2. 2
> 900 trabajadores, 5 plantas de
producción
I+D y fabricación de
biofarmacéuticos:
◦ Formulación aséptica de vacunas (HepB,
Hib, Penta)
◦ Proteínas recombinantes (Estreptokinasa,
GCSF)
◦ Biológicos naturales (alergénicos,
inmunomoduladores, antianémicos)
◦ Liofilización
BIOCEN: complejo científico-industrial
(Polo Biotecnológico de La Habana)
Experiencia personal:
18 años en I+D, Director Proyecto, vacunas terapéuticas alergénicas
Biología molecular, inmunología, alergología
Desarrollo farmacéutico, estudios preclínicos y clínicos
Registro de las primeras vacunas alergénicas en Cuba
4. 4
Instituciones a “ciclo completo”: Investigación-Producción-
Comercialización
Concentración en áreas de fortaleza:
Vacunas, adyuvantes
Proteínas recombinantes, procesos biotecnológicos
Ac monoclonales
Productos naturales
Neurociencias
Desarrollo de recursos humanos propios
Asimilación de tecnologías de avanzada
Biología molecular, genómica, proteómica, bioinformática, nanotecnologías
Enfocado hacia aplicaciones en la salud, encargo social
Política de Calidad y desarrollo de ambiente regulatorio
5. Fuente: Oficina Nacional de Estadísticas www.one.cu
5
116,2 110,3
130,8 123,7 112,5
152,9
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
2003 2004 2005 2006 2007 2008
%
Crecimientode la industria farmacéuticacubana
Dinámica medicamentos humanos (%)
Prod.física de farmacéuticos y botánicos (1989=100%)
minería
39%
farmacéuticos
10%
ind. azucarera
6%
industria
del tabaco
7%
pesca
2%
agropecuarios
0%
otros
36%
Exportacionescubanas 2008
11. Biomoléculas (alto peso molecular 5-200KDa, estructura compleja,
procesos biológicos)
Heterogeneidad y variabilidad en su estructura
◦ variantes aa, glicosilación, interacciones con el medio
◦ aún mayor para productos naturales con múltiples moléculas (vacunas)
Inmunogenicidad
◦ Deseable en vacunas
◦ No deseable en otros biofarmacéuticos
Degradación (condiciones de conservación, formulaciones estables)
Proceso productivo más complejo y variable
Concepto de actividad biológica
Enfoque regulatorio específico
Nuevos “propietarios”
¿Genéricos?
“Biosimilares”
12. Investigación
básica
(descubrimiento/inven
ción)
• Biología Molecular
• Inmunología
• Farmacología
Desarrollo
• Farmacéutico
•Procesos fabricación
•Formulación
•Analítico
•Estabilidad
• No clínico
•Toxicología
•Farmacología
• Ensayos Clínicos
• REGISTRO
Producción
•Mejora continua
•Cambios
•Estabilidad continuada
•Desarrollo clínico post-
comercialización
13. Escalas de laboratorio (centros de investigación, universidades)
Salidas:
◦ Caracterización de la(s) molécula(s);
Actividad biológica
Estructura, secuencia aa /ADN (identidad)
Funcionalidad (inmunogenicidad) en modelos animales o in-vitro, prueba de
concepto
◦ Métodos preliminares de obtención
Sistema de expresión (rec)
Banco celular (bacterias, levaduras, hibridomas, células superiores)
Extracción y purificación
◦ Propiedad Intelectual, Patente (transferencia tecnológica)
¿GLP?, ¿GMP?
Análisis preliminar de factibilidad
económica/comercial/regulatoria
14. Desarrollo de procesos
- Escalado/adaptación a
tecnologías industriales GMP
- Ingrediente activo
- Formulación (prod. terminado)
- Consistencia
- Producción lotes GMP
Desarrollo analítico
- Métodos específicos
- Métodos de Farmacopea
- Materiales de Referencia
Validación
Evaluación preclínica
(no clínica)
Toxicidad, Farmacocinética
Farmacodinámica
(inmunogenicidad y protección)
Validación
Transferencia
(introducción)
Mejora continua
Consistencia
Transferencia
(introducción)
Mejora continua
F I F II F III
Estudios de Estabilidad (tiempo real)
- Ingrediente activo
- Producto terminado
Registro
GMP
15. 0
20
40
60
80
100
Escala productiva
Validación Proc. Asépticos
Validación Procesos IFA
Validación Métodos Analíticos
EMEA CHMP/QWP/185401/2004 “GUIDELINE ON THE REQUIREMENTS TO
THE CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL QUALITY DOCUMENTATION
CONCERNING INVESTIGATIONAL MEDICINAL PRODUCTS IN CLINICAL TRIALS
GLP
16. F I F II F III
Características física s, químicas y
biológicas.
IFA
Banco de células
Actividad biológica
Secuencia aa
IFA
IFA
Estructura terciaria
Perfil glicosilación, etc
Composición cualitativa y cuantitativa. PFT PFT PFT
Especificaciones.
I FA (exc. perfil
impurezas)
PFT
IFA (exc. perfil de
impurezas)
PFT
IFA
PFT
Validación de métodos analíticos. Posible Posible IFA y PFT
Descripción del proceso de fabricación
IFA: preliminar, (incl..
remoción de virus)
PFT
IFA: (incl.. estabilidad
celular)
PFT
IFA
PFT
Preparación de referencia
IFA
Actividad biológica
Descripción del sistema de cierre -
envase contenedor
PFT IFA y PFT IFA y PFT
Certificados Analíticos IFA y PFT IFA y PFT IFA y PFT
Estabilidad PFT, 6 meses
IFA
PFT: 3 lotes, 6 meses
IFA
PFT: 3 lotes pilotos, 12
meses
Reg. No. 21 - 2008 CECMED. REQUISITOS PARA LA AUTORIZACIÓN Y MODIFICACIÓN DE
ENSAYOS CLÍNICOS (www.cecmed.sld.cu)
Información Químico-Farmacéutica y Biológica (Parte II)
17. Estabilidad
◦ Q1A(R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products
Validación analítica
◦ Q2(R1) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology
Calidad de los productos
◦ Q5A(R1) Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or
Animal Origin
◦ Q5B Quality of Biotechnological Products : Analysis of the Expression Construct in Cells Used for
Production of r-DNA Derived Protein Products
◦ Q5C Quality of Biotechnological Products : Stability Testing of Biotechnological/Biological Products
◦ Q5D Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of
Biotechnological/Biological Products
◦ Q5E Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their
Manufacturing Process
Especificaciones
◦ Q6B Specifications : Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological
Products
GMP
◦ Q7 Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients
18. Especificación: lista de parámetros de calidad, límites y métodos
de ensayo
Persigue describir y confirmar la calidad del producto, no su
completa caracterización
Propiedades moleculares y biológicas de mayor pertinencia para
la:
◦ Seguridad
◦ Eficacia
Aplicable a:
◦ Materiales de partida y productos intermedios
◦ Sustancia activa (ingrediente activo)
◦ Producto terminado
Estrecha relación con el proceso productivo, la evaluación no
clínica y clínica
ICH Q6B Specifications : Test Procedures and Acceptance Criteria for
Biotechnological/Biological Products
19. Ingrediente activo
Apariencia y descripción
Identidad
◦ Combinación ensayos FQ
e IQ
Pureza e impurezas (de
proceso)
Potencia (actividad
biológica)
Cantidad (masa)
Producto terminado
Además de las del IFA:
Pruebas generales
(Farmacopeas):
Esterilidad/Límite
microbiano
Endotoxinas en
inyectables
Materia particulada en
inyectables
Uniformidad
Humedad en liofilizados
20. Actividad biológica:
◦ Atributo imprescindible para productos biológicos (imposibilidad técnica
de determinar estructura molecular en cada lote)
◦ Funcionalidad (conservación de estructura terciaria)
◦ Relevante para la eficacia (o seguridad)
Potencia: (expresada en unidades): Medida cuantitativa de la actividad biológica
Cantidad o contenido (masa): medición físico-química.
Métodos in-vitro (ex-vivo)
• Celulares: respuesta
bioquímica o fisiológica
• Bioquímicos
Ej. actividad enzimática
• Reacciones ligando-receptor
Inmunoensayos
Ej. ELISA de competencia
Métodos in vivo (bioensayos)
• En modelos animales: respuesta
del organismo
Ej. Inmunogenicidad de vacunas
• En humanos
Ej. Actividad alergénica por
prueba de punción en vacunas
de alergenos, para referencias
21.
22. Selección de “metámetros”
Función dosis-respuesta
Precisión (variabilidad intrínseca)
Método estadístico de las rectas paralelas
Potencia relativa
Conc.
señal
Compara la función de respuesta
con respecto a un referencia
• mayor especificidad
• mayor precisión
24. 0.53 -1.87Intradermal parallel test (ID50 EAL) [5]
Method Precision (CI95%)
Parallel Skin Prick Test
(σ = 0.103)
0.628 - 1.594
IgE Inhibition ELISA (BIOCEN) 0.60-1,66
SPT Test Histamine standard 10 mg/mL
(Nordic Guidelines) [7]
~ 0.3 – 3.0
0.53 -1.87Intradermal parallel test (ID50 EAL) [5]
Method Precision (CI95%)
Parallel Skin Prick Test
(σ = 0.103)
0.628 - 1.594
IgE Inhibition ELISA (BIOCEN) 0.60-1,66
SPT Test Histamine standard 10 mg/mL
(Nordic Guidelines) [7]
~ 0.3 – 3.0
A method for relative potency determination of new In-House
Reference batches of allergen products, by parallel Skin Prick Test
AAlexis Labrada, Yunia Oliva, Maytee Mateo, Raúl L Castro, Arelis Más, Bárbara Navarro*
Allergens Dept., National Center of Bioproducts (BIOCEN), Havana, Cuba
(*) Poly-clinic Capdevila, Boyeros, Havana, Cuba
e-mail: labrada@biocen.cu
AllergenVaccines 2009
Varadero, Cuba
25. Marcadores de actividad biológica
Ensayos de contenido de proteínas o antígenos
Ejemplo:
◦ Contenido Der s 1/Der p 1 (alergenos de ácaros) por ELISA-MAb
◦ Correlación con la actividad alergénica total (in-vivo)
r = 0,88
N= 9, p= 0,002
26. Contenido de proteína(s)
Electroforesis
◦ SDS-PAGE
◦ IEF
◦ Electroforesis capilar
Cromatográficos
◦ HPLC
Estructura
◦ Mapeo peptídico
◦ Espectrometría de Masa (PM)
◦ Secuencia N-terminal aa
◦ Espectrometría (Dicroísmo circular)
28. Perfil de PM de las proteínas del extracto alergénico de Blomia
tropicalis. SDS-PAGE en condiciones reductoras
29. Western Blotting IgE (perfil alergénico) como ensayo
semicuantitativo
29
SDS-PAGE
Inmunodetección
IgE sérica
Anti IgE
marcada
Análisis densitométrico
Metámetro: Altura de los picos
N
30. Asegurar que un procedimiento analítico dará
resultados reproducibles y confiables
Validación prospectiva con criterios de
aceptación pre-establecidos, en una serie de
ensayos
31. Identificación Impurezas Contenido/
Potencia
Cuant. Límite
Exactitud - + - +
Precisión
- Repetibilidad
- Precisión intermedia
/Reproducibilidad
-
-
+
+
-
-
+
+
Especificidad + + + +
Límite de
detección/cuantificación
- + + -
Linealidad - + - +
Rango - + - +
ROBUSTEZ: debe ser considerado en la fase de desarrollo
34. 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 10 100 1000
Concentración de Der p1 (ng/ml)
D.O.450nm
Rango lineal
Y = m • Log ( x) + n
Bioensayos: generalmente no lineales
Ej. ELISA
35. Sensibilidad analítica (Límite de cuantificación)
35
Assay range
ELISA-MAb Der s 1
ELISA-MAb Der p 1
ELISA-PolyAb Der s 1
ELISA-PolyAb Der p 1
ELISA
IgE
DS/DP
W
B
IgE
1
10
100
1000
10000
1
10
100
1000
10000
35
25
16
30
1616
AllergenicPotencyBU/mL
Allergencontent,ng/mL
AllergenVaccines 2009
Varadero, Cuba
36. Indispensables en productos biológicos
Comparación en ensayos de actividad
biológica y FQ
Sistema de Unidades (Internacionales)
Requisitos:
◦ Homogeneidad
◦ Caracterización (+ que para los lotes de producción)
◦ Estabilidad (usualmente liofilizados)
Estudios acelerados
◦ Trazabilidad (MR secundarios)
37. MR biológicos
Definen al analito
Unidades de actividad
(arbitrarias o por definición
según ensayo)
No requieren ser puros
El lote de reemplazo no
es idéntico al anterior
¿trazabilidad?
MR químicos
Caracterización F-Q
completa
Unidades de masa (SI)
Alta pureza
Completa trazabilidad
38. Banco celular
Inóculo
Fermentación/
Cultivo
Cosecha
•Cuerpos de inclusión
(precipitación/resolubilización)
•Sistemas de expresión solubles
Purificación
•Cromatografías líquida (IE, HIC,
gel-filtración)
• Afinidad (MAb)
•Ultrafiltración
Esterilización (filtración)
“Upstream”
“Downstream”
Colección de
material de partida
Extracción
GMP
39. Fermentadores 2000L
Planta de Ingredientes Activos BIOCEN
Centrífugas de flujo continuo
40. Variabilidad intrínseca
Comparación
Biológicos Químicos
PM, Kda 5-200
(± 1)
0.05-2
(± 0.01)
Registros de lote > 250 <10
Ensayos > 2000 < 100
Puntos críticos > 5000 < 100
Datos de proceso > 60 000 <4000
41. Análisis de Riesgo (ICH Q9 Quality Risk Management)
Capacidad de proceso: estimación estadística de la
probabilidad de fallos
Capacidad de proceso:
• Productos químicos > 99 %
• Productos biológicos ~95%
Gráfico de control, Potencia alergénica
VALERGEN, 28 lotes consecutivos
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
5
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
0 5 10 15 20 25
Mean
log(p) Mean Control limits
Specification Low er limit Upper limit
Variabilidad total
Variabilidad
proceso
43%Error
analítico
57%
σ = 0,099
42. Contaminación biológica
◦ Microbiológica
◦ Endotoxinas
◦ Proveniente del hospedero (ADN, proteínas)
◦ Virus
Banco celular
Sustratos (medios de cultivo de origen animal o humano)
Columnas de inmunoafinidad
Excipientes (Albúmina humana)
Necesidad de procesos de inactivación/remoción de virus
Modificación/degradación del producto
◦ Intrínseca (banco de células)
◦ provocada por el proceso
ICH Q5A Quality of Biotechnological Products: Viral Safety Evaluation of Biotechnology
Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin
ICH Q5D Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of
Biotechnological/Biological Products
44. Actividad biológica (específica)
Modificaciones estructurales Herramientas analíticas físico-químicas
Truncado SE HPLC, SDS-PAGE, AUC, mapeo de péptidos con MS,
RP HPLC
Alteraciones en la glicosilación Electroforesis Capilar, LC-MS, MS, MALDI-TOF
Isomerización RP HPLC
Agregación SE-HPLC, electroforesis, AUC
Oxidación mapeo de péptidos con MS
Deamidación cIEF, mapeo de péptidos con MS, CEX-HPLC
Plegamiento incorrecto RP-HPLC, NMR
Impurezas específicas Herramientas analíticas
Proteínas del hospedero ELISA (Ac policlonales)
Proteínas del proceso de purificación
(anticuerpos, Proteína A)
ELISA, SDS-PAGE
ADN del hospedero Hibridización
Endotoxinas LAL
46. Secado por medio de sublimación
(del estado congelado sólido a
vapor)
Útil para sustancias termolábiles
(proteínas)
Ventajas:
◦ Estabilidad
◦ Flexibilidad en la reconstitución del
producto (volumen) y diferentes
presentaciones.
47.
48. Receta: parámetros de temperatura y
presión, en las diferentes etapas
Formulación apropiada:
agentes de carga, excipientes
Humedad de los tapones
Sistema CIP/Esterilización
Controles de calidad:
◦ Forma de la pastilla
◦ Humedad residual
◦ Actividad biológica
49. Propiedades intrínsecas de los biológicos
◦ Susceptibles a degradación
◦ Termolábiles, generalmente conservados en refrigeración
Diseño de estudios de estabilidad
◦ Tiempo real
◦ Uso de ensayos de actividad biológica (poca precisión)
◦ IFA y productos intermedios
◦ Producto terminado
Liofilizados/reconstituidos
Interacción con contenedor-cierre (posición invertida)
Estrés
ICH Q5C STABILITY TESTING OF BIOTECHNOLOGICAL/BIOLOGICAL PRODUCTS
50. Métodos analíticos principales
(indicativos de estabilidad)
Físico-químicos
(alteraciones del peso molecular,
carga, hidrofobicidad)
◦ Perfiles electroforesis: SDS-PAGE,
IEF
◦ Cromatográficos: HPLC (RP, IEC, gel
filtración)
◦ Modificaciones estructurales:
dicroísmo circular, mapeo
péptídico.
Indicativos de actividad biológica
◦ Bioquímicos
◦ Inmunoquímicos: Immunoblotting,
ELISA
Mecanismos de degradación
de las proteínas en
conservación
Oxidación
Deamidación
Agregación
Fragmentación (hidrólisis,
proteólisis)
54. ICH Q10 Pharmaceutical System
ICH Q8 Pharmaceutical Development
Aplicación de GMP, GLP, GCP
ISO-9001:2000 Sistemas de gestión de la calidad
◦ Sistema integrado desde “Diseño y Desarrollo”
◦ Certificación
55. Revisión del diseño y
desarrollo
Planificación, etapas
Evaluación:
◦ “Verificación:” requisitos de los
elementos de entrada,
comparaciones, controles de
calidad.
◦ “Validación:” capacidad de
satisfacer su uso previsto
Control de cambios
Mejora continua
Elementos de entrada en la
I+D
◦ Especificaciones de diseño:
◦ Funcionalidad
◦ Seguridad (ambiental)
◦ Fiabilidad (estabilidad)
◦ Composición/Calidad
Salidas:
◦ Especificaciones de
productos y procesos
◦ Prototipos/productos
56. ICH Q8
ICH Q10
• Ingrediente activo
• Formulación y envase primario
• Sistema de entrega
• Procesos y escalado
• Métodos analíticos
Desarrollo Farmacéutico
• Del desarrollo a la producción
• Entre instalaciones
Transferencia de la
tecnología
Producción
Descontinuación
Ciclo de vida del producto:
Soporte al
“espacio de diseño”
“Espacio de Diseño”: combinación de variables de entrada capaz
de garantizar la calidad.
Las variaciones dentro del “espacio de diseño” no se
consideran “cambios”.
57. Elementos del sistema
de calidad
Desarrollo Transferencia de
la tecnología
Fabricación
Acciones correctivas y
preventivas (CAPA)
La metodología puede
ser útil
Puede ser usado
(mejora continua)
Requerido
Control de cambios
Flexible
Documentación
Trazabilidad
Mayor formalidad
Información a la
gerencia
Estricto
Evaluación (monitoreo) del
desempeño de procesos y
productos
Necesario Necesario Requerido
Revisión gerencial del
desempeño de procesos y
calidad de productos
aspectos
(ISO: Revisión del
diseño)
aspectos
(ISO: Revisión del
diseño)
Sistema estructurado
(mejora continua)
• ICH Q8 y Q10