1. 谷氨酸菌的诱变 选育
生物 101
陈彬璇
25 号

2. 谷氨酸产生菌的主要特征
1. α - 酮戊二酸氧化能力微弱 : α - 酮戊二酸脱氢酶
丧失或活性低 .
2. 柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以
及谷氨酸脱氢酶活性强 .
3. 还原性辅酶Ⅱ ( NA D PH + H + ) 进入呼吸链能力缺
陷或微弱 .
4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱 .
5. 不利用谷氨酸 .
6. 耐高糖耐高谷氨酸 .
7. C O 2 固定能力强 .
8 . 解除谷氨酸反馈抑制 .

3. • 谷氨酸产生菌中谷氨酸的生物合成途径如图所
示：其中的代谢途径包括糖酵解途径 (EMP) 、磷
酸己糖途径 (HMP) 、三羧酸循环 (TCA 循环 ) 、
乙醛酸循环、伍德 - 沃克曼反应 (CO2 固定反应 )
等。葡萄糖经过 EMP( 主要 ) 和 HMP 途径生成丙
酮酸，其中一部分氧化脱羧生成乙酰 CoA 进入
TCA 循环，另一部分固定 CO2 生成草酰乙酸或
苹果酸，草酰乙酸与乙酰 CoA 在柠檬酸合成酶催
化下，所合成柠檬酸，再经过氧化还原共扼的氨
基化反应生成谷氨酸。
• 关键酶： α- 酮戊二酸脱氢酶，谷氨酸脱氢酶

5. 出发菌株
菌悬液制备
原生质体制备
硫酸二乙酯诱变
紫外线诱变
单氟乙酸平板筛选
原生质体再生
高糖平板筛选
香豆素和氯化锂平板筛选
高谷氨酸平板筛选 谷氨酸为
唯一碳源平板筛选
摇瓶筛选
摇瓶筛选

6. 硫酸二乙酯诱变
• 硫酸二乙酯成为
非常重要的植物
诱变剂用来培育
新的品种 , 快速而
且高效。
• 制诱变悬浮液

7. 单氟乙酸 平板筛选
它是乌头酸酶的抑制剂
抗单氟乙酸的菌株可增强酶活力
如三羧酸循环图示
浓度 0.5%
32ºC 避光
36~48h

8. 高糖和高谷氨酸平板筛选
1 、上一步骤中抗单菌株涂
在 25% 葡萄糖的平板上，
挑选生长良好的菌株
2 、再将此菌株涂布在
20% 谷氨酸平板上，挑选
生长良好的菌株。

9. 摇瓶筛选
上述菌株接入摇瓶发酵培养基中进
行发酵，比较 各菌株的谷氨酸产
量，选出谷氨酸高产菌株。
具体培养基成分，待老师给出吧。

10. 原生质体制备
• 概念： G+ 菌经过溶菌酶或者青霉素（也可
用果胶酶以及纤维素酶）处理后，可完全
除去细胞壁，形成 仅由细胞膜包着细胞质
的菌体。
• 具体操作看课本 P79

11. 物理方法诱变
• 以上原生质体悬液放入培养皿进行紫外线
照射，绘制照射时间与致死率的曲线
• 射线照射的目的是造成供体细胞染色体的
断裂，使其一部分或全部在发育过程中被
丢失，以达到只转移部分性状进入受体从
而得到非对称杂种或胞质杂种的目的。
那菌株会往哪个方向突变呢

12. 原生质体的 再生
• 用高渗稳定液对原生质体悬液进行
稀释，再涂平板，计算原生质体再
生率

13. 香豆素和氯化锂平板筛选
• 香豆素维 P 类，可以降低细胞的通透性
，所以我们选育维 P 类衍生物，可以改
变细胞膜的渗透性，有利于谷氨酸从胞
内渗出，可以解除对谷氨酸脱氢酶的反
馈调节。
• 当谷氨酸合成达到一定量时，谷氨酸
就会反馈抑制和阻遏谷氨酸脱氢酶，使
谷氨酸的合成停止，使代谢转向天冬氨
酸的合成。

14. 选育不利用谷氨酸
的菌株
• 将上述抗维 P 类衍生
物的菌株接种在以谷
氨酸为唯一碳源的平
板上，培养后挑选生
长微弱或不生长的菌
株。

15. 摇瓶筛选
经谷氨酸为唯一碳源平板筛选后，在进行
摇瓶筛选。
上述菌株接入摇瓶培养基中进行发酵，比
较 各菌株的谷氨酸产量，选出谷氨酸
高产菌株。

16. • 工业上利用谷氨酸棒
状杆菌 大量累积谷氨
酸应采用的最好的 方
法是改变菌体细胞膜
的通透性。

17. sum up

18. 1. 切断或减弱支路代谢
•
⑴ 选育减弱 α- 酮戊二酸进一步氧化能力的突变株
从谷氨酸生物合成的代谢途径可以看出，减弱 α- 酮戊二
酸脱氢酶复合体的活性，可以使代谢流向谷氨酸，从而
使谷氨酸得到积累。
• ⑵ 选育减弱 HMP 途径后段酶活性的突变株 从葡
萄糖到丙酮酸的反应是由 EMP 途径和 HMP 途径组成的。
但是，通过 HMP 途径也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、
芳香族氨基酸、辅酶 Q 、维生素 K 、叶酸等物质。这些
物质的生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的产率降低。这可
通过选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长
的突变株以及抗嘌呤、嘧啶类似物或核苷酸类抗生素
• ⑶ 选育不分解利用谷氨酸的突变株
•
⑷ 选育减弱乙醛酸循环的突变株
• ⑸ 阻止谷氨酸进一步代谢 由于细胞还可以谷氨酸
为前体继续向下合成谷氨酰胺等，应切断该过程

19. 2. 解除菌体自身的反馈调节
•
⑴ 选育耐高渗透压突变株 要使
菌种能高产谷氨酸 , 首先要使菌种具备在
高糖、高谷氨酸的培养基中仍能正常生
长、代谢的能力，即在高渗培养基中菌
体的生长和谷氨酸的合成不受影响或影
响很小。
• ⑵ 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶
反馈调节的突变株

20. 3. 增加前体物的合成
•
⑴ 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸
到 α- 酮戊二酸代谢的突变株 这可通过
选育柠檬酸合成酶活力强突变株及抗氟乙
酸、氟化钠、重氮丝氨酸、氟柠檬酸等突
变株来实现。
⑵选育强化 CO2 固定反应的突变株

21. 4. 提高细胞膜的渗透性
•
⑴ 选育抗 Vp 类衍生物突变株
• ⑵ 选育溶菌酶敏感突变株。
•
⑶ 选育二氨基庚二酸缺陷突变株。
•
⑷ 选育温度敏感突变株

22. 5. 强化能量代谢
• 谷氨酸高产菌的两个显著特点是 :α- 酮戊二酸继续向
下氧化的能力微弱和乙醛酸循环微弱，使能量代谢受阻，
TCA 循环前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢可弥补上述
两点不足，使 TCA 循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速
度加快。
• ⑴ 选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二
酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来实现。
• ⑵ 选育 ADP 磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育
2,4- 二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实现。
• [3] 选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如
可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。

23. 乙醛酸循环
• 在异柠檬酸裂解酶的催化下，异柠檬酸被
直接分解为乙醛酸，乙醛酸又在乙酰辅酶
A 参与下，由苹果酸合成酶催化生成苹果
酸，苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过
程。
• CO2 固定反应：表面上是二氧化碳被固定
于丙酮酸生成草酰乙酸的反应。

24. 调控机制：
• 一．谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量
后，谷氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反阻
遏，代谢转向合成天冬氨酸。
• 二．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化 CO2 固定的关键
酶，受谷氨酸的反馈抑制。
• 三．柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷
调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏。
• 四．谷氨酸脱氢酶受谷氨酸的反馈抑制和阻遏。

25. 温度
• 谷氨酸菌体最适生长温度为 30-32℃ ；谷
氨酸最适合成温度为 34-37℃ ；发酵初期
温度提高可以缩短细胞生长时间，减少发
酵总时间；发酵中、后期的菌体活力较
强，适当提高发酵温度有利于细胞膜渗透
性和产酸，故温度应控制稍高一些。

26. 生物素添加量的不同
• 生理作用：维生素 H 与酶结合参与体内二
氧化碳的固定和羧化过程，与体内的重要
代谢过程如丙酮酸羧化而转变成为草酰乙
酸，乙酰辅酶 A 羰化成为丙二酰辅酶 A 等
糖及脂肪代谢中的主要生化反应有关
生物素过量：菌体大量繁殖，不产或少产
谷氨酸。
• 生物素不足：菌体生长不好，谷氨酸产量也低。
• 生物素亚适量：菌体生长，谷氨酸产量很高

27. the end ~