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Mais de Tsukuba GeneTechnology Laboratories, Ibaraki, JPN
Mais de Tsukuba GeneTechnology Laboratories, Ibaraki, JPN (10)
生活環境を改善のための空気濾過フィルタ
- 2. 研究の概要 • 空気環境には，様々な有害物質が含まれている場合があるが、こうした有害 物質の除去は、健康の維持に極めた重要である。 • 本研究では、有害物質の除去目的で開発された”環境フィル ター”(http://kenkoutaro.com/)が空気中の有害物質を除くことができるかを調 べた。 • 有害物質除去テストのモデル系として、C57BL/Jマウスを用いた。また、有害 物質としては、タバコの煙を用いた。 • 有害物質除去テストは、タバコ煙の影響を肺の遺伝子発現の変化として捉え る方法で実施した。 • 実験としては、①通常飼育マウス ②タバコ煙環境下での飼育マウス ③タ バコ煙→フイルター濾過空気での飼育マウスの３群で行った。各群5匹で実 施した。 結果 肺での遺伝子発現の変化の解析から、 ”環境フィルター” (http://kenkoutaro.com/)がタバコ煙中の有害物質を除くこ とが示唆された。
- 3. 材料と方法 ・使用マウス C57BL/6J Kwlマウス オス 8週齢を用いた。 ①通常飼育群 10匹 タバコの煙なし、環境フィルターなし ②タバコ煙環境下群 10匹 タバコの煙あり、環境フィルターなし ③タバコ煙環境下+フィルター群 10匹 タバコの煙あり、環境フィルターあり ※各群の影響を避けるため、それぞれの飼育システム は15m離して試験を実施した ・タバコ煙暴露方法 暴露方法については、以下の論文に従った Chad A. Lerner, Wei Lei, Isaac K. Sundar and Irfan Rahman(2016) Genetic Ablation of CXCR2 Protects against Cigarette Smoke-Induced Lung Inflammation and Injury Front Pharmacol. 2016; 7: 391 ・煙発生スペースにてタバコに点火し煙を発生 ・1時間煙発生スペースを飼育スペースの空気を循環 ・新鮮な空気を1時間循環させる ・再度煙発生スペースにてタバコに点火し煙を発生 ・1時間煙発生スペースを飼育スペースの空気を循環 ・上記手順を3日連続で実施 ・最終暴露日翌日に安楽死後臓器を回収
- 6. • 肺組織の摘出 １．頚椎脱臼による安楽死後、直ちに開胸し、肺を回収を実施する。 ２．回収した肺は氷上にて細断し、クライオチューブに入れ直ちに液体窒素タンクにて凍結する。 ３．凍結した肺はドライアイスで満たした発泡スチロールに入れ、クール便でつくば遺伝研究所へ輸送する。 • 肺組織からのRNAの抽出 抽出は、フェノール・グアニジンをベースにしたQIAzol Lysis Reagent（QIAGEN）を使用した一段階法で行った。各組織をQIAzol Lysis Reagentで溶解した後、クロロホルムを加えて遠心分離を行う。粉砕溶解後は水層・中間層・フェノール・クロロホルム層に分離し、 RNAは水層に、DNAとタンパク質は中間層以下に存在する。水層を回収し、イソプロパノールを加えるとRNAが沈殿することにより単 離する。 プロトコール） サンプル ①通常飼育群の肺 ３組織 ②タバコ煙環境下群 ３組織 ③タバコ煙環境下+フィルター群 ３組織 １．組織100～150mgにQIAzol Lysis Reagentを1ml加え、ポリトロンで20～40秒処理し破砕させる。 ２．RNAの抽出、沈殿、洗浄のため、室温で５分放置する。 ３．クロロホルムを0.2ml加え15秒撹拌する。 ４．2～3分室温で放置後、遠心(13,000 x g, 15分, 4℃)する。 ５．上層（RNA）を別のチューブへ移し、0.5mlのイソプロパノールを加える。 ６．撹拌後、10分室温で放置する。 ７．遠心(13,000 x g, 15分, 4℃)後、上清を捨てる。 ８．沈殿に1mlの70%エタノールを加えよく撹拌する。 ９．遠心(13,000 x g, 5分, 4℃)後上清を除き、アルコール分除去のため5～10min風乾する。 １０．純水を50mlの純水に溶かし-80℃で保存する。 • RNAシークエンシング(配列解析) マクロジェンジャパンに受託し、下記の手法でシークエンスを行った。 TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kitを用い、取得した総RNAから特異的にmRNA濃縮し、これらmRNAを鋳型として cDNAを合成後、シークエンス用ライブラリーを作製した。 次に、cDNAライブラリーを次世代シークエンサー（NovaSeq6000）にて100bp, Paired-end, １サンプル4000万リードでシー クエンスした。
- 7. • RNAシークエンスデータの解析 各サンプルのRNA 4,000万本をシークエンスし、fastq形式で保存した。このデータを用いて、先ず、STARを用い て、得られたシ－クエンスをマウスのリファレンスゲノム(ver. )にマップした。次に、Cufflinksを用いて、アライメントを 行った。そして、得られたデータについて、実験群間で差異があるかどうかをCuffdiff プログラムで解析した。最後に、 統計解析プログラムRを用いて種々の解析を行った。
- 8. we TopHat2 Cufflinks Cuffdiff R FeatureCounts DESeq２ BaySeq R R STAR Cufflinks Cuffdiff R FeatureCounts DESeq２ BaySeq R R RNAseqを用いた遺伝子発現解析 リアルタイム RT-PCR In silico analysis Wet analysis
- 9. 解析結果 • RNAシークエンスデータ解析の結果 ① 通常飼育マウス肺とタバコ煙環境下飼育マウス肺での694,497個のエキソン(遺伝子の構成単位) 個々の発現量についての比較を行った。解析で得られた、種々の図表については、資料１に示した。 これらのデータを基に、危険率0.0１% (信頼確率99.99%)の条件で差異が見つかったエキソン4513個を抽 出した。次に、wetの実験での検証を想定して、発現の差異が8倍以上あるものを抽出した。その結果、 638個のエキソンが抽出出来た。さらに、wetの実験で、安定した結果を得るためには、発現量が多い 方が望ましいので、FPKM値100以上を選択した。その結果、95個のエキソンが抽出された。 ② タバコ煙環境下飼育マウス肺とタバコ煙フィルター濾過環境下飼育マウス肺での694,497個のエキ ソン(遺伝子の構成単位)個々の発現量についての比較を行った。解析で得られた、種々の図表につい ては、資料２に示した。これらのデータを基に、危険率0.0１% (信頼確率99.99%)の条件で差異が見つ かったエキソン6011個を抽出した。次に、wetの実験での検証を想定して、発現の差異が8倍以上あるも のを抽出した。その結果、1175個のエキソンが抽出出来た。さらに、wetの実験で、安定した結果を得 るためには、発現量が多い方が望ましいので、FPKM値100以上を選択した。その結果、88個のエキソン が抽出された。 ③ ①で抽出された95個のデータと②で抽出された88個のデータを一つのデータシートに載せ、詳細 な解析を行った。下記の図表(表１，図１)に示したが、タバコ煙環境下飼育マウス肺では、通常飼育 マウス肺に比べて、遺伝子の発現の昂進が見られる。多いものでは、発現量が１５０倍に達している ものもある。こうした昂進は、タバコ煙中の含まれる有害物質の作用と判断される。表１ 図１に示 した遺伝子発現の昂進は、タバコ煙フィルター濾過環境下飼育マウス肺では見られない、つまり、通 常飼育マウス肺とほぼ同レベルであることから、フィルタ－が、図表の遺伝子発現に作用する有害物 質を除去していると判断される。 しかしながら、一部の遺伝子、例えば、myosin, heavy polypeptide 8では、発現の昂進抑えることができない ことから、フィルター濾過では、除き切れない物質が存在することが示唆される。
- 10. 遺伝子 エキソン 通常 タバコ煙 タバコ煙＋フィルター CKm exon1 63.4442 552.676 16.4711 CKm exon2 63.4442 552.676 16.4711 CKm exon3 63.4442 552.676 16.4711 CKm exon4 63.4442 552.676 16.4711 CKm exon5 63.4442 552.676 16.4711 CKm exon6 63.4442 552.676 16.4711 CKm exon7 63.4442 552.676 16.4711 myosin light chain exon1 20.0205 240.151 0.589323 myosin light chain exon2 20.0205 240.151 0.589323 myosin light chain exon3 20.0205 240.151 0.589323 myosin light chain exon4 20.0205 240.151 0.589323 myosin light chain exon5 20.0205 240.151 0.589323 myosin light chain exon6 20.0205 240.151 0.589323 myosin light chain exon7 35.3443 379.774 2.41204 myosin light chain exon8 35.3443 379.774 2.41204 myosin light chain exon9 35.3443 379.774 2.41204 myosin light chain exon10 35.3443 379.774 2.41204 myosin light chain exon11 35.3443 379.774 2.41204 myosin light chain exon12 35.3443 379.774 2.41204 troponin I, skeletal exon1 9.09298 105.596 2.16109 troponin I, skeletal exon2 9.09298 105.596 2.16109 troponin I, skeletal exon3 9.09298 105.596 2.16109 troponin I, skeletal exon4 9.09298 105.596 2.16109 troponin I, skeletal exon5 9.09298 105.596 2.16109 keratin 13 exon1 4.49911 201.251 0.347205 keratin 13 exon2 4.49911 201.251 0.347205 keratin 13 exon3 4.49911 201.251 0.347205 keratin 13 exon4 4.49911 201.251 0.347205 keratin 13 exon5 4.49911 201.251 0.347205 keratin 13 exon6 4.49911 201.251 0.347205 keratin 13 exon7 4.49911 201.251 0.347205 keratin 13 exon8 4.49911 201.251 0.347205 keratin 4 exon1 2.00598 133.584 0.493156 keratin 4 exon2 2.00598 133.584 0.493156 keratin 4 exon3 2.00598 133.584 0.493156 keratin 4 exon4 2.00598 133.584 0.493156 keratin 4 exon5 2.00598 133.584 0.493156 keratin 4 exon6 2.00598 133.584 0.493156 keratin 4 exon7 2.00598 133.584 0.493156 keratin 4 exon8 2.00598 133.584 0.493156 keratin 4 exon9 2.00598 133.584 0.493156 発現量
- 12. 資料１-1 通常飼育VSタバコ煙下飼育 Ma plot 遺伝子 p値 <0.01 Ma plot エキソン p値<0.01 Scatter plot 遺伝子 p値 <0.01 Scatter plot エキソン p値<0.01 Volcano plot 遺伝子 p値 <0.01 Volcano plot エキソン p値 <0.01 通常飼育 タバコ煙下飼育 通常飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育発現増加 タバコ煙下飼育発現増加 タバコ煙下飼育 発現増加 タバコ煙下飼育 発現増加
- 13. 無根Cluster解析遺伝子 p値<0.01 無根Cluster解析エキソン p値<0.01 有根Cluster解析遺伝子 p値<0.01 有根Cluster解析エキソン p値<0.01 主成分分析 遺伝子 p値<0.01 主成分分析 エキソン p値<0.01 資料１-2 通常飼育VSタバコ煙下飼育 通常飼育 通常飼育 通常飼育 通常飼育 通常飼育 通常飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育タバコ煙下飼育
- 14. 資料２-1 タバコ煙下飼育vsタバコ煙>フィルター濾過下飼育 Ma plot 遺伝子 p値 <0.01 Ma plot エキソン p値<0.01 Scatter plot 遺伝子 p値 <0.01 Scatter plot エキソン p値<0.01 Volcano plot 遺伝子 p値 <0.01 Volcano plot エキソン p値 <0.01 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 発現減少 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 発現減少 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 発現減少 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 発現減少
- 15. 無根Cluster解析遺伝子 p値<0.01 無根Cluster解析エキソン p値<0.01 有根Cluster解析遺伝子 p値<0.01 有根Cluster解析エキソン p値<0.01 主成分分析 遺伝子 p値<0.01 主成分分析 エキソン p値<0.01 資料２-2 タバコ煙下飼育vsタバコ煙>フィルター濾過下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙下飼育 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 タバコ煙>フィルター濾過下飼育 タバコ煙>フィルター濾過下飼育