Mecanismos desconocidos
Incidencia:
– Población general 0,3 a 2,0%.
– Politransfundidos 9%.
¿Qué son Anticuerpos Irregulares?
¿Cómo se forman los aloanticuerpos?
37°C C’

8. 8
¿Son importantes?
Ac. considerados importantes o potencialmente
peligrosos de significado clínico:
– Anti-D (D, C, c, E, e), Kell, Duffy, SsU, Diego
(Dla)
Ac. que pueden ser de significado clínico o
importancia cuestionable:
– Anti-Lea, Leb, -M, -N, -P1, I, Cartwright.
Ac. que casi nunca presentan significado clínico
o sin importancia:
– Anti-Ch/Rg (Chido/Rodgers), York (yka),
Sda, Xga, Bg.

9. 9
¿Cuándo estudiarlos?
Suministro de sangre compatible: Type & Screen
(GS + Detección anticuerpos).
Evaluación prenatal: Mujer Rh- sin anti-D
(inmunoprofilaxis) ó ↑↑ título (evaluación fetal).
Evaluación de la EHRN: Identificar la causa.
Evaluación de anemias hemolíticas: Causa,
clasificar, sangre compatible, aloanticuerpos
escondidos.
Resolución de reacciones transfusional hemolítica:
Investigación de la causa, reacción tardía (10
Ac/GR)

10. 17/09/2015 10
Objetivos de Investigar Anticuerpos
- Conocer la presencia de anticuerpos clínicamente
significativo fuera del sistema ABO.
- Obtener los conocimientos teóricos y básicos para la
realización de esta prueba.
- Comprobar que los pacientes no tengan anticuerpos
no esperados (anticuerpos irregulares). Los únicos
esperados deben ser los correspondientes al Sistema
ABO.
- Asegurar la supervivencia de los hematíes y minimizar los
riegos para la salud del paciente.

11.  Aglutinación en medio macromolecular
(albúmina, dextrán, gelatina, polivinilpirrolidona-
PVP); la albúmina incrementa la constante
dieléctrica del agua, lo que disminuye el potencial
Z. El dextrán y el PVP potencializan la reacción con
puentes de polímeros.
 Prueba Coombs; es útil para poner de manifiesto
anticuerpos incompletos o sensibilizantes.
 Soluciones de baja fuerza iónica; reducen la
barrera electroestática facilitando la reacción Ag-
Ac. 11
ELEMENTOS QUE INFLUYEN EN LA REACCIÓN
Ag-Ac EN LA BÚSQUEDA DE ANTICUERPOS
IRREGULARES

12.  Enzimas; potencializan la reacción Ag-Ac reduciendo la
superficie de carga y removiendo estructuras que interfieren en
el acceso de las moléculas del Ac.
 Centrifugación; acelera la reacción Ag-Ac, por la fuerza que
produce la misma.
 Temperatura; afecta la reacción Ag-Ac de acuerdo a la T°
óptima de reacción: 4 a 22°C para los Ac fríos, o 37°C para los
Ac calientes.
 Proporción de Ag-Ac; importante en la búsqueda de la zona
de equivalencia de la reacción Ag-Ac.
12
ELEMENTOS QUE INFLUYEN EN LA REACCIÓN
Ag-Ac EN LA BÚSQUEDA DE ANTICUERPOS
IRREGULARES

13. 13
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS
POR CÉLULAS PANTALLA
Reactivos:
 NaCl 9%
 Suspensión de GR del
donante 5%
 Célula Pantalla I
 Célula Pantalla II
 Albúmina 22%
 Antiglobulina humana
poliespecífico
 Célula Control de Coombs
IDENTIFICACIÓN DE
ANTICUERPOS POR CÉLULAS
PANEL
Reactivos:
 NaCl 9%
 Suspensión de GR del
donante 5%
 Células Panel
 Albúmina 22%
 Antiglobulina humana
poliespecífico
 Célula Control de Coombs
Sinónimos:
Detección, pantalla, escrutinio, pesquisa, rastreo,
screening, tamizaje, Coombs indirecto.

14. 17/09/2015 14
Células que se utilizan para
detección de anticuerpos
antieritrocitarios.
Generalmente vienen
identificadas con números
romanos I,II, III.
Son preparadas a partir de
sangre donada por
individuos de grupo
sanguíneo O.
CÉLULAS PANTALLA CÉLULAS PANEL
Son glóbulos rojos
seleccionados con antígenos
de grupo sanguíneo
conocidos.
Provienen de distintos
individuos.
Para ser funcional el panel de
glóbulos rojos debe identificar
con certeza los
aloanticuerpos significativos.

15. Panel

16. 17/09/2015 16
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS POR
CÉLULAS PANTALLA

17. 17
Técnica en Tubo
Enumerar los tubos como I, II, III según sea el caso 2 ó 3 células.
Fase Salina
2 gotas de suero + 1 gota de GR,
centrifugar y leer.
Fase Térmica o Albúmina
2 gotas de Albúmina al 22% e incubar
(37°C x 30’).
Centrifugar y leer.
Fase Coombs o AGH
Lavar 3 veces con SSF 0.9%. Decantar.
2 gotas de suero Coombs (AGH).
Centrifugar, leer e interpretar.
Si en negativo adicionar 1 gota de
Célula Control Coombs.

18. 18
Técnica en Gel
En un microtubo
(LISS/Coombs):
- 50 ul de GR
- 25 ul de suero/plasma
- Incubar 37°C x 15
minutos
- Centrifugar y leer.

19. 19
Interpretación de los Resultados :
Células Pantalla
Negativo:
La reacción negativa en todas las células indica
la ausencia de anticuerpos irregulares.
Positivo:
Una reacción positiva en 1 ó 2 células y un
autocontrol (-) hace pensar la presencia de un
aloanticuerpo.
Donde hay una reacción positiva en todas las
células de la prueba y un autocontrol (+), puede
ser debido a un autoanticuerpo.

20. 20
IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR
CÉLULAS PANEL

21. 21
Técnica en Tubo
Enumerar tantos tubos como muestras tenga el panel (1,2,3,4, hasta
11 o según sea el caso más células).
Fase Salina
2 gotas de suero problema + 1 gota de GR del reactivo panel, en cada uno
de los tubos rotulados.
En el tubo para el autocontrol colocar 1 gota de GR al 5% del propio
paciente, mezclar, centrifugar y leer.
Fase Térmica o Albúmina
2 gotas de Albúmina al 22% e incubar (37°C x 30’).
Centrifugar y leer.
Fase Coombs o AGH
Lavar 3 veces con SSF 0.9%. Decantar.
2 gotas de suero Coombs (AGH).
Centrifugar, leer e interpretar.
Si en negativo adicionar 1 gota de Célula Control Coombs.

22. 22
Interpretación de los Resultados :
Células Panel
POSITIVO:
La aglutinación presente en 1 o más tubos del panel con
autocontrol (-). Nos indica la presencia de 1 o más Ac de
los Ag presentes en el panel.
NEGATIVO:
Ninguna aglutinación en todos los tubos indica la
ausencia de Ac perceptibles a los Ag listados en el panel.
AUTOCONTROL POSITIVO:
Indica presencia de autoanticuerpo.
TÉCNICAS ESPECIALES:
Como autoabsorción (elución) pueden ser requeridas
para revelar el aloanticuerpo subyacente.

23. 23
Ejemplo:
INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS
IRREGULARES
I II III

24. 24
DETECCION DE ANTICUERPOS IRREGULARES
4 posibilidades
F
S
F
A
F
3
7
°
F
C
- - + +
- - - -

25. 25EN ESTE PANEL SE IDENTIFICA QUE EL ANTICUERPO TIENE ACTIVIDAD EN FASE 37°C Y
CON EL SUERO ANTIGLOBULINA HUMANO: ES TIPO Ig G.
descartados
F
S
F
A
F
3
7
FC
- - + +
- - + +
- - - -
- - - -
- - + +
- - - -
- - - -
- - - -
- - + +
- - + +
- - - -
- - - -
- - - -
- - - -
- - - -
- - - -

26.  ¿ES LO MISMO UN AUTOANTICUERPO QUE
UN ALOANTICUERPO?
Un autoanticuerpo : anticuerpo que esta
dirigido contra antígenos propios del paciente,
pueden ser específicos (el paciente presenta
un fenotipo Rh: EeC y presenta anti-e, anti-E) e
inespecíficos (panaglutininas: aglutinan todo
con una característica homogénea).
 Un aloanticuerpo es un anticuerpo que esta
dirigido contra un antígeno que el paciente
no posee. (El paciente presenta un fenotipo
Rh: ECc y presenta un anti-e)

27.  REALIZAR LA PRUEBA DE COOMBS DIRECTO
(CD)
Esto es para discernir entre la presencia de un
posible autoanticuerpo o un aloanticuerpo.
 CD (+): Posibilidad de estar frente un
autoanticuerpo o un aloanticuerpo + autoac
¿De que dependerá?
Historia transfusional del paciente¿Ha recibido
unidades de sangre?
 Sí (no descartar los aloanticuerpos, siempre y
cuando el tiempo de la transfusión no exceda de
los 90 días)
 No (descartar los aloanticuerpos)

28. FINALIDAD
* Detección de Anticuerpos Incompletos (IgG)
dirigidos contra antígenos del Glóbulo Rojo.
LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA

29. FINALIDAD
* Detección de Fracciones de Complemento
Fijados en la membrana del Glóbulo Rojo.
LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
C3d
C3b
C3d
C3b
C3d

30. En resumen:
El principio de la prueba de
A.G.H es detectar
inmunoglobulinas de la clase
Ig G y/o fracciones del
Complemento unidos a los
glóbulos rojos.

31. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)
o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)
FINALIDAD
* Detección de GR sensibilizados “in vivo”
- Anticuerpos y/o Complemento fijados en la
membrana del GR en el torrente sanguíneo.

32. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)
o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)
=
GR sensibilizados
“in vivo”
Suero de Coombs
poliespecífico
(Anti-IgG
Anti-C3d) REACCIÓN
POSITIVA

33. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)
o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)
APLICACIONES DEL TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)
1.- Investigación de Reacc. Hemolíticas Transf.
2.- Investigación de E. H. R. N.
3.- Investigación de A. H. A. I.
4.- Investigación de Anemias Hemolíticas
inducidas por Drogas.

34. Interpretacion:
Si la prueba muestra aglutinación , se
interpreta POSITIVA, significa que
hubo sensibilización IN VIVO de los
eritrocitos y se informa:
PAD Positiva , señalando en cruces la
intensidad de la reacción, por ej. 4 +
Si no hubo aglutinación, la prueba es
NEGATIVA, y significa que no hubo
sensibilización IN VIVO

35. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
TÍTULO Y SCORE DEL TEST DE COOMBS
EQUIVALENCIA ENTRE EL
GRADO DE AGLUTINACIÓN Y EL SCORE
Grado de Aglutinación Score
4 + 10
3 + 8
2 + 6
1 + 4
1/2 + visibles a simple vista 3
1/2 + visible al microscopio 1
0 o ausencia de aglutinación 0

36. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
TÍTULO Y SCORE DEL TEST DE COOMBS
IMPORTANCIA DEL TÍTULO Y SCORE
TÍTULO del test
de Coombs (Anti-
IgG)
2 4 8 16 32 64 SCORE
4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 46MUESTRA 1
3+ 3+ 2+ 1+ 0 0 26MUESTRA 2
TÍTULO del test
de Coombs (Anti-
IgG)
2 4 8 16 32 64 SCORE
4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 48MUESTRA 1
4+ 4+ 3+ 3+ 1+ 1+ 44MUESTRA 2
Caso 1
Caso 2

37.  CD: 2+
 CD Monoespecífico
IgG IgA IgM C3c C3d Ctl
2+ 0 0 0 0 0

38. Existen una serie de técnicas que permiten
realizar procedimientos que proporcionan
ayuda en ciertas determinaciones.
Las uniones Ag Ac se rompen por medios
físicos ó químicos (éter,xileno,digitonina)
  Elución por calor (Físico).
  Elución por glicina ácida (químico).
  Elución por cloroquina (químico).
  Absorción

39.  Elución por calor:
Consiste en disociar los anticuerpos
adosados al hematíe aplicando calor (56 °C)
por un tiempo de 10 min. Los hematíes se
incuban en una solución de albumina al 6% v/v
en un tubo de vidrio en constante agitación,
luego se centrifuga por 5 min a 3500 rpm y el
sobrenadante obtenido se denomina eluato.
 Ventajas: se puede trabajar el eluato a
manera de suero se puede enfrentar a
pantalla para determinar que ac es y también
se puede trabajar con los hematíes tratados.
 Desventajas: ocasiona hemólisis de los
hematíes y se corre el riesgo de perder sitios
antigénicos.

40.  Elusión por Cloroquina
Mediante esta técnica se puede realizar el
desprendimiento de los anticuerpos y
despejarlos de los hematíes, se agrega un
volumen de hematíes lavados frente a
cuatro de cloroquina y se deja a T°ambiente
por una hora.
 Ventajas: los hematíes no son sometidos
al calor y se trabajaría con ellos.
 Desventajas: No se puede trabajar con el
eluato

41. CD de los hematíes

42. ¿Cómo saber que tipo de técnica de
elución utilizar?
 Dependerá de lo que se quiera realizar y
con lo que se desee realizar.
 Si se desea realizar autoabsorciones
utilizando los hematíes del paciente:
elución por calor/ cloroquina.
 Si sólo deseo trabajar con el eluato:
elución por calor.

43. ¿Qué es una autoabsorción?
 Consiste en enfrentar el plasma del paciente
con los hematíes eluidos con la finalidad de
disminuir la cantidad de autoanticuerpos del
plasma (plasma autoabsorbido).
 Tiene como finalidad dejar limpio el plasma de
autoanticuerpos para poder evidenciar la
presencia o ausencia de aloanticuerpos en el
paciente.
 En px, Si al exponer a la pantalla es( +): se trata
sólo de autoac + aloanticuerpos; si es (-), sólo
se trató de autoanticuerpos.

44.  La detección de un Ac y su identificación,
constituyen una de las prácticas más
interesantes en el campo de la
Inmunohematología.
 Muchos de éstos Ac son problemas
complejos, que requieren ciertas facilidades
en el laboratorio para su resolución y de
parte del investigador, exigen tiempo y
experiencia.
44
CONCLUSIONES: