1. Tutor Divisi Imunologi PEMERIKSAAN VIRAL LOAD TEKNOLOGI NASBA Febtarini. R,dr/ Endang Retnowati,dr,MS,Sp.PK (K) Rabu, 8- September- 2010

6. 5

7. Plasma Serum HIV-1 HTLV-1 HCV HBV HHV-6 Whole blood HIV-1 CMV Factor V Leiden Lymph nodes/skin biopsies HIV-1 Sputum/Saliva HRV Influenza Virus Measles virus Cervical swabs HIV-1 HPV Urine Measles virus Faeces HIV-1 CMV astrovirus Cells HIV-1 HTLV-1 CMV CSF HIV-1 JCV LCMV mumps virus Semen HIV-1 6

9. Contoh: Pemeriksaan viral load HIV dengan sampel tetesan darah kering 1. persiapan sampel dan reagen 1 ml darah vena + EDTA Pipet & teteskan masing-masing 50 µl darah (ke lingkaran di kertas proteinsaver 903 Whatman ), beri identitas Px. Biarkan kering (3 s/d 24 jam, suhu kamar) Dimasukkan ke dalam kantong plastik Zip Lock yg telah diberi silika gel  ke dalam kantong Biohazard  amplop dan kirim ke Laboratorium 8

10. Kertas dikeluarkan Menyiapkan larutan premix : CAL + 550 µl CAL diluent + 550 µl larutan silika ( vortex ) 2. EKSTRAKSI 9

11. Magnetic separatio n Complex biological sample Pure nucleic acid 2. EKSTRAKSI 10 Proteins and Lipids Wash buffer 3. Purification of nucleic acid, removal of inhibitors Elution buffer 4. Recover nucleic acid in small volume Silica Low [GuSCN] pH > 8.0 Silica 2. Binding of nucleic acid High [GuSCN] neutral pH Sample + Lysis buffer Nucleic acid 1. Release of nucleic acid Stabilization High [GuSCN] neutral pH Function: Chemistry:

16. 15

17. 16

18. 17

19. 3. Real time PCR oligo P2 RT RT T7 RNAP anti-sense RNA RNase H oligo P1 oligo P1 RNase H & oligo P2 sense RNA T7 RNA polymerase Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase Fase Linier Fase amplifikasi 18 ( 5 menit ) ( 90 menit )

20. Molecular beacon DNA probe NASBA RNA amplicon SIGNAL: ++ “ open” NO SIGNAL “ closed” Deteksi 19 -Alat dinyalakan 2 menit (saat enzim diletakkan pd tutup eight tubes - Analizer mendeteksi 10- 10 7 turunan HIV RNA / ml darah -menggunakan 1 suhu( isothermal ) 41 0 C -Alat tersambung dg komputer & printer F Q G Q F

21. Amplifikasi real time PCR & deteksi oligo P2 RT RT T7 RNAP anti-sense RNA RNase H oligo P1 oligo P1 RNase H & oligo P2 sense RNA T7 RNA polymerase Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase Molecular beacon hybridization 20 F Q Q F Q F F Q

22. Deteksi ( Molecular beacon ) 0 10 20 30 40 50 60 Normalized fluorescence Fluorescent signal (real-time) NASBA reaction Time (minutes) 21 F Q Q F Q F F Q

23. Fluorescence Analyzer, Optics (Schematic layout) 22

24. 23 Desktop computer Strip centrifuge Incubator Analyzer

25. Interpretasi hasil Pasien 1 = 840.000 kopi/ml darah Pasien 5 = 110.000 kopi/ml darah Pasien 2 = 870.000 kopi/ml darah Pasien 6 = 620.000 kopi/ml darah Pasien 3 = 780.000 kopi/ml darah Pasien 7 = 290.000 kopi/ml darah Pasien 4 = TND Pasien 8 = 3300 kopi/ml darah 24

26. MOHON MAAF LAHIR - BATIN

32. Lysis buffer = Chaotropic agent Gu SCN/ guanidine thiocyanate Perbedaan NASBA dan PCR : NASBA PCR Target utama RNA Target utama DNA Isothermal ( 1 suhu ) 3 suhu RNA 3 enzim, DNA 4 enzim 2 Primer RNA 2 enzim, DNA 1 enzim 1 primer Continuous Cyclic ssRNA amplicons dsDNA amplicons Sampel sedikit, hemat waktu Real time PCR Lebih spesifik & sensitif Satu tabung tertutup Waktu lebih lama

33. RT-PCR rt-PCR bDNA NASBA *replikasi as. nukleat *deteksi capture amplikon,divisualisasi kan mell reaksi enzim/substrat (kolorimetrik) *enzim reverse transcriptase *hasil: Kuantitatif:ELISA Kualitatif: Gel *Amplifikasi signal Probe spesifik fluoresence * deteksi amplikon pd setiap siklus amplifikasi *hasil: grafik kuantitas jumlah turunan asam nukleat virus Proteinase K  RNA keluar  probe sintetik oligonukleotida berlabel alkali fosfatase & substrat  bDNA kompleks & signal dideteksi dg teknik chemiluminescense *deteksi 50-500.000 kopi/ml *amplifikasi signal isothermal *amplifikasi transkripsi RNA satu tabung *kalibrator internal *selektif HIV1RNA (pd HIV) * one step sandwich hybridization * deteksi 10-10 7 kopi/ml

36. Plasma Serum HIV-1 HTLV-1 HCV HBV HHV-6 Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Whole blood HIV-1 CMV Factor V Leiden Lymph nodes/skin biopsies HIV-1 Mycobacterium lepra Mycobacterium tuberculosis Sputum/Saliva HRV Influenza Virus Measles virus Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumoniae Cervical swaps HIV-1 HPV Chlamydia trachomatis Urine Measles virus Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Faeces HIV-1 CMV astrovirus Microspordia Campylobacter jejuni Campylobacter coli Cells HIV-1 HTLV-1 CMV CSF HIV-1 JCV LCMV mumps virus Measles virus Mycobacterium tuberculosis Borrelia burgdorferi Leptospira interrogans Semen HIV-1

43. PCR

46. Indikasi Pemeriksaan viral load pada HIV Indikasi klinik Informasi Penggunaan Sindroma HIV akut Menegakkan Dx (tes serologi antibodi HIV negatif atau meragukan) Diagnosis Evaluasi awal terhadap infeksi HIV yg baru ditemukan Data dasar viral load Keputusan mulai atau menunda terapi Setiap 3-4 bulan pd ODHA yg tidak mendapat terapi Perubahan dlm viral load Keputusan utk memulai terapi 2-8 minggu setelah memulai terapi ARV Penilaian awal terhadap kemanjuran obat Keputusan utk melanjutkan atau mengubah terapi 3-4 bulan setelah permulaan terapi Efek maksimal terapi Keputusan utk melanjutkan atau mengubah terapi Setiap 3-4 bulan pd ODHA dg terapi Kesinambungan efek dari ARV Keputusan utk melanjutkan atau mengubah terapi Peristiwa klinik atau penurunan sel CD4 yg bermakna Hubungan dg viral load yg berubah atau menetap Keputusan utk melanjutkan,memulai atau mengubah terapi