Recomendados
Recomendados
Mais conteúdo relacionado
Mais procurados
Mais procurados (18)
Semelhante a затевалов тема 2012
Semelhante a затевалов тема 2012 (20)
затевалов тема 2012
- 1. ФБУН МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора Затевалов Александр Михайлович Теоретическое обоснование интегральной оценки состояния микробиоценоза закрытых полостей организма, разработанной на основе биотехнологических методов исследования. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. 03.00.23 --Микробиология, биотехнология 03.00.23 Микробиология, биотехнология Научные консультанты: проффессор, д.м.н. Селькова Е.П. д.м.н. Алешкин А.В. Москва 2012 1
- 2. Цель работы Разработать теоретические принципы концепции интегральной оценки состояния микробиоценоза закрытых полостей организма и диагностические алгоритмы распознавания персистирующего инфекционного процесса с использованием биотехнологических методов исследования. 2
- 3. Задачи Задачи 1. Разработать интегральный подход к оценке состояния микробиоценоза закрытых 1. Разработать интегральный подход к оценке состояния микробиоценоза закрытых полостей организма, включающий создание диагностических и прогностических полостей организма, включающий создание диагностических и прогностических показателей, а также их референсных значений при ряде патологических состояний. показателей, а также их референсных значений при ряде патологических состояний. 2. Построить лабораторную модель дисбиотических нарушений для отработки 2. Построить лабораторную модель дисбиотических нарушений для отработки распознавания типа и степени нарушения микробного пищеварения, а также распознавания типа и степени нарушения микробного пищеварения, а также определения основных факторов, влияющих на развитие данного патологического определения основных факторов, влияющих на развитие данного патологического процесса. процесса. 3. Внедрить комплексную оценку состояния микробиоценоза закрытых полостей в 3. Внедрить комплексную оценку состояния микробиоценоза закрытых полостей в практику здравоохранения. Оценить степень эффективности ее диагностических и практику здравоохранения. Оценить степень эффективности ее диагностических и прогностических критериев. Определить экономический эффект от внедрения прогностических критериев. Определить экономический эффект от внедрения комплексного подхода. комплексного подхода. 4. Построить показатель антибиотикорезистенности штаммов, вызывающих 4. Построить показатель антибиотикорезистенности штаммов, вызывающих персистирующую инфекцию. персистирующую инфекцию. 5. Предложить методику оценки эффективности использования пре- и 5. Предложить методику оценки эффективности использования пре- и пробиотических препаратов и фагов при дисбиотических нарушений различного пробиотических препаратов и фагов при дисбиотических нарушений различного генеза, с целью индивидуализации процесса нормализации микробного генеза, с целью индивидуализации процесса нормализации микробного пищеварения. пищеварения. 3
- 4. Значение микрофлоры Значение микрофлоры • • • • Трофические и энергетические (включая чисто тепловые) Трофические и энергетические (включая чисто тепловые) Регулировка перистальтики кишечника Регулировка перистальтики кишечника • Участие в регуляции дифференцировки и регенерации тканей (в первую очередь, • Участие в регуляции дифференцировки и регенерации тканей (в первую очередь, эпителиальных) эпителиальных) • Детоксикация и выведение эндо- и экзогенных ядовитых соединений, разрушение мутагенов, • Детоксикация и выведение эндо- и экзогенных ядовитых соединений, разрушение мутагенов, активация лекарственных соединений. активация лекарственных соединений. • Поддержание ионного гомеостаза организма. • Поддержание ионного гомеостаза организма. • Образование и поставка сигнальных молекул (в том числе, нейротрансмиттеров), в частности • Образование и поставка сигнальных молекул (в том числе, нейротрансмиттеров), в частности ГАМК ГАМК • Стимуляция иммунной системы, стимуляция местного иммунитета, образование и секреция • Стимуляция иммунной системы, стимуляция местного иммунитета, образование и секреция нормальных иммуноглобулинов. нормальных иммуноглобулинов. • Обеспечение цитопротекции и колонизационной резистентности • Обеспечение цитопротекции и колонизационной резистентности • Ингибирование роста патогенов, адгезии патогенов к эпителию • Ингибирование роста патогенов, адгезии патогенов к эпителию • “Перехват” вирусов • “Перехват” вирусов • Поддержание физико-химических параметров гомеостаза приэпителиальной зоны • Поддержание физико-химических параметров гомеостаза приэпителиальной зоны • Поставка субстратов глюконеогенза, липогенеза. • Поставка субстратов глюконеогенза, липогенеза. • Участие в противоопухолевом надзоре • Участие в противоопухолевом надзоре • Стимуляция фагоцитоза эпителием профессиональными фагоцитами • Стимуляция фагоцитоза эпителием профессиональными фагоцитами • Синтез и поставка организму витаминов (В12, пант. к-ты и т.д.) • Синтез и поставка организму витаминов (В12, пант. к-ты и т.д.) 4
- 5. Распределение микрофлоры микрофлоры Микроорганизмы верхних дыхательных путей: Bacteroides, Branhamella, Corynebacterium, Neisseria, Streptococcus. Микроорганизмы кожи: Acinetobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Propiombacterium, Sraphylococcus, Pityrosponim, Trichophyton; Микроорганизмы женских половых органов: Bacteroides, Clostridium, Corynebacterium, Eubacterium, Fusobacterium, Lactobacillus, Mobiluncus, Peptostreptococcus, Streptococcus, Spirochaeta, Veillonella. Микроорганизмы полости рта: Actinomyces,Arachnia, Bacteroides, Bifidobacterium, Candida, Centipeda, Eikenella, Eubacteriun, Fusobacterium, Haemophilus, Lactobacillus, Leptotrichia, Neisseria, Propionibacterium, Selenomonas, Simonsiella, Spirochaeia, Streptococcus, Veillonella, Wolinella. Микроорганизмы тонкой кишки: Bifidobacterium, Eubacterium, Peptostreptococcus, Clostridium, Lactobacillus, Veillonella. Микроорганизмы толстой кишки: Acetovibrio, Acidaminococcus, Anaerovibrio, Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Campylobacter, Clostridium, Coprococcus, Disulfomonas, Escherichia, Eubacterium, Fusobacterium, Gemmiger, Lactobacillus, Peptococcus, Peptostreptoccocus, Propionibacterium, Roseburia, Selenomonas, Spirochaeta, Succinomonas, Streptococcus, 5 Veillonella, Wolinella;
- 6. Пищеварительная система организма Пищеварительная система организма Основные этапы пищеварения: Первичная ферментация •Полость рта: измельчение пищи, обработка слюной •Пищевод всасывание свободной глюкозы, спиртов. Ферментативное пищеварение •Желудок обработка пищи соляной кислотой, пепсином. •Тонкая кишка переваривание желчью и соком поджелудочной железы, всасывание растворенных питательных веществ Микробное пищеварение •Толстая кишка микробное переваривание, всасывание, утилизация токсинов, выработка тепла, витаминов.
- 7. Типы нарушения микробного пищеварения Нарушения микробного пищеварения Нарушения микробного пищеварения Неконтролируемый Неконтролируемый рост сахаролитической рост сахаролитической микролоры микролоры Пищевая Пищевая непереносимость непереносимость Воспалительный Воспалительный гнилостный гнилостный процесс процесс Угнетение микрофлоры Угнетение микрофлоры кишечника кишечника химиопрепаратами и химиопрепаратами и антибиотиками антибиотиками 7
- 8. Неконтролируемый рост сахаролитической микрофлоры Закисление среды Закисление среды Тощей ии двенадцати перстной Тощей двенадцати перстной кишки кишки стимулирует рост зация оллони чная к збыто и Деконъюгацией желчных сопровож Деконъюгацией желчных дается кислот, кислот, гидрокарбоксилированием гидрокарбоксилированием жирных кислот жирных кислот еждение ическое повр хим Слизистой оболочки Слизистой оболочки Непереваренных Непереваренных субстратов субстратов КК повышению уровней ЛЖК в повышению уровней ЛЖК в основном пропионовой основном пропионовой кислоты кислоты Сахаролитической Сахаролитической микрофлоры микрофлоры секреци я кишку Попадание в провоцирует ит вод при следует Воды, электролитов Воды, электролитов Неконтролируемый рост Неконтролируемый рост сахаролитической микрофлоры сахаролитической микрофлоры Раздражение гладкой Раздражение гладкой мускулатуры кишечника, мускулатуры кишечника, диарея диарея 8
- 9. Гнилостное нарушение - колит Доступ к слизистой оболочке Нарушение Нарушение муцинообразования муцинообразования Кишечные воспалительные Кишечные воспалительные клетки клетки тся ивирую акт секр ети рую т тся ивируе акт Самовоспалительный Самовоспалительный каскад каскад Иммунная система Иммунная система Просветные Просветные микробные агенты микробные агенты Цитокины; Цитокины; Метаболиты арахидовой кислоты; Метаболиты арахидовой кислоты; Протеазы; Протеазы; Оксид азота; Оксид азота; Токсичные кислородные радикалы. Токсичные кислородные радикалы. увелич ение в сасыва ния е кт ий эфф рующ имули ст поддерживает и усиливает Бактериальных Бактериальных агентов агентов Воспаление Воспаление 9
- 10. Комплексный анализ микрофлоры кишечника Комплексный анализ микрофлоры кишечника Копрологический анализ Оценка ферментативного пищеварения Определение концентрации ЛЖК Микробиологический анализ Характеристика функционального состояния микробного сообщества, аэробной и анаэробной микрофлоры 1.Выявление патогенов; 2.Характеристика ассоциаций условно – патогенной микрофлоры; 3. Определение грибов; 4.Определение дефицита бифидо и лактофлоры; 5.Определение антибиотико и фагочувствительности, а так же чувствительности к противогрибковым препаратам. Заключение Заключение 10
- 11. Комплексный анализ микрофлоры кишечника Метаболиты Биохимический анализ микрофлоры кишечника Чернышова С.А Продукция летучих жирных кислот б/х 1 г. 4 мес. Макроскопия Î áù èé óðî âåí ü ËÆÊ, ì ì î ëü/ã 15.12.10 39547 Консистенция Àýðî áî â Àí àýðî áî â без особенностей смешана с каловым детритом --- Кровь Àêòèâí î ñòü Запах Жир Àí àýðî áí û é èí äåêñ коричневый Слизь 147,85 неоформленная Цвет 29,055 мягкая Форма Ñàõàðàëèò è÷åñêàÿ 0,534 умеренное кол-во Соединительная ткань --- Растительная клетчатка непереваримая есть Растительная клетчатка переваримая Ï ðî ò åî ëèò è÷åñêàÿ умеренное кол-во Мышечные волокна переваренные Àêòèâí î ñòü разрозненые во всех п/зрения Мышечные волокна полупереваренные Èí äåêñ èçî êèñëî ò в допустимом кол-ве Мышечные волокна непереваренные 0,53 умеренное кол-во Крахмал внеклеточный 25% Óêñóñí àÿ 0% Ï àöèåí ò Í î ðì à Валериановая Капроновая 0,236 6,250 1,000 20,9 96,7 4,6 Ï ðî ï èî í î âàÿ Ï àöèåí ò --1-2 --- Яйца глист --- цисты простейших Стеркобилин слабоположительная Билирубин отрицательная Скрытая кровь, реакция отрицательная Воспалительный белок, г/л 0,3 Èçî âàëåðèàí î âàÿ 0,505 0,693 Âàëåðèàí î âàÿ Í î ðì à Заключение по анализу •отношение суммы концентрации всех ЛЖК •отношение суммы концентрации всех ЛЖК анаэробной микрофлоры к концентрации анаэробной микрофлоры к концентрации уксусной кислоты. уксусной кислоты. Протеолитический индекс Протеолитический индекс --- Биохимические показатели Èçî ì àñëÿí àÿ 20,1 Структурный индекс Структурный индекс •отношение суммы концентрации изокислот •отношение суммы концентрации изокислот ЛЖК к к их нормальным формам. Отношение ЛЖК их нормальным формам. Отношение суммы изомасляной, изовалериановой ии суммы изомасляной, изовалериановой изокароновой к к сумме масляной, изокароновой сумме масляной, валериановой и капроновой кислот. валериановой и капроновой кислот. --- 19,9 2,1 Ì àñëÿí àÿ --- Эпителий Ì àññî âû å êî í öåí òðàöèè ËÆÊ, ì ì î ëü/ã Óêñóñí àÿ скудное кол-во Эритроциты, ед. в п/зрения Пациент 0,079 1,919 0,000 Масляная --- Лейкоциты, ед. в п/зрения Î òí î ø åí èå èçî ô î ðì ê í î ðì àëüí û ì ô î ðì àì ËÆÊ Норма в скудном кол-ве Слизь 71% в скудном кол-ве Кристаллы Фосфаты Ï ðî ï èî í î âàÿ 76% Соли жирных кислот Кристаллы Оксалаты 17% 50% --- Кристаллы Шарко-Лейдена 15% 75% --- Жир нейтральный Ì àñëÿí àÿ --- Дрожжевые грибы Жирные кислоты 15% 8% единичные скопления в п/зрения Иодофильная флора патогенная 100% полупереваренный в большом кол-ве Иодофильная флора нормальная pH 7 Тип брожения --- Крахмал внутриклеточный 0,28 •суммарная концентрация ЛЖК уксусной, •суммарная концентрация ЛЖК уксусной, пропионовой, масляной, валериановой, пропионовой, масляной, валериановой, капроновой ии их изомеров. капроновой их изомеров. --- Микроскопия Остатки непереваренной пищи 0,387 Продукция летучих жирных кислот Продукция летучих жирных кислот 0,111 Èçî êàï ðî í î âàÿ •маркер благополучия микробного •маркер благополучия микробного пищеварения. пищеварения. 2,727 4,020 0,008 0,017 Êàï ðî í î âàÿ 0,008 Соотношение уксусной, пропионовой ии Соотношение уксусной, пропионовой масляной кислот масляной кислот 3,235 Концентрация масляной кислоты Концентрация масляной кислоты 1,207 В копрокультуре установлено недостаточное содержание стеркобилина, что указывает на желчеотделение по гипокинетическому типу, в сочетании с энтеральным синдромом. Уровень метаболизма микрофлоры понижен. Преобладает аэробная микрофлора. Активность сахаролитической и протеолитической микрофлоры в норме. •Один из самых важных метаболитов для •Один из самых важных метаболитов для питания колоноцитов. питания колоноцитов. 11 - показатель в норме - показатель вне нормы
- 12. Comprehensive Digestive Stool Analysis Comprehensive Digestive Stool Analysis Переваривание: Переваривание: Химотрипсин, Мясные волокна, Химотрипсин, Мясные волокна, Растительная клетчатка ... Растительная клетчатка ... Абсорбция: Абсорбция: Триглицериды, Холестерол, Триглицериды, Холестерол, Нейтральный жир ... Нейтральный жир ... Микробиология: Микробиология: Нормофлора, условно-патогенная Нормофлора, условно-патогенная микрофлора, грибы микрофлора, грибы Метаболические маркеры: Метаболические маркеры: Общий уровень кислот, масляная Общий уровень кислот, масляная кислота, соотношение ЛЖК кислота, соотношение ЛЖК Продукция летучих жирных кислот Продукция летучих жирных кислот Общий уровень >= 13,6 micromol/g Общий уровень >= 13,6 micromol/g Концентрация масляной кислоты Концентрация масляной кислоты Масляная кислота>= 2,5 micromol/g Масляная кислота>= 2,5 micromol/g 12
- 13. Структурный индекс Проанализированы результаты Проанализированы результаты 3000 комплексных анализов микрофлоры кишечника 3000 комплексных анализов микрофлоры кишечника Сравнительное исследование между Сравнительное исследование между Концентрациями ЛЖК, Концентрациями ЛЖК, их соотношениями ии индексами их соотношениями индексами Свойствами микрофлоры Свойствами микрофлоры высеваемой из кала высеваемой из кала Структурный индекс Зависит Не зависит от титра условно-патогенной микрофлоры (r=0,61) и особенной от её антибиотико-чувствительности (r=0,727). от соотношения анаэробной к аэробной микрофлоры, высеваемой из кала (r=0,0327). 13
- 14. Структурный индекс Зависимость от титра условно-патогенной Зависимость от титра условно-патогенной микрофлоры микрофлоры Зависимость от отношения концентраций Зависимость от отношения концентраций анаэробной и аэробной микрофлоры анаэробной и аэробной микрофлоры Структурный индекс Структурный индекс 0,8 0,7 0,8 0,6 0,7 0,5 y = 0,026x + 0,5018 R² = 0,6104 0,4 0,6 0,5 0,3 0,2 0,3 0,1 y = -0,0167x + 0,6695 R² = 0,0327 0,4 0,2 0,1 0,0 4 5 6 7 8 9 Титр условно-патогенной микрофлоры, Lg КОЕ/г 10 Зависимость от антибиотикочувствительности УПМ Зависимость от антибиотикочувствительности УПМ y = 0,0616x + 0,5467 R² = 0,727 0 1 2 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Соотношения титра анаэробной микрофлоры к аэробной Структурный индекс Структурный индекс 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 3 4 Средняя чувствительность к антибиотикам, отн. ед. (0 - 4) 5 Зависит от титра условнопатогенной микрофлоры и особенной от её антибиотикочувствительности. Не зависит от соотношения анаэробной микрофлоры к аэробной. 14
- 15. Структура и метаболизм микрофлоры кишечника Биопленка микроорганизмов Биопленка микроорганизмов Микроорганизмы 1011 клеток/см33распределены ввпристеночном слое муцина Микроорганизмы 1011 клеток/см распределены пристеночном слое муцина Муцин Муцин химически химически близок близок кк полисахаридной защитной капсуле полисахаридной защитной капсуле микробов, поэтому микроорганизмы микробов, поэтому микроорганизмы находятся вв своей среде на близком находятся своей среде на близком расстоянии (расстояние одной клетки) расстоянии (расстояние одной клетки) друг друг от от друга. друга. Такая Такая структура структура обеспечивает контакт сс химусом и обеспечивает контакт химусом и клетками между собой для быстрого клетками между собой для быстрого обмена продуктами метаболизма. обмена продуктами метаболизма. Через кишечную стенку ежесуточно проходит 10 литров жидкости, включая Через кишечную стенку ежесуточно проходит 10 литров жидкости, включая слюну, желудочный сок, желчные и печеночные секреты. слюну, желудочный сок, желчные и печеночные секреты. В противоположном направлении движется муцин со скоростью его В противоположном направлении движется муцин со скоростью его образования клетками слизистой оболочки. образования клетками слизистой оболочки.
- 16. Структура микробного сообщества Микроорганизм Микроорганизм Микроорганизм Микроорганизм Микроорганизм Микроорганизм Микроорганизм Микроорганизм Микроорганизм Микроорганизм Микробное сообщество Микробное сообщество Свойства Свойства сообщества сообщества отличаются от отличаются от свойств его свойств его микроорганизмов микроорганизмов Антибиотико Антибиотико устойчивость, устойчивость, устойчивость кк устойчивость механизмам механизмам естественной защиты естественной защиты 16 организма организма Единая Единая генетическая генетическая система система Муцин – Муцин – естественная естественная среда обитания среда обитания Единые Единые трофические трофические энергетические энергетические связи ссвнешним связи внешним миром миром Защитная капсула, Защитная капсула, среда быстрого среда быстрого обмена обмена метаболитами метаболитами
- 17. Микробное пищеварение Гидролиз. Полимеры расщепляются гидролазами, протеазами и липазами бактерий Биомасса Полимеры: ЛЖК •Уксусная •Пропионовая •Масляная •Валериановая •Капроновая •Изокислоты •Полисахариды; Жиры; •Белки. Расщепленные мономеры Бактериигидролитики Окисление мономеров. Экскретируется с фекалиями С фекалиями экскретируется только 2-4% ЛЖК. Низкомолекулярные соединения окисляются в клетках бактерий осмотрофов до ЛЖК. 17
- 18. Схема получения и утилизации ЛЖК в толстом кишечнике Летучие жирные Летучие жирные кислоты (8 видов) кислоты (8 видов) Микрофлора толстой кишки Микрофлора толстой кишки 101414 клеток 10 клеток ЛЖК, экскретируемые с калом Экскретируется с фекалиями С фекалиями экскретируется только 2-4% ЛЖК. Утилизируется эпителием. Масляная кислота утилизируется эпителиальными клетками кишечника как энергетический субстрат. Более 400 видов Более 400 видов Масляная Уксусная, пропионовая Всасываются в кровь. Достигнув печени, значительная часть ЛЖК сжигается в пероксисомах гепатоцитов. В крови, оттекающей от печени, концентрация ЛЖК существенно меньше и окончательной метаболизации кислоты подвергаются в клетках периферических тканей 18
- 19. Методы определения дисбиоза 1. Метод определения дисбиоза по количественному соотношению микроогранизмов в кале, определяемых микробиологическим посевом; 2. Метод определения дисбиоза по антогонистической активности аутофлоры; 3. Метод определения дисбиоза по антиинтерфероновой активности условно-патогенной микрофлоры; 4. Метод определения дисбиоза по липидным маркерам в биологических жидкостях с использованием метода ГХ-МС; 5. Метод определения дисбиоза по концентрации водорода в выдыхаемом воздухе; 6. Метод определения дисбиоза по концентрациям ЛЖК в кале, определяемых методом ГЖХ. 19
- 20. Комплексный анализ микрофлоры кишечника Микрофлора Патогенные энтеробактерии Бифидобактерии 0 9 Норма у взрослых, КОЭ/г. 8 9 7 0 -10 -10 0 10 8 25 % 6 5 . 10 10 9 5 8 % - + Линкомицин Левомицетин Чувствительность Флюконазол Доксициклин Гентамицин Налидиксовая кислота Цефазолин + + ++ + + Ципрофлоксацин антибиотики ++ + ++ ++ + ++ + ++ + - показатель вне нормы к противогрибковые пр. Кетоконазол - В копрокультуре установлено недостаточное содержание стеркобилина, что указывает на желчеотделение по гипокинетическому типу, в сочетании с энтеральным синдромом. Уровень метаболизма микрофлоры понижен. Преобладает аэробная микрофлора. Активность сахаролитической и протеолитической микрофлоры в норме. бактериофаги - + Итраконазол Бактериологическое исследование фекалий . - 1,0 - - - - 10 0,494 . 1,0 - - 2,0 - Норма у детей, Пациент, КОЭ/г. КОЭ/г. 10 10 % 7 % -10 5 10 -10 < 6 < 10 % 10 % 300 - 400 млн./г 5 10 Лактобактерии < < 10 5 5 400 - 1000 млн/г < 0 % < 10 0 < 10 - - Клотримазол Офлоксацин 1,207 - показатель в норме 25 4 4 < 5 0,008 Общее количество кишечной палочки ферментирующими свойствами < 10 0 < 4 4 10 Êàï ðî í î âàÿ 3,235 Кишечная палочка со слабовыраженными Лактозонегативная кишечная палочка Гемолизирующая кишечная палочка, % Коковые формы в общей сумме микроорганизмов, % Гемолизирующие стафилококки по отношению ко всем кокковым формам, % Энтерококки Протей 10 10 < < < 0,008 0,017 - 4,020 ++ + + + ++ + 0,111 Èçî êàï ðî í î âàÿ 2,727 + + + Заключение по анализу 4 0,693 Âàëåðèàí î âàÿ Í î ðì à 4 10 Èçî âàëåðèàí î âàÿ 20,1 Цитробактер 10 < 0,505 - Èçî ì àñëÿí àÿ Амфотерицин В - 0,3 + + - отрицательная Воспалительный белок, г/л 6 Скрытая кровь, реакция + + Высокочувствителен ++ Ï àöèåí ò отрицательная 19,9 2,1 Ì àñëÿí àÿ Билирубин + ++ + ++ + + + 4,6 Ï ðî ï èî í î âàÿ слабоположительная - 96,7 Стеркобилин Нистатин + ++ + + + + 20,9 --- Биохимические показатели Чувствителен Óêñóñí àÿ цисты простейших - Ì àññî âû å êî í öåí òðàöèè ËÆÊ, ì ì î ëü/ã --- - Капроновая 0,236 6,250 1,000 Яйца глист - 0,079 1,919 0,000 Масляная Валериановая --- Стрептококковый Секстафаг - Пациент --- Эпителий Стафилококковый Пиополивалентный Колипротейный Интенстинальный Клебсиелёзный - Норма 1-2 Эритроциты, ед. в п/зрения Î òí î ø åí èå èçî ô î ðì ê í î ðì àëüí û ì ô î ðì àì ËÆÊ --- Лейкоциты, ед. в п/зрения 6 Слизь Í î ðì à --- 10 Ï àöèåí ò скудное кол-во Кристаллы Фосфаты Óêñóñí àÿ --- Кристаллы Оксалаты 0% 5 10 в скудном кол-ве . Соли жирных кислот Кристаллы Шарко-Лейдена 71% 25% 4 10 - < 0 10 . в скудном кол-ве 1,5 Ï ðî ï èî í î âàÿ 76% --- Жирные кислоты 17% + Слабочувствителен + + Умеренночувствителен ++ + --- Жир нейтральный 15% 75% 50% --- Дрожжевые грибы Ì àñëÿí àÿ Устойчив 15% 8% единичные скопления в п/зрения Иодофильная флора патогенная 100% полупереваренный в большом кол-ве Иодофильная флора нормальная pH 7 Тип брожения --- Крахмал внутриклеточный 1,0 умеренное кол-во Крахмал внеклеточный 0,28 Клебсиелла < 10 < - 4 0 10 есть - 0,534 --- Растительная клетчатка непереваримая - умеренное кол-во Соединительная ткань Растительная клетчатка переваримая Ï ðî ò åî ëèò è÷åñêàÿ - Àêòèâí î ñòü умеренное кол-во Мышечные волокна переваренные Ñàõàðàëèò è÷åñêàÿ разрозненые во всех п/зрения Мышечные волокна полупереваренные Èí äåêñ èçî êèñëî ò в допустимом кол-ве Мышечные волокна непереваренные 0,53 Энтеробактер < 4 4 --- Микроскопия Остатки непереваренной пищи 0,387 Гафния 10 0 0 < --< Àí àýðî áî â 10 Àêòèâí î ñòü Àýðî áî â 10 смешана с каловым детритом Кровь < без особенностей Жир Àí àýðî áí û é èí äåêñ коричневый Запах Слизь 147,85 неоформленная Цвет 29,055 мягкая Форма < Консистенция Серрация Î áù èé óðî âåí ü ËÆÊ, ì ì î ëü/ã 39547 Псевдомонады Макроскопия 15.12.10 Другие неферментирующие Продукция летучих жирных кислот б/х 1 г. 4 мес. грамнегативные микроорганизмы Чернышова С.А Дрожжеподобные грибы Стрептококк Биохимический анализ микрофлоры кишечника (ципробай) Азитромицин Ампицилин Ванкомицин Метронидазол 20
- 21. Персистентная инфекция Наличие микробного сообщества, постоянно усиливающего свою корпоративную устойчивость к неблагоприятным факторам; Частота встречаемости биопленкообразования и антилизоцимной активности отражает адаптацию микрофлоры в макроорганизме; Подход с позиции симбиологии позволил определить системообразующий фактор микросимбиоза кишечника (антилизоцимную активность и биопленкообразование); Корреляция структурного индекса и индекса изокислот с антибиотикочувствительностью , может указывать на возможную взаимосвязь соотношений концентраций ЛЖК с другими признаками персистирующих микроорганизмов. 21
- 22. Дискриминантный анализ Применение многомерного дискриминантного анализа ЛЖК микрофлоры кишечника значительно усиливает мощность статистической обработки для оценки микробиоценоза по содержанию ЛЖК; Суть анализа сводится к построению решающего правила, позволяющего по результатам измерения параметров объекта (концентраций метаболитов микрофлоры) определить патологическое состояние или норму. 22
- 23. Моделирование антибиотик-ассоциированного дисбиоза на животных Вводили перорально Раствор антибиотика Доза Амоксициллин (АМЦ) 10 мг. Кларитромицин (КЛТ) Вскрывали Препарат 10 мг. Азитромицин (АЗТ) 2 мг. Левофлоксацин (ЛВЦ) 0,5 мг. Цефиксим (ЦФС) 2 мг. Фосфомицин (ФМЦ) 4 мг. Метотрексат (МТР) 0,1 мг. Преднизолон (ПНЗ) 0,2 мг. Доксициклин (ДКЦ) 0,7 мг. Вырезали и собирали Содержимое кишечника и часть кишки 23
- 24. Влияние дозы лактулозы Группы Амоксициклин + лактолуоза Вводили перорально Доза лактолуозы АМЦ 0 мг. АМЦ50Л АМЦ500Л Раствор антибиотика 5 мг. АМЦ2000Л Вскрывали 0,5 мг. 20 мг. Эффективность, % 20 15 10 5 Доза лактулозы, мг 0 Вырезали и собирали -5 0 5 10 15 20 25 -10 -15 -20 Содержимое кишечника и часть кишки -25 24
- 25. Влияние дозы и продолжительности приема лактулозы Раствор антибиотика Продолжительность 0 мг. 3 1,2 мг. 3 Азитромицин + лактулоза 6 мг. 3 Азитромицин 0 мг. 6 Азитромицин + лактулоза 1,2 мг. 6 Азитромицин + лактулоза Вскрывали Доза лактолуозы Азитромицин + лактулоза Вводили перорально Группы Азитромицин + лактолуоза 6 мг. 6 Азитромицин опыта, дни Вырезали и собирали Содержимое кишечника и часть кишки 25
- 26. Внедрение в клиническую практику комплексного биотехнологического подхода к оценке микробного пищеварения и преморбидного фона организма. Исследование тяжелых поражений микробного сообщества микрофлоры Исследование тяжелых поражений микробного сообщества микрофлоры пациентов нейрореанимационного отделения пациентов нейрореанимационного отделения Изучение состояния микробиоценоза ротоглотки и желудочно-кишечного Изучение состояния микробиоценоза ротоглотки и желудочно-кишечного тракта у больных с острыми респираторными заболеваниями. тракта у больных с острыми респираторными заболеваниями. Изучение нарушений микробиоценоза ЖКТ у детей с острым лимфобластным Изучение нарушений микробиоценоза ЖКТ у детей с острым лимфобластным лейкозом в период диспансерного наблюдения и эффективность коррекции лейкозом в период диспансерного наблюдения и эффективность коррекции микробиоценоза синбиотиком. микробиоценоза синбиотиком. Изучение микробного пищеварения и его коррекция синбиотиком в Изучение микробного пищеварения и его коррекция синбиотиком в программе медицинской реабилитации детей школьного возраста с программе медицинской реабилитации детей школьного возраста с хроническими хеликобактерассоциированными заболеваниями органов хроническими хеликобактерассоциированными заболеваниями органов пищеварения пищеварения Фармакоэкономический анализ комплексного диагностического подхода Фармакоэкономический анализ комплексного диагностического подхода 26
- 27. Исследование тяжелых поражений микробного сообщества микрофлоры пациентов нейрореанимационного отделения Цель работы: Выработка мероприятий по управлению рисками развития Цель работы: Выработка мероприятий по управлению рисками развития нарушения пищеварения у пациентов нейрореанимационного отделения нарушения пищеварения у пациентов нейрореанимационного отделения ОРИТ с диареей ОРИТ без диареи Контроль (до операции) 1. Комплексный анализ кала с выделением клостридий, с а/б 1. Комплексный анализ кала с выделением клостридий, с а/б чувствительностью чувствительностью 2. Комплексный анализ слюны с а/б чувствительностью 2. Комплексный анализ слюны с а/б чувствительностью 3. Определение sIgA в слюне. 3. Определение sIgA в слюне. 1. Оценка микробиоценоза кишечника и ротоглотки у пациентов в условиях 1. Оценка микробиоценоза кишечника и ротоглотки у пациентов в условиях подавления ее роста медикаментами. подавления ее роста медикаментами. 2. Определение факторов устойчивости микробного сообщества и 2. Определение факторов устойчивости микробного сообщества и выживаемости в условиях жесткого угнетения и прогрессирования выживаемости в условиях жесткого угнетения и прогрессирования внутрибольничной инфекции. внутрибольничной инфекции. 27
- 28. Изучение состояния микробиоценоза ротоглотки и желудочнокишечного тракта у больных с острыми респираторными заболеваниями. Цель работы: Установить особенности метаболической активности микроЦель работы: Установить особенности метаболической активности микрофлоры ротоглотки и кишечника и антибиотикочувствительность в флоры ротоглотки и кишечника и антибиотикочувствительность в зависимости от природы инфекционного процесса, преморбидного зависимости от природы инфекционного процесса, преморбидного состояния пациентов с ОРВИ различной этиологии. состояния пациентов с ОРВИ различной этиологии. Дети от 3 до 7 лет с ОРВИ Дети от 3 до 7 лет с ОРВИ Осложнённые пневмонией Не осложнённые пневмонией 1. Комплексный анализ кала с а/б чувствительностью 1. Комплексный анализ кала с а/б чувствительностью 2. Комплексный анализ слюны с а/б чувствительностью 2. Комплексный анализ слюны с а/б чувствительностью 3. ПЦР-диагностика возбудителя -- соскоб из носа 3. ПЦР-диагностика возбудителя соскоб из носа 4. ИФА слюны на содержание иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG, Sc) 4. ИФА слюны на содержание иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG, Sc) 1. Определить особенности метаболизма и персистирующих свойств ассоциантной 1. Определить особенности метаболизма и персистирующих свойств ассоциантной микрофлоры ротоглотки и кишечника при заболеваниях ОРЗ; микрофлоры ротоглотки и кишечника при заболеваниях ОРЗ; 2. Изучить положительное и отрицательное влияние схем лечения на состояние 2. Изучить положительное и отрицательное влияние схем лечения на состояние микрофлоры, а так же на механизмы естественной защиты организма. микрофлоры, а так же на механизмы естественной защиты организма. 28
- 29. Изучение нарушений микробиоценоза ЖКТ у детей с острым лимфобластным лейкозом в период диспансерного наблюдения и эффективность коррекции микробиоценоза синбиотиком. Цель работы: Установить особенности метаболической активности микро-флоры Цель работы: Установить особенности метаболической активности микро-флоры ротоглотки и кишечника у детей с онкологическими заболеваниями в период ротоглотки и кишечника у детей с онкологическими заболеваниями в период диспансерного наблюдения, оценить влияние поликомпонентного синбиотика диспансерного наблюдения, оценить влияние поликомпонентного синбиотика Бифидум-Мульти на микрофлору кишечника и ротоглотки. Бифидум-Мульти на микрофлору кишечника и ротоглотки. Дети (127 детей) от 3 до 15 лет, проходивших курс санаторного лечения. Дети (127 детей) от 3 до 15 лет, проходивших курс санаторного лечения. Гемобластозы Солидные опухоли 1. Комплексный анализ кала с а/б чувствительностью 1. Комплексный анализ кала с а/б чувствительностью 2. Комплексный анализ слюны с а/б чувствительностью 2. Комплексный анализ слюны с а/б чувствительностью 3. Определение sIgA в слюне. 3. Определение sIgA в слюне. 1. Оценка состояния микробиоценоза кишечника и ротоглотки у детей с онкологическими 1. Оценка состояния микробиоценоза кишечника и ротоглотки у детей с онкологическими заболеваниями в период диспансерного наблюдения заболеваниями в период диспансерного наблюдения 2. Разработка оптимальной схемы применения поликомпонентного синбиотика Бифидум2. Разработка оптимальной схемы применения поликомпонентного синбиотика БифидумМульти в комплексе реабилитационных мероприятий после перенесенного курса Мульти в комплексе реабилитационных мероприятий после перенесенного курса специальной терапии с целью снижения риска развития побочных клинических и специальной терапии с целью снижения риска развития побочных клинических и микроэкологических нарушений микроэкологических нарушений 29
- 30. Изучение микробного пищеварения и его коррекция синбиотиком в программе медицинской реабилитации детей школьного возраста с хроническими хеликобактерассоциированными заболеваниями органов пищеварения Цель работы: Изучить особенности метаболической активности микрофлоры Цель работы: Изучить особенности метаболической активности микрофлоры кишечника и влияние синбиотика Мульти-бифидум у детей школьного возраста с кишечника и влияние синбиотика Мульти-бифидум у детей школьного возраста с хроническими хеликобактерассоциированными заболеваниями органов хроническими хеликобактерассоциированными заболеваниями органов пищеварения, учавствующих в программе медицинской реабилитации пищеварения, учавствующих в программе медицинской реабилитации Дети (47 детей) от 7 до 14 лет, с хр. гастродуоденитом, период неполной клинической ремиссии. Дети (47 детей) от 7 до 14 лет, с хр. гастродуоденитом, период неполной клинической ремиссии. Принимающие Бифидум-мульти Не принимающие Бифидум-мульти 1. Комплексный анализ кала с а/б чувствительностью 1. Комплексный анализ кала с а/б чувствительностью 2. Комплексный анализ слюны с а/б чувствительностью 2. Комплексный анализ слюны с а/б чувствительностью 3. Определение лизоцима в слюне. 3. Определение лизоцима в слюне. 1. Оценка состояния микробиоценоза кишечника и ротоглотки у детей с хроническими 1. Оценка состояния микробиоценоза кишечника и ротоглотки у детей с хроническими хеликобактерассоциированными заболеваниями органов пищеварения хеликобактерассоциированными заболеваниями органов пищеварения 2. Изучение влияния поликомпонентного синбиотика Бифидум-Мульти в комплексе 2. Изучение влияния поликомпонентного синбиотика Бифидум-Мульти в комплексе реабилитационных мероприятий в программе медицинской реабилитации у реабилитационных мероприятий в программе медицинской реабилитации у пациентов с различной нозологической этиологией. пациентов с различной нозологической этиологией. 30
- 31. Фармакоэкономический анализ комплексного диагностического подхода Технология определения ЛЖК в биологических субстратах применяется в Технология определения ЛЖК в биологических субстратах применяется в линейке анализов, предлагаемых КДЦ института Габричевского линейке анализов, предлагаемых КДЦ института Габричевского • • • • • • • • Биохимический анализ микрофлоры Биохимический анализ микрофлоры кишечника; кишечника; Биохимический анализ микрофлоры Биохимический анализ микрофлоры ротоглотки; ротоглотки; Комплексный анализ микрофлоры Комплексный анализ микрофлоры кишечника; кишечника; Комплексный анализ микрофлоры Комплексный анализ микрофлоры ротоглотки; ротоглотки; Цена Биохимический анализ микрофлоры кишечника 1150 р. Комплексный анализ микрофлоры кишечника 1450 р. •Низкая цена; •Низкая цена; •Комплексность методов; •Комплексность методов; •Короткий срок исполнения анализов; •Короткий срок исполнения анализов; •Высокая информативность. •Высокая информативность. Рентабельность: Конкурентноспособность: Название анализа Достоинства анализов: Достоинства анализов: Аналог 1050 р. без копрологии 15000 р. Название анализа Себестоимость Стоимость Биохимический анализ микрофлоры кишечника 50 р. 1150 р. Комплексный анализ микрофлоры кишечника 150 р. 1450 р. 31
- 32. Научная новизна Научная новизна 1. Теоретически обоснована необходимость и достаточность комплексного подхода к 1. Теоретически обоснована необходимость и достаточность комплексного подхода к оценке микробного пищеварения и диагностике дисбиотических состояний, важной оценке микробного пищеварения и диагностике дисбиотических состояний, важной составляющей преморбидного фона и фактора риска развития инфекционных составляющей преморбидного фона и фактора риска развития инфекционных заболеваний. заболеваний. 2. Разработаны диагностические и прогностические критерии, позволяющие оценить 2. Разработаны диагностические и прогностические критерии, позволяющие оценить состояние микробного сообщества микрофлоры кишечника при различных типах состояние микробного сообщества микрофлоры кишечника при различных типах нарушений микробного пищеварения нарушений микробного пищеварения 3. Внедрить комплексную оценку состояния микробиоценоза закрытых полостей в 3. Внедрить комплексную оценку состояния микробиоценоза закрытых полостей в практику здравоохранения. Оценить степень эффективности ее диагностических и практику здравоохранения. Оценить степень эффективности ее диагностических и прогностических критериев. Определить экономический эффект от внедрения прогностических критериев. Определить экономический эффект от внедрения комплексного подхода. комплексного подхода. 4. Построить показатель антибиотикорезистенности штаммов, вызывающих 4. Построить показатель антибиотикорезистенности штаммов, вызывающих персистирующую инфекцию. персистирующую инфекцию. 5. Предложить методику оценки эффективности использования пре- и 5. Предложить методику оценки эффективности использования пре- и пробиотических препаратов и фагов при дисбиотических нарушений различного пробиотических препаратов и фагов при дисбиотических нарушений различного генеза, с целью индивидуализации процесса нормализации микробного генеза, с целью индивидуализации процесса нормализации микробного пищеварения. пищеварения. 32
Notas do Editor
- Уважаемые коллеги. Целью моей работы является разработать теоретические принципы концепции интегральной оценки состояния микробиоценоза закрытых полостей организма и диагностические алгоритмы распознавания персистирующего инфекционного процесса с использованием биотехнологических методов исследования.
- Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 1. Разработать интегральный подход к оценке состояния микробиоценоза закрытых полостей организма, включающий создание диагностических и прогностических показателей, а также их референсных значений при ряде патологических состояний. 2. Построить лабораторную модель дисбиотических нарушений для отработки распознавания типа и степени нарушения микробного пищеварения, а также определения основных факторов, влияющих на развитие данного патологического процесса. 3. Внедрить комплексную оценку состояния микробиоценоза закрытых полостей в практику здравоохранения. Оценить степень эффективности ее диагностических и прогностических критериев. Определить экономический эффект от внедрения комплексного подхода. 4. Построить показатель антибиотикорезистенности штаммов, вызывающих персистирующую инфекцию. 5. Предложить методику оценки эффективности использования пре- и пробиотических и фагов препаратов при дисбиотических нарушений различного генеза, с целью индивидуализации процесса нормализации микробного пищеварения.
- Значение микрофлоры для здоровья человека трудно переоценить. Микрофлора выполняет множество важнейших функций как по защите организма от инфекций, так и по переработке потребляемых субстратов в необходимые для нашей жизнедеятельности вещества.
- До 99% всей микрофлоры сосредоточено в толстом кишечнике. Если микрофлора других полостей организма служит в основном для защиты, то микрофлора кишечника необходима для микробного пищеварения и продукции метаболитов, витаминов и других полезных компонентов.
- Структуру пищеварения можно разделить на 3 части: Первичная ферментация, ферментативное пищеварение и микробное пищеварение. Первичная ферментация сводиться к измельчению пищи обработки амилазой слюны и всасыванием свободной глюкозы и спиртов. Ферментативное пищеварение – это обработка пищи соляной кислотой, пепсином, с дальнейшей обработкой желчью, соком поджелудочной железы и всасыванием растворенных питательных веществ. Микробное пищеварение – это расщепление мясных и растительных волокон, переваривание субстратов нерасщепленных при первичной ферментации и ферментативном пищеварении.
- По типу микробного пищеварения можно выделить 4 вида нарушений. Неконтролируемый рост сахаролитической микрофлоры, воспалительный гнилостный процесс, пищевая непереносимость, угнетение микрофлоры химиопрепаратами и антибиотиками.
- Микрофлора очень чувствительна к рН среды обитания. Закисление среды стимулирует рост сахаролитической микрофлоры, что может привести к ее избыточному росту. Причиной может быть, избыточная микробная колонизация тонкой кишки, количественные и качественные изменения нормальной микрофлоры начальных отделов толстой кишки, которые приводят к избыточной продукции органических кислот сахаролитической микрофлорой. Это проявляется увеличением осмолярности кишечного содержимого, снижением интракишечного уровня рН, нарушениями процессов пищеварения и всасывания. Микробная колонизация двенадцатиперстной кишки и избыточный бактериальный рост в тощей кишке сопровождаются деконъюгацией желчных кислот и гидрокарбоксилированием жирных. Результатом служит химическое повреждение слизистой оболочки, стимуляция интестинальной секреции воды и электролитов. Попадание непереваренных субстратов в толстую кишку провоцирует неконтролируемый рост сахаролитической микрофлоры и повышение общего уровня ЛЖК, в основном за счет уксусной кислоты. Высокие концентрациями пропионовой кислоты приводят к раздражению гладкой мускулатуры кишечника, что вызывает диарею. Развитие диареи может рассматриваться как защитная реакция организма от неконтролируемого роста толстокишечной микрофлоры.
- В последнее время большое значение уделяется роли индигенной микрофлоры в качестве одной из причин поддержания патологического процесса при неспецифическом язвенном колите. Объясняется это тем, что в результате нарушения муцинообразования и т.п. просветные микробные агенты и/или продукты их жизнедеятельности получают доступ к слизистой оболочке через нарушенный слизистый барьер, где они активируют кишечные воспалительные клетки, которые секретируют цитокины, метаболиты арахидоновой кислоты, протеазы, оксид азота и токсические кислородные радикалы, закрепляя воспалительный ответ. При этом нарушенное регулирование местного и системного звеньев иммунной системы приводит к активации самоподдерживающегося воспалительного каскада. В этот каскад вовлекаются про- и противовоспалительные медиаторы. Увеличение всасывания бактериальных агентов, нарушение симбионтных отношений между микрофлорой и организмом оказывают стимулирующий эффект на иммунную систему, поддерживают и усиливают воспаление.
- В нашем институте выполняется комплексный анализ микрофлоры кишечника. Схема представлена на слайде. Он состоит из трех составляющих: Копрологический анализ: Оценка ферментативного пищеварения; Определение концентрации ЛЖК: Характеристика функционального состояния микробного сообщества, аэробной и анаэробной микрофлоры; Микробиологическое исследование с определением антибиотико и фагочувствительности, а так же чувствительности к противогрибковым препаратам. Для формирования заключения данные копрологического анализа формализуются, данные по концентрациям ЛЖК сравниваются с референсными значениями, а данные микробиологического анализа проходят экспертную оценку и обрабатываются аналитической компьютерной программой, разработанной нашими специалистами.
- Перед вами лицевая сторона бланка лабораторного исследования – комплексного анализа микрофлоры кишечника, который выдается по результата исследования. Определение концентраций ЛЖК являются очень важной частью комплексного анализа. Масляная кислота – метаболит, по которому оценивают критичность уровня жизнеспособности микрофлоры. Масляная кислота служит питанием колоноцитов и ее недосточное количество приводит к их дистрофии и снижению численности микрофлоры в кишечной биопленке. Суммарный уровень ЛЖК является характеристикой метаболической активности. Соотношение уксусной, пропионовой и масляной кислот - маркер благополучия микробного пищеварения. Смещение соотношения в сторону уксусной кислоты указывает на недостаточную активность анаэробной микрофлоры, которая является доминирующей в микробиоценозе. Это является косвенным признаком угнетения собственной индигенной микрофлоры условно-патогенной. Для оценки структуры микробных сообществ можно использовать структурной индекс. Структурный индекс - это отношение суммарной концентрации метаболитов анаэробной микрофлоры к концентрации уксусной кислоты. Снижение структурного индекса указывает на преобладание условно-патогенной микрофлоры в микробиоценозе. Усиление протеолитической активности микрофлоры кишечника оценивается по индексу изокислот. Индекс изокислот - это доля изокислот в концентрации ЛЖК анаэробной микрофлоры. Увеличение индекса изокислот, связано с увеличением протеолитической активности анаэробной микрофлоры.
- В мировой практике приняты достаточно большие разбросы референсных значений для концентраций ЛЖК в кале. В качестве примера представлен анализ лаборатории Genova diagnostics США, Эшвил. По данным этой лаборатории концентрация масляной кислоты не должна быть менее 2,5 ммоль/г., а суммарная концентрация не должна снижаться ниже 13,6 ммоль/г. при этом верхней границы нормы в этом анализе нет. В этом анализе представлен комплекс параметров: переваривания; адсорбции; микробиологический посев; метаболические маркеры.
- В институте проводится постоянная работа по совершенствованию этого метода. Проанализировано 3 тысячи результатов комплексного анализа микрофлоры кишечника. Проведено сравнительное исследование между концентрациями ЛЖК, их соотношением, составом и свойствами микрофлоры, высеваемой из кала. Исследование показало, что структурный индекс (доля анаэробных ЛЖК) не коррелирует с соотношением анаэробной и аэробной микрофлоры, но зависит от количества условно-патогенной микрофлоры и еще больше от её антибиотикочувствительности. Показано, что чем больше условно-патогенной микрофлоры, тем больше ЛЖК анаэробной микрофлоры экскретируется с калом, хотя в норме эти ЛЖК доокисляются в просвете и всасываются эпителием кишечника. При этом более устойчивая к антибиотикам микрофлора выделяет с калом больше кислот анаэробной микрофлоры. Таким образом, с увеличением структурного индекса возрастает роль организованного микробного сообщества ассоциантной, чужеродной микрофлоры.
- Что подтверждено нашими исследованиями. Чтобы объяснить причину этого результата, необходимо рассмотреть структуру микробного сообщества с позиции биотехнологического подхода.
- Установлено, что большая часть эндосимбионтных бактерий располагается пристеночно (мукозная микрофлора) в виде микроколоний, фиксированных (адгезия) на эпителиоцитах толстой кишки благодаря наличию на их поверхности особых белковых соединений, именуемых лектинами. Лектины содержат гликопротеины и комплементарны рецепторам на наружной мембране колоноцитов, в состав которых входят сфинголипиды. Микроколонии бактерий защищены от внешних воздействий особой биопленкой. В ее состав входят экзополисахариды микробного происхождения и муцин — секрет бокаловидных клеток. Образующийся при этом экзополисахаридно-муциновый матрикс выполняет функции плаценты: через нее происходит обмен веществ между бактериями и содержимым толстой кишки. Меньшая часть микроорганизмов, обитающих в толстой кишке, располагается в ее просвете, находясь в «свободном плавании» .
- Микробное сообщество является наиболее распространенным способом существования микроорганизмов. Естественным свойством живой материи является самовоспроизводение и отторжение чужеродной материи. Микроорганизмы, объединенные в микробное сообщество, являются дискретной самовоспроизводящейся системой, и обладают свойствами живого самостоятельного организма, отторгающего «чужие» бактерии. Сообщество микроорганизмов организует единую генетическую систему в виде плазмид — кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром [10]. Последнее получило специальное определение, как социальное поведение микроорганизмов — Qvorum sensis [11, 12, 20].Среда естественного обитания кишечных микроорганизмов - биопленка, состоит в основном из муцина. Муцин химически близок к полисахаридной защитной капсуле микробов, поэтому микроорганизмы находятся в своей среде на близком расстоянии (расстояние одной клетки) друг от друга. Такая структура обеспечивает контакт с химусом и клетками между собой для быстрого обмена продуктами метаболизма. Свойства микроорганизмов ex sity (вне места обитания) существенно отличаются от свойств микроорганизмов в микробном сообществе и от свойств микробного сообщества в целом. Они обладают лучшей антибиотикоустойчивостью и устойчивостью к другим механизмам естественной защиты организма в рамках микробиоценоза. [1]
- На слайде схематично представлен процесс микробного пищеварения. С калом экскретируется от 2 до 4% количества ЛЖК образовавшихся в кишечнике. Этот процесс происходит в несколько этапов. Полисахариды, жиры и белки поступают в толстый кишечник в виде пищевого комка, где на них сорбируются бактерии гидролитики. Эти микроорганизмы - гидролитики - расщепляют полимеры до мономеров, далее они окисляются бактериями осмотрофами в просвете кишечника до летучих жирных кислот и других метаболитов.
- На слайде представлен сложнейший процесс образования и утилизации ЛЖК в толстом кишечнике. 90% состава ЛЖК представлено уксусной, пропионовой и масляной кислотами. Уксусная и пропионовая кислоты всасываются в кровь, а масляная служит питанием для коллоноцитов кишечника. Валериановая, капроновая, изокислоты, а так же остаток уксусной, пропионовой и масляной кислот экскретируются с калом. В процессе образования ЛЖК участвует около 400 видов микроорганизмов. Комплексным анализом микрофлоры кишечника определяется 8 летучих жирных кислот. Сопоставить между собой изменение концентраций 8-ми ЛЖК и 400 видов микроорганизмов очень сложно. Необходимо учитывать, что концентрация метаболитов, полученных в процессе пищеварения, зависит от количества воды в кале, от времени транзита и предпочтении пациента в питании.
- Таким образом, в кале содержится не более 10 % микроорганизмов, населяющих кишечник, и 2 - 4% количества летучих жирных кислот, образующихся, в кишечнике. Поэтому современные методы определения свойств микробиоценоза не дают полной информации о количественных соотношениях микрофлоры и о её качественном составе. Однако, такие свойства, как антибиотикочувствительность и чувствительность к агентам механизмов естественной защиты макроорганизма можно определить существующими методами довольно точно.
- Предложенные критерии: структурный индекс и средняя антибиотикочувствительность, позволят разработать интегральный подход к оценке состояния микробиоценоза закрытых полостей организма, включающий создание диагностических и прогностических показателей, а также их референсных значений при ряде патологических состояний.
- Иванов и соавт [13] было показано, что при эубиозе из кала высевается микрофлора одних и тех же штаммов, а при дисбиозе штаммы этих микроорганизмов все время меняются. Таким образом, предполагается наличие микробного сообщества живущего независимо от организма хозяина, постоянно усиливающее свою корпоративную устойчивость к неблагоприятным «внешним» факторам, а так же к механизмам естественной защиты человека. Частота встречаемости биопленкообразования и антилизоцимной активности микрофлоры определяет выживание микросимбионтов в организме хозяина и отражает адаптацию микрофлоры в макроорганизме. Эти признаки преобладали среди других факторов персистенции микросимбионтов как при нормобиоценозе, так и при дисбиозе кишечника. Подход к инфекции с позиции симбиологии позволил определить параметры важнейших физиологических функций выживания микроорганизмов, таких как размножение и персистенция (антилизоцимная активность и биопленкобразование), составляющих системообразующий фактор микросимбиоценоза кишечника. Корреляция структурного индекса и индекса изокислот с антибиотикочувствительностью, может указывать на возможную взаимосвязь соотношений концентраций летучих жирных кислот с другими признаками персистирующих микроорганизмов, таких как, антилизоцимная, антиинтерфероновая активность микрофлоры.
- Свойства концентраций ЛЖК - нормальное распределение значений, низкая корреляция показателей и корреляция со свойствами микробного сообщества, предполагают использование параметрических методов статистики, например, дискриминантного или дисперсного анализа. Применение многомерного дискриминантного анализа ЛЖК микрофлоры кишечника значительно усиливает мощность статистической обработки для оценки микробиоценоза по содержанию ЛЖК. Суть анализа сводится к построению решающего правила, позволяющего по результатам измерения параметров объекта (концентраций метаболитов микрофлоры) определить патологическое состояние или норму. Такое решающее правило выражается в классификационных функциях и расстояниях до центроидов в дискриминантном пространстве. Дискриминантное пространство образуется при проведении дискриминантного анализа над значениями измерений с заданной принадлежностью к группам.
- В настоящей работе проводилось исследование эффективности применения лактулозы для снижения вредного действия антибиотиков на микрофлору кишечника мышей. Здоровые животные были разделены на 11 групп в соответствии с получаемыми препаратами. Препараты в течение 3 - 7 дней вводили перорально с помощью зонда по 0,5 мл. Предварительно у животных отнимали корм и выдерживали в течение 2 часов, питание возобновляли через 1 час после дачи препарата. Исследовали концентрацию летучих жирных кислот (ЛЖК) в содержимом кишечника методом газожидкостной хроматографии. При помощи дискриминантного анализа рассчитана степень влияния на микрофлору кишечника.
- Животным вводили смесь по 0,5 мл перорально 1 раз в сутки в течение 6 дней. 1 группа получала дневную дозу 10 мг амоксициллина, 2 группа — дневную дозу 10 мг амоксициллина и 0,5 мг лактулозы, 3 группа — дневную дозу 10 мг амоксициллина и 5 мг лактулозы, 4 группа — дневную дозу 10 мг амоксициллина и 20 мг лактулозы. Максимальный эффект достигается при максимальной дозе лактолуозы, но и он не превышает 15%, а доза 5 мг. обладает отрицательной эффективностью, то есть усугубляет действие антибиотика.
- Исследовалось также влияние азитромицина на 3 день исследования и на 6 день исследования. Животным вводили смесь по 0,5 мл перорально 1 раз в сутки в течение 3 дней (суточная доза для животного при этом составляла 2 мг). После чего мышей усыпляли, вскрывали, собирали содержимое тонкого и толстого кишечника для анализа. Группам, которые исследовались 6 дней, после приема антибиотиков далее 3 дня перорально вводили плацебо, которое представляло собой 1 %-ный крахмал на физиологическом растворе, по той же схеме, что и антибиотик. Эту группу мышей усыпляли, вскрывали на 7 день, собирали содержимое тонкого и толстого кишечника для анализа. Из графика видно, что наибольшая эффективность из 3 предложенных доз - 20 мг. лактулозы. При исследовании эффективности лактулозы по отдельным метаболитам (концентрации масляной кислоты и суммарному уровню ЛЖК) и соотношению метаболитов также отмечалась недостаточная эффективность дозы лактулозы 5 мг., но из-за недостоверных различий групп можно было опираться только на тенденции и тренды. При использовании дискриминантного анализа все группы достоверно отличаются друг от друга, так как сравнение происходит не в одномерном пространстве, а в многомерном, где увеличивается число степеней свободы и за счет этого увеличивается разрешающая способность метода.
- Следующую главу диссертации планируется посвятить внедрению в клиническую практику комплексного биотехнологического подхода к оценке микробного пищеварения и преморбидного фона организма. Работа ведется совместно с госпиталем нейрохирургии им. Бурденко по исследованию тяжелых поражений микробного сообщества микрофлоры пациентов нейрореанимационного отделения; С МОНИКИ по изучению состояния микробиоценоза ротоглотки и желудочно-кишечного тракта у больных с острыми респираторными заболеваниями; Проведены исследования с ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии по изучению нарушений микробиоценоза ЖКТ у детей с острым лимфобластным лейкозом в период диспансерного наблюдения и эффективность коррекции микробиоценоза синбиотиком; с Нижегородским НИИ детской гастроэнтерологии по изучению микробного пищеварения и его коррекции синбиотиком в программе медицинской реабилитации детей школьного возраста с хроническими хеликобактерассоциированными заболеваниями органов пищеварения, а так же провести фармакоэкономический анализ комплексного диагностического подхода.
- Цель работы: Выработка мероприятий по управлению рисками развития нарушения пищеварения у пациентов нейрореанимационного отделения. Для исследования набираем 3 группы по 30 человек двухкратно на 3 - 6 день после поступления и за 4 - 5 дней до оперативного вмешательства. Методы исследования: Комплексный анализ кала, слюны и определение sIgA в слюне. В результате работы ожидаем получить оценку микробиоценоза кишечника и ротоглотки у пациентов в условиях подавления ее роста медикаментами. Определение факторов устойчивости микробного сообщества и выживаемости в условиях жесткого угнетения и прогрессирования внутрибольничной инфекции.
- Цель работы: Установить особенности метаболической активности микро-флоры ротоглотки и кишечника и антибиотикочувствительность в зависимости от природы инфекционного процесса, преморбидного состояния пациентов с ОРВИ различной этиологии. Для исследования набираем 2 группы по 30 человек двух - трехкратно на день поступления и через 10 дней, если возбудитель выделяется то на 30 день. Методы исследования: Комплексный анализ кала, слюны, ПЦР-диагностика возбудителя и определение иммуноглобулинов в слюне. В результате работы ожидаем Определить особенности метаболизма и персистирующих свойств ассоциантной микрофлоры ротоглотки и кишечника при заболеваниях ОРЗ и изучить положительное и отрицательное влияние схем лечения на состояние микрофлоры, а так же на механизмы естественной защиты организма.
- Цель работы: Установить особенности метаболической активности микро-флоры ротоглотки и кишечника у детей с онкологическими заболеваниями в период диспансерного наблюдения, оценить влияние поликомпонентного синбиотика Бифидум-Мульти на микрофлору кишечника и ротоглотки. Для исследования набирали 2 группы по 60 человек двухкратно на день поступления и через 30 дней. Методы исследования: Комплексный анализ кала, слюны и определение иммуноглобулинов в слюне. В результате работы отмечены глубокие нарушения микробиоценозов кишечника и ротоглотки, характеризующиеся сниженным общим уровнем, особенно уксусной кислоты. Существенное снижение бифидо и лактофлоры в кале. Применение поликомпонентного синбиотика Бифидум-Мульти способствовало увеличению общего уровня ЛЖК и увеличению титра Бифидо и лактофлоры в кале.
- В исследовании, проведенном совместно Нижегородским НИИ детской гастроэнтерологии в программе медицинской реабилитации больных гастродуоденитом изучалась эффективность применения синбиотика Нормоспектрум. Результаты исследования будут представлены в последующих докладах. На этом слайде представлены результаты эффективности применения синбиотика Нормоспектрум по результатам оценки концентраций ЛЖК в кале у пациентов с гастродоуденитами в сравнении до и после применения. Эффективность применения рассчитывали методами сравнения средних величин в группах отдельных метаболитов, их соотношений и дискриминантным методом. На графиках видно, что большой разброс значений концентраций и долей не дает возможности сделать однозначный вывод об эффективности применения симбиотика, применение дискриминантного анализа позволило определить группы с положительным и отрицательным эффектом приема синбиотика на фоне данной программы реабилитации.
- Следующую главу диссертации планируется посвятить внедрению в клиническую практику комплексного биотехнологического подхода к оценке микробного пищеварения и преморбидного фона организма. Работа ведется совместно с госпиталем нейрохирургии им. Бурденко по исследованию тяжелых поражений микробного сообщества микрофлоры пациентов нейрореанимационного отделения; С МОНИКИ по изучению состояния микробиоценоза ротоглотки и желудочно-кишечного тракта у больных с острыми респираторными заболеваниями; Проведены исследования с ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии по изучению нарушений микробиоценоза ЖКТ у детей с острым лимфобластным лейкозом в период диспансерного наблюдения и эффективность коррекции микробиоценоза синбиотиком; с Нижегородским НИИ детской гастроэнтерологии по изучению микробного пищеварения и его коррекции синбиотиком в программе медицинской реабилитации детей школьного возраста с хроническими хеликобактерассоциированными заболеваниями органов пищеварения, а так же провести фармакоэкономический анализ комплексного диагностического подхода.
- Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 1. Разработать интегральный подход к оценке состояния микробиоценоза закрытых полостей организма, включающий создание диагностических и прогностических показателей, а также их референсных значений при ряде патологических состояний. 2. Построить лабораторную модель дисбиотических нарушений для отработки распознавания типа и степени нарушения микробного пищеварения, а также определения основных факторов, влияющих на развитие данного патологического процесса. 3. Внедрить комплексную оценку состояния микробиоценоза закрытых полостей в практику здравоохранения. Оценить степень эффективности ее диагностических и прогностических критериев. Определить экономический эффект от внедрения комплексного подхода. 4. Построить показатель антибиотикорезистенности штаммов, вызывающих персистирующую инфекцию. 5. Предложить методику оценки эффективности использования пре- и пробиотических и фагов препаратов при дисбиотических нарушений различного генеза, с целью индивидуализации процесса нормализации микробного пищеварения.