PCR

PCR
Polimeraz Zincir Reaksiyonu The Polymerase Chain Reaction PH.DR.BIOCHEM. E.Çiğdem Sidar LeadAuditor(QMS) GB-Lab. Company Trainer 2014
3 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. Facebook www.facebook.com/kariyerbenim Twitter #BugünKariyerBenim E-Mail info@kariyerbenim.com Eğitim sonrası görüş ve önerilerinizi sosyal medya iletişim yollarıyla bizlere gönderebilirsiniz.
4 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 4 Eğitimden Önce ;
5 TANIŞMA ADINIZ SOYADINIZ KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. PCR BİLGİNİZ ? EĞİTİMDEN BEKLENTİNİZ ?
6 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. BÖLÜM-1 TANIMLAR
7 TANIMLAR KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. Hücre : Canlının canlılık özelliklerini taşıyan yapı ve görev bakımından en küçük parçasıdır.
8 TANIMLAR KALITIM : Bir bireyin kendi ata dölüne benzeme eğilimine soyaçekim (kalıtım) denir. GENETİK : Anne, baba ve yavru arasındaki benzerlik ve farklılıkları neden ile bu özelliklerin nesilden nesile geçişini inceleyen bilim dalıdır. GEN : Ebeveynden çocuklarına geçen belirli bir karakteristiği taşıyan biyolojik birimdir. Genler birtakım emirlerle hareket ederek büyümemizi ve vücudumuzun çalışma biçimini belirler. Göz rengi, kan grubu veya boy gibi çoğu özelliğimizden genler sorumludur. Genler kromozomların üzerinde yer alırlar. Bir kromozomun belirli bir kısmını oluşturan nükleotid dizisidir. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
9 TANIMLAR ENZİM (ENZYME) : Biyokimyasal bir reaksiyonu katalizleyen protein. Enzimler, özgüllükten sorumlu bir protein kısmından (apoenzim) ve aktivite için gerekli, protein olmayan bir kısımdan (koenzim) oluşur. Bir enzim ile katalizlenen kimyasal reaksiyonların çoğu altı ana gruptan birine dahildir : 1. Hidrolazlar ile Hidroliz (H2O ekleyerek kesme işlemi), 2. Transferazlar ile, bir molekül grubunun verici molekülden alıcıya transferi, 3. Oksidaz ve Redüktazlar ile, oksidasyon ve redüksiyon (oksitlenecek bir molekülden bir ya da daha çok elektronun veya hidrojen atomunun redüklenecek olan diğer bir moleküle aktarılması), 4. İzomerazlar ile, izomerine dönüştürme (bir atomun ya da işlevsel grubun bir molekül içerisindeki konumunun değiştirilmesi, 5. Ligazlar (sentetazlar) ile, iki sübstrat molekülün başka bir molekül oluşturmak üzere birleştirilmesi, 6. Liyazlar ile, bir molekülün oluşacak moleküllerden birinde ya da her ikisinde çift bağ oluşturularak, nonhidrolitik bir tepkime ile açılması. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
10 TANIMLAR GEN AMPLİFİKASYONU: Diğer genlerde orantılı bir artış olmaksızın, seçici olarak belli bir genin çok sayıda kopyasının yapılması. GENETİK MARKER: Allellerin atasal kökenini belirlemek için kullanılabilen, polimorfik genetik özellik. GENOTİP: Bir bireyin ya da bir hücrenin genetik içeriğinin tamamı ya da bir kısmı. FENOTİP: Bir hücre ya da bireydeki bir ya da daha fazla genin gözlenebilir etkisi. ALLEL (ALLELMORF): Bir genin, belirli bir gen bölgesinde bulunan alternatif formlarının herbiri. ANNEALİNG: Komplementer nükleik asit ipliklerinin eşleşerek ( DNA ile DNA, RNA ile RNA veya DNA ile RNA ) çift iplikli molekül oluşturmaları. AMPLİFİKASYON: Bir DNA dizisinin ayrı kopyalarının yapılmasıdır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
11 TANIMLAR GENOMİK (IMPRINTING) : Atasal kökene bağlı olarak, bir kromozom bölgesinin ya da bir allelin farklı ekspresyonu. HİBRİDİZASYON : Bitki ve hayvanlarda, aynı türden farklı genotipe sahip bireylerin çaprazlanmasıdır.Terim genellikle daha dar anlamda kullanılır : Komplementer iki DNA tek ipliğinin birleştirilmesi ( DNA / DNA hibridizasyonu), komplementer DNA ve RNA ipliklerinin birleştirilmesi ( DNA / RNA hibridizasyonu ), farklı türden kültür hücrelerinin invitro ortamda birleştirilmesi (hücre hibridizasyonu) gibi. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
12 TANIMLAR İNDÜKLEYİCİ : Bir genin ekspresyonunu uyaran molekül. KONTİG : Çakışan DNA fragmanları serisi (contiguous sequences = bitişik diziler) KROMATİN : İnterfaz nükleusunda görülen boyanmış madde. DNA, bazik kromozomal proteinler (histonlar), histon –olmayan kromozomal proteinler ve az miktarda RNA dan ibarettir. CROSS-OVER : 1. Mayozun diploten evresinde kiyazma oluşumu ile,homolog kromozomlar arasında genetik bilgi değiştokuşu; komşu gen lokuslarının (bağlı) genetik rekombinasyonu ile sonuçlanır. Somatik hücrelerde mitoz sırasında da oluşabilir. Eşit olmayan cross-over, rekombinasyon bölgesinde homolog DNA bölgelerinin yanlış eşleşmesinden kaynaklanır. Bu durum, yapısal olarak değişmiş, birinde duplikasyon diğerinde delesyon oluşmuş DNA segmentleri ya da kromozomlarla sonuçlanır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
13 TANIMLAR BAZ ÇİFTİ (bp): DNA’ da, biri pürin ve diğeri pirimidin olmak üzere karşılıklı gelerek hidrojen bağları ile bağlanmış iki baz. Bir DNA çift sarmalında normal baz çiftleri, A ile T ve C ile G dir. RNA ‘da başka çiftler de oluşabilir. cDNA: RNA kalıp üzerinden revers transkriptaz enzimi aracılığıyla sentezlenen komplementer DNA. EKSPRESYON: Aktif bir genin görülen etkisi. EKSPRESİTİVE: Bir genin ya da genotipin fenotipe yansıma derecesini tanımlar. Ekspresivitenin olmayışı nonpenetrans olarak adlandırılır. ELEKTROFOREZ : Moleküllerin, elektriksel alanda göç hızlarının farklılığından yararlanılarak ayrılmaları. Destekleyici ortam olarak, nişasta, agaroz,akrilamid gibi jel yapılı maddeler kullanılır. Daha detaylı moleküler değişiklikler, iki yönlü elektroforez veya izoelektrik noktada hareketin durdurulması (izoelektrik odaklama) gibi modifikasyonlarla saptanabilir. (Agaroz Jel, Poliakrilamid Jel, Değişken alanlı jel (PFGE), kapiller elektroforez türleri bulunmaktadır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
14 TANIMLAR LİGAND: Bir reseptöre bağlanarak hücre içinde sinyal başlatan bir molekül, Örnek : hormon. MAYOZ: Germ hücresi çekirdeğinde gözlenen özel bir bölünme biçimidir, kromozom sayısını diploidden haploide indirger. İlk mayotik bölünmenin profazı özellikle önemlidir ve şu evrelerden oluşur. Leptoten, Zigoten, Pakiten, Diploten, Diyakinez. MEGABAZ (MB): Bir milyon baz çifti. MENDELYAN KALITIM : Mendel yasalarına uygun olan kalıtımdır. Karşıt olarak, sitoplazmik kalıtım faktörlerinin (mitokondriyal DNA) denetlediği ekstrakromozomal kalıtımdan söz edilebilir. MİTOZ : Somatik hücre bölünmesi sırasında, profaz, metafaz, anafaz ve telofaz evrelerini kapsayan çekirdek bölünmesi. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
15 TANIMLAR KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
16 Mayozda da mitozda olduğu gibi profaz, metafaz, anafaz ve telofaz olarak adlandırılan dört evre vardır. Bu evreler arada interfaz olmaksızın peş peşe iki kez gerçekleşir ve sonuçta genetik özellikler bakımından 2 çeşit dört yavru hücre meydana gelir. Mayoz bölünme ile mitoz bölünme arasındaki en büyük farka profazda rastlanır. Mayoz bölünme iki aşamada gerçekleşir. Bu aşamalar, Mayoz-1 ve Mayoz-2 olarak adlandırılır. Profaz I DNA ipliklerinin kısalıp kalınlaşmaya başlaması ile başlar. Bu evre sınırları kesin olmayan 5 evreye ayrılıp incelenir. Bu evreler; Leptoten: Kromozomların mikroskopla seçilebildikleri andan itibaren başlar. İki eş kromatit birbirine sarılı halde bulunur. Ayrıca kromatinler üzerinde kromomer denilen ve koyu boyanan bölgeler fark edilir. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
17 Zigoten: Biri anneden diğeri babadan gelen ve birbirlerine benzeyen homolog kromozomlar yan yana gelerek eşleşmeye başlarlar. Bu eşleşme bir uçtan diğer uca doğru devam eder. Bu evrede her biri iki kromatit taşıyan iki kromozomun yan yana durmasıyla sanki canlı n sayıda kromozom taşıyormuş gibi görülür. Görülen bu yapıya tetrat denir. Pakiten: Homolog kromozomların eşleşmesi tamamlanır ancak kromozomlar kısalmaya devam eder. Ayrıca bu evrede mitozdan farklı olarak tetratlar arasında genetik madde alışverişi olur. Buna crossing-over denir. Bu olay homolog kromozomların birbiri üzerine çakışan (kiyazma "chiasma") kısmında gerçekleşir. Diploten: Kromozomların sentromerleri ayrılmamıştır. Dört kromatit için iki sentromer vardır. Tetrat'taki homolog kromozomlar birbirinden ayrılmaya başlar. Ancak kiyazma bölgelerinde ayrılma olmaz ve kiyazmalar uca doğru kaymaya başlar. Diakinez: Kromozomlar son halini alır. Çekirdekçik kaybolur. Çekirdek zarı parçalanır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
18 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
19 NORTHERN BLOT : RNA moleküllerinin bir membrana transferi. ÖKARYOT: Prokaryotların aksine,kromozom içeren bir çekirdeğe sahip olan ve mitoz ve mayozla bölünen hücrelere sahip hayvan ve bitkilerdir. POLİMERAZLAR: DNA ve RNA oluşturmak üzere (replikasyon veya transkripsiyon) nükleotid birleşimini katalizleyen enzimler. REKOMBİNANT DNA: Farklı kökenli bölümlere sahip bir DNA molekülü. REKOMBİNASYON: Mayoz sırasında homolog kromozomlar arasında kros-over sonucu yeni gen bileşimlerinin oluşması. RENATÜRASYON DNA: Komplementer DNA tek ipliklerinin çift sarmal DNA oluşturmak üzere birleştirilmesi . KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
20 RESEPTÖR : Bir hücre sinyalinin iletilmesi ile görevli transmembran veya sitoplazmik protein molekülü. TRANSDÜKSİYON : Bir hücreden (bakteri) diğerine özelleşmiş viruslarla(bakteriyofaj) gen taşınması. TRANSFEKSİYON : Saf DNA ‘nın canlı bir hücreye sokulması. TRANSFORMASYON : Bu terim biyolojide birkaç farklı anlam taşır. Genetikte üç tip transformasyon tanımlanmıştır. 1) Malign transformasyon; proliferasyon kontrolünün kaybolması ile normal hücrenin malign durma geçmesi, 2) Genetik transformasyon; genetik bilgi aktarımı yoluyla bir hücrenin genetik niteliğinin değişmesi, 3) Blastik transformasyon; lenfositlerin mitojenik maddelere (örn : fitohemagglutinin veya özgül antijen) tepkisi ile hücre bölünmesinin başlaması. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
21 TRANSKRİPSİYON : DNA ‘ da taşınan bilginin yayınlanmasında ilk adım olarak mesajcı RNA (mRNA) nın sentezi. TRANSKRİPT : Aktif bir genin DNA’sının bir bölümünün RNA kopyası. TRANSLASYON : Genetik bilginin yayımlanmasında ikinci aşama. Bu aşamada, mRNA’daki triplet dizini, gen ürünü olan polipeptidi oluşturacak aminoasit dizinine çevrilir. TRANSLOKASYON : Bir kromozomun tamamını veya parçalarının diğer bir kromozoma aktarılmasıdır. Homolog olmayan parçaların değişmesiyle sonuçlanan resiprokal translokasyon yaygındır. İki akrosentrik kromozom arasında, kısa kolların kaybı ve sentromerlerden birleşme ile oluşan translokasyon, füzyon tipi translokasyondur. (Robertsonyan translokasyon). KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
22 WESTERN BLOT (IMMÜN BLOT) : Protein antijenlerin tanımlanmasında kullanılan bir teknik. REPLİKASYON : DNA’nın kendisini eşlemesi. MUTASYON : Genetik materyaldeki kalıcı değişiklik. Bir gen içerisinde baz çiftlerinin katılması (insersiyon), kaybı ya da değişmesi şeklinde nokta mutasyonu olarak veya kromozom yapısındaki değişmeler şeklinde kromozomal mutasyon olarak farklı tipte görülebilir. Yanlış anlamlı (missen) mutasyon, gen ürününde yanlış amino asidin bağlanmasına neden olan bir değişikliktir. Anlamsız (nonsens) mutasyon, bir genetik mesajın ortasında dur kodonu oluşturarak tümüyle işlevsiz bir gen ürünü çıkmasına neden olan bir değişikliktir. GEN LOKUSU : Bir genin bir kromozom üzerindeki konumu. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
23 FOSFODİESTER BAĞI : DNA ya da RNA ‘da bitişik nükleotidleri bağlayan kimyasal bağ. DUPLİKASYON : Hatalı kros-over sonucunda bir kromozom segmentinin fazladan eklenmesi. fazladan eklenmiş DNA nükleotid baz çiftleri anlamına da gelir. Genlerin duplikasyonu ökaryotların evriminde önemli rol oynar. DUR KODONU (SONLANMA-TERMİNASYON-KODONU): Translasyonun sonunu belirleyen üç tripletten (UAG,UAA,UGA) biri. STS (SEKANS ETİKETLİ BÖLGE) : Bilinen dizideki, kısa DNA bölgesi. TELOMER: Bir kromozomun her iki ucunda, özel konsensüs diziler içeren uç bölgeler. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
24 DENATÜRASYON : Protein veya nükleik asitlerin doğal yapısında mevcut olan sekonder, tersiyer ve kuaterner yapılarının bazı fiziksel (yüksek sıcaklık, radyasyon) ve kimyasal (kuvvetli asit veya baz, organik çözücüler (alkol, kloroform vb.), yoğun inorganik tuz çözeltisi) dış etkilerle bozularak primer yapılarına dönüşmeleri sürecidir. Canlı bir hücredeki proteinlerin denatüre olması, hücresel aktivitelerde bozulma ve belki de hücrenin ölümüyle sonuçlanır. Yumurtanın sahanda pişirilmesi sonucunda yumurtanın ısı etkisiyle katılaşması ve beyaza dönmesi denatürasyona bir örnektir. Kaynamış sütün üzerinde oluşan kaymak da bir denatürasyon olayıdır. Yumurta akının denatürasyonunun geri dönüşümsüz olmasına rağmen diğer birçok denatürasyon olayı geri dönüşümlüdür. NÜKLEİK ASİT DENATÜRASYONU : DNA gibi nükleik asitlerin denatürasyonu, yüksek sıcaklıkta iki zincir arasındaki hidrojen bağlarının koparak çift zincirli yapının iki tane tek zincire dönüşmesiyle oluşur. Bu durum, polimeraz zincir tepkimesi (PCR) esnasında ortaya çıkabilir. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
25 Tavlama esnasında sıcaklığın yavaş yavaş düşürülmesi birbirini tamamlayıcı zincirler arasında baz çiftinin doğru bir şekilde oluşmasını sağlar. Sıcaklığın ani bir şekilde düşürülmesiyse primerin hatalı DNA dizileriyle hibritleşmesine yol açar. GENOM : Bir kalıtım birimidir. Bir organizmanın kalıtım materyalinde bulunan genetik şifrelerin tamamını simgeler. Canlıların en temel birimi olan hücrede fizikokimyasal özelliklerin ortaya çıkarılmasında kullanılan genetik talimatların hepsine de genom denilebilir. Her canlının hücrelerinin içine yerleştirilmiş genetik program, o canlının "genom"unu oluşturur. HİDROJEN BAĞI : Bir molekülde oksijen, azot veya flor gibi elektronegatif bir atoma bağlı hidrojenin kısmi artı yükle yüklenmesi sonucu, başka veya aynı moleküldeki elektonegatif atom ile yaptığı kuvvetli bağdır. Van der waals kuvvetinden güçlü olmasına karşın, tipik hidrojen bağı iyonik bağ ve kovalent bağdan daha güçsüzdür. Proteinler ve nükleik asitler gibi makromoleküller içinde, aynı molekülün iki parçası arasında var olabilir. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
26 NÜKLEOTİT : Bir fosfat,beş karbonlu bir şeker (deoksiriboz) ve bir azotlu organik bazdan oluşan bir kimyasal bileşiktir.En yaygın nükleotitler nükleik asitlerin yapı taşlarıdır.Ayrıca koenzim A, flavin adenin dinükleotit, flavin mononükleotit,adenozin trifosfat ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat gibi koenzimler de nükleotittir. Koenzimlerin hücre metabolizması ve sinyal iletiminde önemli rolleri vardır. Nükleotitlerin baz kısmı olan nükleobazlar pürinler ve pirimidinler olarak ikiye ayrılır.Adenin ve guanin birer pürin,sitozin,timin ve urasil ise birer pirimidindir. Nükleotitlerin pentoz kısmı riboz veya deoksiriboz dur.Şeker kısmı deoksiriboz ise nükleotidin adının başına deoksi eklenir. Nükleotidin fosfatsız kısmına nükleozit denir. Nükleozit kısmına bir, iki veya üç fosfat grubu eklenebilir ve bunlara sırasıyla nükleotit monofosfat, difosfat ve trifosfat denir. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
28 Ürünlerine büyük gereksinim duyulan, (özellikle işlevsel enzim üretenler) bazı genlerin seçilerek çoğaltılmasına ilişkin düzenek, ilk defa Pavan tarafından tahmin edilmiş, fakat başlangıçta kimsenin dikkatini çekmemiştir. Klasik gen tanımında, her genin belirli bir işlevi yönettiği bilinmektedir. Bu varsayım, mRNA üreten yapısal genlerin birçoğu için geçerlidir. Fakat doğrudan doğruya yapısal özellik saptamayan bazı genler için de gen çoğaltılması görülür. Bu genler, özellikle kromozomların heterokromatin ve çekirdekçik organizatör bölgelerinde toplanmıştır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
29 Kromozom şeması: (1) Kromatid. Kromozomun S fazından sonraki iki eşit parçasından her biri. (2) Sentromer. Kromatidlerin temas ettiği ve mikrotübüllerin bağlandığı yer. (3) Kısa parça (4) Uzun parça. NOT: Genetikte kromozomlar, genellikle kısa bacaklar üstte olacak şekilde gösterilir. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
30 Ürünlerine büyük gereksinim duyulan, (özellikle işlevsel enzim üretenler) bazı genlerin seçilerek çoğaltılmasına ilişkin düzenek, ilk defa Pavan tarafından tahmin edilmiş, fakat başlangıçta kimsenin dikkatini çekmemiştir. Klasik gen tanımında, her genin belirli bir işlevi yönettiği bilinmektedir. Bu varsayım, mRNA üreten yapısal genlerin birçoğu için geçerlidir. Fakat doğrudan doğruya yapısal özellik saptamayan bazı genler için de gen çoğaltılması görülür. Bu genler, özellikle kromozomların heterokromatin ve çekirdekçik organizatör bölgelerinde toplanmıştır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
31 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. BÖLÜM-2 DNA
32 DNA 1-) DNA NEDİR VE NEREDE BULUNUR ? DNA "Deoksi Ribo Nükleik Asit" isimli bir tür molekül grubunun kısaltılmış ismidir DNA'nın çift zincirli ip merdivene benzer Çift zincirli yapıdaki DNA zinciri oldukça uzun bir zincirdir Bu zincir hücre içindeki özel enzimler ve Proteinler aracılığı ile paketlenir. Nasıl ki uzun bir ipi makaraya düzenli bir şekilde sarıyorsanız, hücrede buna benzer bir mekanizma ile DNA yı paketleyerek çekirdeğinin (Nukleus) içine yerleştirir DNA her hücrede bulunur. Örneğin böbreklerinizin hücrelerinde karaciğerinizin hücrelerinde, kemik hücrelerinizde kısacası vücudunuzdaki her hücrede DNA molekülü mevcuttur. 2-) DNA’NIN KEŞFİ: MIESCHER 1869 yıllarında ilk olarak Miescher tarafından hücre çekirdeğinde özel bir Madde bulundu ve buna Miescher Nüklein adını verdi Daha sonra ise nükleit asitlerin iki tipte olduğu anlaşıldı . Birincisi timüsten elde edilen timonükleik asit ikincisi bira mayalarından elde edilen zimonükleik asit Timonükleik asit hayvanlar alemine zimonükleik asit ise bitkiler alemine özgü sayıldı. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
33 FEULGEN – ROSSENBECK 1924 yıllarında ise Feulgen ve Rossenbeck timonükleik asidin çok duyarlı bir tepkimesini tanımladılar böylece her iki nükleik asidin her iki canlılar aleminde bulunduğu ispat edilebildi. ondan sonra timonükleik asit çekirdeğe , zimonükleik asit ise sitoplazmaya ait özgü yapı maddeleri sayıldı. LEVENE – MORİ 1929 yılında Levene ve Mori tarafından timonükleik asidin DNA zimonükleik asidin ise RNA Olduğu anlaşıldı. WATSON – CRICK 1953 yılında Watson ve Crick DNA molekülünün kendine has özelliklere sahip bir çift sarmal yapı halinde bulunduğunu ileri sürdüler. Bu araştırıcıların önerdikleri DNA yapısı o tarihlerde başka araştırıcılar tarafından ortaya konulan DNA ya ilişkin önemli bulgulara dayanmaktadır. Bunlardan biri, Wilkins ve Franklin tarafından, izole edilmiş DNA fibrillerinin X-ray ışınlarını kırma özelliklerinin açıklanmasıdır. Elde edilen X ışını fotoğrafları, DNA nın zincirlerindeki bazların diziliş sırasına bağlı olmaksızın, çok düzenli biçimde dönümler yapan bir molekül olduğunu göstermektedir. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
34 Ayrıca TMV (Tütün Mozaik Virüsü) üzerinde yapılan çalışmalar da DNA ile ilgili çalışmalarda ışık tutmuştur. İşte Watson ve Crick bu bulguları değerlendirerek böyle özelliklere sahip DNA makro molekülünün sekonder yapısına ait bir model geliştirdiler. Bu modele göre, bir çok sorunun açıklanması yapılabildiğinden dolayı 1962 yılında bu iki bilim adamına NOBEL ÖDÜLÜ verildi. Bir başka önemli bulguda Chargaff tarafından saptanmıştır Herhangi bir türe ait DNA nın nükleotidlerine parçalandığında serbest kalan nukleotidlerde adenin miktarının timine, guanin miktarının da sitozine daima eşit olduğunun saptanmasıdır Yani Chargaff kuralı‘na göre doğal DNA moleküllerinde adeninin timine veya guaninin sitozine oranı daima 1’e eşittir (A/T=1 ve G/C=1). 3-) DNA’NIN ŞEKLİ VE YAPISI DNA molekülü, heliks (sarmal) şeklinde kıvrılmış, iki kollu merdiven şeklindedir. Kollarını, yani merdivenin kenarlarını, şeker (deoksiriboz) ve fosfat molekülleri meydana getirir. Deoksiriboz ile fosfat grupları ester bağlarıyla birbirlerine bağlanmıştır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
35 İki kolun arasındaki merdiven basamaklarında gelişigüzel bir sıralanma yoktur her zaman Guanin (G) Sitozin’in (C ya da S) Adenin (A) Timin’in (T) karşısına gelir Hem pürin (yani adenin ve guanin) ile pirimidin (yani sitozin ile timin) arasındaki hidrojen bağları, hemde diğer bağlar, meydana gelen heliksin düzgün olmasını sağlar. Pürin ve pirimidin bazları, yandaki şekerlere (Riboz), glikozidik bağlarla bağlanmıştır. Baz, şeker ve fosfat kombinasyonu, çekirdek asitlerinin temel birimleri olan nükleotidleri meydana getirmiştir. Dört çeşit nükleotid vardır. Bunlar taşıdıkları bazlara göre isimlendirilirler (Adenin, Guanin, Sitozin,Timin) NÜKLEOZİT AZOTLU ORGANİK BAZ + DEOKSİRİBOZ ŞEKERİ + FOSFORİK ASİT NÜKLEOTİT Nükleotidler birbirlerine fosfat bağlarıyla bağlanarak, şeker ve fosfat kısımlarının birbirlerini izlediği serilerden oluşan bir omurgaya sahip uzun ve dallanmış polinükleotid zincirlerini meydana getirmiştir. Kovalent ester bağları veya fosfodiester bağları olarak da bilinen bu bağlar son derece kuvvetlidir. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
36 Fosfodiester bağlarının varlığı DNA molekülünün tek zincirli yapı halinde iken bile dayanıklı ve stabil yapıda olmasını sağlar. genetik mühendisliğinin hedeflerinden biri olan klonlama çalışmaları, doğal yolla gerçekleşmesi mümkün olmayan kovalent bağ kırılmalarını gerçekleştirerek yeni türler oluşturma çabalarını arar. Hidrojen bağları daima bir pürin(A,G) ile bir pirimidin (T,C) bazı arasından meydana gelir. A-T baz çiftinde 2 hidrojen bağı, G-C baz çiftleri arasında ise 3 hidrojen bağı bulunmaktadır. Hidrojen bağlarının özelleşmesi; anahtar kilit modelinini andıran, uygun nukleotid moleküllerinin karşılıklı gelerek birbirlerine yine uygun sayıda hidrojen bağları ile bağlanmasını sağlar. Böylece zincirin bir kolunda bulunan nukleotidlerin dizilişi,karşı kolda bulunan nukleotidlerin dizilişini bir çeşit dikte ve kontrol eder. Tesadüfe bırakmayan bir titizlikle molekül yapısı oluşturulur ve kontrol edilir. DNA molekülünün en önemli özellik iki polinükleotid zincirin birbirinin tamamlayıcısı olmasıdır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
37 Pozitif (+) ve negatif (–) iki polinukleotid zincirlerinin tamamlayıcılık özelliği,genetik materyalin işlevlerini doğru biçimde nasıl yapabildiğinin açıklanması açısından DNA’nın en önemli temel özelliklerinin başında gelir. DNA bir organizmanın oluşuma ilişkin bilgileri taşır DNA molekülleri, hücre çekirdeğinde bulunurlar ve vücudumuzda bulunan tüm proteinleri oluşumu sırasındaki kodlamış bilgileri içerir.DNA’nın protein yapma işlemi ,inanılmayacak derecede kusursuzdur . KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
40 Pozitif (+) ve negatif (–) iki polinukleotid zincirlerinin tamamlayıcılık özelliği,genetik materyalin işlevlerini doğru biçimde nasıl yapabildiğinin açıklanması açısından DNA’nın en önemli temel özelliklerinin başında gelir. DNA bir organizmanın oluşuma ilişkin bilgileri taşır DNA molekülleri, hücre çekirdeğinde bulunurlar ve vücudumuzda bulunan tüm proteinleri oluşumu sırasındaki kodlamış bilgileri içerir.DNA’nın protein yapma işlemi ,inanılmayacak derecede kusursuzdur . KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
41 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. BÖLÜM-3 TARİHÇE
42  1865'te doğa bilimlerine tutkun Avusturyalı keşiş Gregor Mendel manastırının avlusundaki bahçede 7 özellik (tanenin biçimi ve rengi, kabuğunun rengi vs.) gösteren yenilebilir bezelyeler üzerinde çalışmaya karar verdi. Deneylerinden yola çıkarak, yazdığı “Bitki melezleri üzerinde denemeler” adlı makalesinde, bazı kalıtımsal özelliklerin aktarılma yasalarını açıkladı. Bu makaleyi dünyanın dört bir tarafındaki bilim adamlarına yolladı; tepkiler olumlu olmamakla birlikte yumuşaktı. Makalesinde ileri sürdükleri ancak 1900'lerin başında farklı bilim adamlarınca da yeniden keşfedildikten sonra kabul edildi.  1869'da DNA İsviçreli hekim Friedrich Miescher tarafından yalıtılabildi. İrinde fosfat halindeki zengin bir cevheri yalıttı. Bu cevhere “çekirdek özü” anlamında "nüklein" adını verdi. Nükleinin tüm hücrelerde, somon balığı sperminde bile mevcut olduğunu buldu.  1879'da Walther Flemming ilk kez bir mitozu tanımladı. Gerçi mitoz, kendisinden 40 yıl önce Carl Nageli tarafından keşfedilmişti ama, Nageli mitozu anormal bir doğa olayı olarak değerlendirmişti. Walther Flemming hücrenin bölünmesini tanımlarken profaz, metafaz ve anafaz terimlerini ortaya attı. Çalışması 1882’de yayımlandı. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
43  1880'de Oskar Hertwig ve Eduard Strasburger döllenmedeki temel öğenin spermatozoit (İng. spermatozoon) denilen sperm hücreleri ile yumurta hücresinin birleşmesi olduğunu keşfetti.  1891'de Theodor Boveri kromozomların yaşamın vazgeçilmez unsurları olduğunu gösterdi. • 1900'de kalıtım yasaları keşfedildi; Hugo de Vries, Carl Correns ve Erich von Tschermak-Seysenegg birbirlerinden ayrı olarak, “Mendel yasaları”nı keşfettiler.  1902'de Walter Sutton ilk defa, kalıtım hakkındaki kromozom kuramına, yani genleri taşıyan unsurların kromozomlar olduklarına işaret eden bir mayoz bölünmeyi gözlemledi. Kromozomların ayrılma modelinin Mendel’in varsayımını tümüyle desteklediğini belirtti. Aynı yıl bu çalışmasını bir makale yayımladı.Varsayımı Thomas Morgan’ın çalışmalarıyla kanıtlandı. Yine aynı yıl, Archibald Garrod insanlardaki bir hastalığın kalıtım yoluyla geçen bir hastalık olduğunu tanımladı: Alkaptonüri KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
44 •1905'te William Bateson, kalıtımsal çeşitliliklerin artık adlandırılması gerekliliğinden söz ederek, bir mektubunda ve bir makalesinde "genetik" terimini kullandı, genetik biliminin akademik anlamda kurucusu ve isim babası oldu. •1909'da Wilhelm Johannsen "gen" terimini ortaya attı ve bir varlığın “görünüm”ü (fenotip) ile geni (genotip) arasındaki farkı ortaya koydu. •1911'de Thomas Morgan mutasyona uğramış bir beyaz gözlü Drosophila (meyve sineği) sayesinde mutasyonların varlığını ortaya koydu. “Genetik bağlantı”ların ve "genetik rekombinasyon"un keşfi sayesinde genlerin taşıyıcılarının kromozomlar olduğunu ortaya koydu. Alfred Sturtevant, Hermann Muller ve Calvin Bridges ile birlikte çalıştı. 1933’de Nobel tıp ödülü aldı. Deneyleri kalıtım hakkındaki kromozom kuramını iyice sağlamlaştırdı. •1913'te Morgan ve Alfred Sturtevant, genlerin kromozom boyunca birbirini izleyen dizilişini ve düzenini gösteren, Drosophila sineğinin X kromozomuna ait ilk “genetik harita”yı yayımladılar. •1928'de Fred Griffith Streptococcus pneumoniae türündeki bakteriler üzerinde gerçekleştirdiği deneyler sayesinde, bakterilerin “genetik dönüşüm”ünü keşfetti. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
45 Dönüşüm, iki hücre arasında "genetik enformasyon aktarımı"na olanak sağlıyordu. Bununla birlikte buradaki “dönüştürücü ilke”nin doğasını çözebilmiş değildi. •1941'de George Beadle ve Edward Tatum Neurospora crassa’yı inceleyerek her genin bir (özellikle bir) enzimi kodladığı varsayımını ortaya attılar. •1943'te DNA'nın William Astbury tarafından X ışınlarıyla kırınımı sözkonusu molekülün yapısına ilişkin ilk varsayımın ortaya atılmasına olanak sağladı: Düzenli ve periyodik bir yapı sözkonusuydu. •1944'te Oswald Avery, Colin MacLeod ve Maclyn McCarty DNA'nın kalıtımsal bir enformasyona ilişkin bir molekül olup, bir hücreyi dönüştürebilir özellikte olduğunu ortaya koydular. Barbara McClintock genlerin yer değiştirebildiğini ve genomun sanıldığından çok daha az statik olduğunu gösterdi ,1983'de Nobel tıp ödülü aldı. 1952 de Alfred Hershey ve Martha Chase şunu keşfettiler: Enfeksiyon kapma olayında bir hücreye girmesi gereken, yalnızca, virüsün DNA’sı idi. Çalışmaları DNA’nın genlerden oluştuğu varsayımını büyük ölçüde güçlendirdi. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
46 •1953'de Maurice Wilkins ve Rosalind Franklin'in DNA molekülünün klişesini belirleyen araştırma çalışmalarının ardından, James Dewey Watson ve Francis Crick genetik enformasyonun DNA molekülünce taşınabileceğini açıklayarak, DNA’nın çift sarmal biçimli modelini sundular.Watson, Crick ve Wilkins bu keşiflerinden dolayı 1962’de Nobel Tıp Ödülü aldılar. •1955'de Joe Hin Tjio insan kromozomlarının sayısını tam olarak saptadı: 23 çift idiler.Arthur Kornberg DNA’nın “DNA ikileşmesi”ne olanak veren bir enzim olan DNA polimerazı keşfetti. •1957'de “DNA ikileşmesi”nin mekanizması (işleyişi) iyice aydınlığa kavuştu. •1958'de “Down sendromlu” denilen bir çocuğun kromozomlarının incelenmesi sırasında Jérôme Lejeune 21. kromozom çiftinde fazladan bir kromozom daha bulunduğunu keşfetti. Böylece, dünyada, zihinsel engellilik ile kromozomlara ilişkin bir anormallik arasında bağ bulunabileceği ilk kez ortaya konmuş oluyordu. Lejeune daha sonra, çalışma arkadaşlarıyla, kromozom kaynaklı diğer hastalıkların mekanizmasını da keşfederek, "sitogenetik" dalının ve modern genetiğin yolunu açmış oldu. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
47 •1960'lı yıllarda Fransız biyolog François Jacob ve Fransız biyokimyacı Jacques Monod “protein biyosentezi”nin mekanizmasını aydınlığa kavuşturdular. Genetik kod ilkesi kabul edilmekteydi. Jacob ve Monod “protein biyosentezi”ndeki sentezin düzenlenmesinin proteinlere başvurduğunu gösterdiler ve “gen ifadesi”nde rol oynayan “DNA dizileri”nin varlığını gün ışığına çıkardılar. 1965’de genetik kodun deşifre edilmesinden dolayı Nobel ödülü aldılar. •1968'de "Genetik kod"un çözülmesinden dolayı Nobel Ödülü verildi. •1975'de virüslerin işleyiş mekanizmasının keşfinden dolayı Nobel Ödülü verildi. 1975'den itibaren "genomik" önemli ekonomik ilgilerin odağı haline geldi. •1977'de DNA'daki nükleotit dizilişleri belirlendi. •1983'de Kary Banks Mullis tarafından keşfedilen polimeraz zincir reaksiyonu, DNA izolasyonunu ve DNA parçalarının istenen bölgelerinin çoğaltılmasını sağladı. •1983'de İlk genetik hastalık haritalandı (Huntington hastalığı). •1985'de polimeraz zincir reaksiyonunun geliştirilmesi KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
48 •1989 ‘da, genetik hastalıkların anlaşılması, araştırılması, taranması, önceden tahmin edilmesi ve mümkünse tedavi edilebilmesi amacıyla, genlerin kimliklerinin tek tek saptanması için, insan “genom”unun 3 milyarı bulan “nükleotit” çiftlerinin kodlarının çözülebilmesi konusunda bir proje oluşturulmaya karar verildi. Bu amaçla yola çıkan, 18 ülkedeki bilimcilerden oluşan ve ABD’ndeki National Institutes of Health tarafından düzenlenen ilk çalışma ekibi “İnsan Genom Projesi” adı altında çalışmalara başladı. Uzun soluklu bu büyük çalışma, ister istemez iş bölümünü gerektiriyordu; örneğin Fransa 14. kromozomun DNA dizilimini çözmekten (14. kromozomla ilgili nükleotit kodlarının çözülmesinden, dizilişlerin saptanmasından) sorumluydu. •1990'lı yıllarda Fransa'da genomik kaynaklı tüm enformasyonu denetlemek üzere robotlardan yararlanan yöntemler geliştirildi. •1992-1996 yıllarında Évry'deki (Fransa) bir Généthon laboratuarında insan genomunun ilk "genetik harita"larıWeissenbach tarafından yayımlandı. •1994'de genetik olarak değiştirilmiş ilk besin elde edildi: domates. . KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
49 •1997'de E. coli genomu dizilendi. •1998’de, insan genomu verilerini, Craig Venter ve Perkin Elmer tarafından kurulan, merkezi ABD’nde bulunan Celera Genomics adlı özel şirket de, National Institutes of Health’ınkinden farklı bir teknik kullanarak toplamaya başladı bakterilerin “genetik dönüşüm”ünü keşfetti. •1999'da 22. kromozom dizilenmesi tamamlandı. Büyük Britanya’daki Sanger Institute tarafından düzenlenen bir ekip, ilk kez bir insan kromozomunun tüm DNA dizilimini belirlemiş bulunuyordu: Bu, 22. kromozomdu. •2000 yılının Haziran ayında hem NIH - NHGRI (National Human Genome Research Institute - "Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü"), hem de Celera Genomics insan genomunun DNA dizilimlerinin % 99’unu “saptamış” olduğunu açıkladı. National Institutes of Health araştırma sonuçlarıyla ilgili bir makaleyi "Doğa" adlı bir bilim gazetesinde, Celera Genomics şirketi de araştırma sonuçlarıyla ilgili bir makaleyi “Bilim” adlı bir bilim gazetesinde yayımladı. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
50 •2002 yılının Temmuz ayında Tokyo Üniversitesi’ndeki Japon araştırmacılar Escherichia coli türündeki bir bakteri üzerinde, mevcut 4 nükleotitin (A,T,G,C) yanı sıra, 2 nükleotiti (S ve Y) daha saptadıklarını belirttiler. İlginç nokta, bu iki yeni nükleotitle ilgili genetik kalıtın canlı varlıkların genetik kalıtıyla hiçbir ortak yana sahip olmamasıydı; üstelik bu araştırmacılar, onlardan doğada henüz bulunmayan, meçhul bir protein ürettiler. Kimileri bu yeni “yaratılış”tan söz etmekten çekinmemektedir. •2003 yılının 14 Nisan günü, insan genomunun DNA dizilimlerinin saptanması projesinin tamamlanmış olduğu açıklandı; DNA dizilenmesinin tamamlanmasıyla, gen kodlayan bölgelerin tümü gün ışığına çıkarılmış oldu. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
52 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. BÖLÜM-4 TEKNİKLER
53 DNA GEN KROMOZOM AİLE BİREY GENOM POPÜLASYON KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
54 MOLEKÜLER BİYOLOJİ TEKNİKLERİ 1950’lerin sonu 1960’ların başında moleküler biyologlar organizma ve hücrelerdeki moleküler birleşiklerin yalıtılmasını, betimlenmesini ve işlemlenmesini öğrendiler. Bu birleşikler canlının genetik bilgisinin kaynağı DNA ve çeşitli enzimlerin, proteinlerin yapısal ve fonksiyonel özelliğinde önemli rol oynayan DNA’ya çok benzeyen hatta bazı çeşitleri DNA tek ipliğinden sentezlenen RNA’lardır. Aşağıda ise moleküler biyologların laboratuvar ortamlarında bu moleküller üzerindeki işlemleri yürütmek için sıkça kullandıkları tekniklerden bahsedeceğiz. Expression Cloning (Klon protein sentezi tekniği): Moleküler biyolojide proteinlerin fonksiyonlarının çalışılmasındaki en temel tekniklerden biridir. Bu teknikte ilgilenilen proteini kodlayan DNA’daki gen bölgesi PCR ile çoğaltılarak sentezleme vektörü olarak da bilinen plazmidlere kesici enzimler yardımıyla bütünleştirilir. Plazmidler yapısında promotor denilen tetikleyici bölgelerin etkisi ile istenilen proteinin sentezlenmesini sağlar. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
55 Arzu edilen protein dışındaki proteinlerin sentezlenmemesi için ise yine plazmitlerin yapısında bulunan antibiyotik direnç bölgeleri görev yapar. Özel gen bölgesi eklenmiş plazmitler bakteri veya hayvan hücrelerine enjekte edilir. Plazmidler bakteri DNA’sı ile üç yöntem ile bütünleşir: Bunlar plazmidlerin direk olarak bakteri DNA’sı ile bütünleşmesi olan “Transformasyon”, hücreler arası etkileşimle bütünleşme olan “konjügasyon” ve virüsleri kullanarak plazmidin bakteri DNA’sı ile bütünleşmesini sağlayan “Transdüksiyon”dur. Plazmidleri, hayvanlar gibi ökoryatik canlıların DNA’ları bütünleştirmeye ise “Tranfeksiyon” denilmektedir. “Kalsiyum fosfat transfeksiyonu”, “elektroporasyon”, “mikroenjeksiyon” ve “lipozom tranfeksiyonu” olmak üzere çok farklı transfeksiyon yöntemleri mevcuttur. Plazmitleri ökoryatik canlıların DNA’sı ile bütünleştirmek için bakteri ve virüslerde kullanılabilinmektedir. “Agrobacterium tumefaciens” olarak bilinen bakterilerin kullanıldığı bu işleme “Baktofeksiyon” denilmektedir. Bu plazmidler enjekte edildiği organizmanın genomu ile birleşirlerse oturmuş transfeksiyon, birleşmezlerse geçici transfeksiyon olarak adlandırılırlar. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
56 Bu işlemler sonucunda ilgilenilen protein kodu taşıyan plazmidler enjekte edildiği organizmanın DNA’sı ile bütünleşir ve protein sentezi sürecinde kendi proteinlerini de sentezler. Plazmidlerde bulunan promotor (tetikleyici) bölgeler sayesinde etrafa kimyasallar sinyaller yayılır ve plazmidlerin proteinleri daha yüksek seviyede sentezlenmiş olunur. Yeteri miktar ilgilenilen protein sentezlendikten sonra bunlar bakteri veya hayvan hücrelerinden yalıtılır. Sonrasında elde edilen bu proteinleri fonksiyonel özellikleri, ilaç sanayisindeki etkileri yanı sıra yeni ilaçların proteine verebileceği muhtemel zararları da gözlemlenmiş olunur. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
57 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. BÖLÜM-5 PCR
58 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 58 Polimeraz zincir reaksiyonu DNA’nın kopyalanması ve çoğaltılması için kullanılan son derece etkili ve yaygın bir tekniktir. Özetle PCR ile tek DNA dizisi milyonlarca kez çoğaltılabilindiği gibi DNA üzerindeki bir bölgenin veya mutasyona uğramış bir genin belirlenmesinde de yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.
59 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 59 PCR ayrıca herhangi bir DNA parçasının cDNA kütüphanesinde olup olmadığı belirlemekte de kullanılmaktadır. PCR’ın birçok çeşidi mevcuttur. Örneğin, RNA’nın çoğaltılmasını ters yazılım gerçekleştirerek sağlayan RT-PCR, DNA ve RNA moleküllerinin sayısına aynı anda ulaşmanızı sağlayan real-time PCR (QPCR) bazılarıdır.
60 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 60 PCR ayrıca herhangi bir DNA parçasının cDNA kütüphanesinde olup olmadığı belirlemekte de kullanılmaktadır. PCR’ın birçok çeşidi mevcuttur. Örneğin, RNA’nın çoğaltılmasını ters yazılım gerçekleştirerek sağlayan RT-PCR, DNA ve RNA moleküllerinin sayısına aynı anda ulaşmanızı sağlayan real-time PCR (QPCR) bazılarıdır.
61 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 61 Jel Elektroforezi: Jel elektroforezimoleküler biyolojinin temel ve başlıca tekniğidir. Temel olarak DNA, RNA veya Proteinleri bir elektrik alan içerisinde ayrıştırılmasıdır. Agoroz jel elektroforezinde DNA veya RNA’lar boyutlarının farklılığına göre elektrik alan içerisinde ayrılırlar.
62 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 62 Daha büyük boyuttaki DNA veya RNA parçaları işlem sonunda jelde geride kalırken küçük boyutlu parçacıklar ise başlangıç noktasına göre daha fazla yer değiştirmiş olacaklardır. Proteinler ise elektrik şarjlarına göre “SDS-PAGE” jel denilen sistem üzerinde büyüklüklerine göre ayrıştırılırlar. Bu işlem 2D elektroforezi olarak da bilinmektedir. Macromolecule Blotting and Probing (Makromolekül Eleme ve Sondalama): “Northen”, “Western” ve “Eastern” blotlama terimleri aslında Edwin Southern’in elenmiş DNA’daki hibirdazyonları tespit etmek için bulduğu “Southern Blotting” den türetilmiş bir moleküler biyoloji esprisidir. Patricia Thomas, “Northen Blotting” olarak adlandırılan RNA blotlama sistemlerini geliştirirken aslında hiçbir zaman Northen Blotting ismini de kullanmamıştır. Tüm bu terimlerden daha sonra farklı tekniklerde geliştirilmiştir. Örneğin, protein-DNA hibridizasyonunu inceleyen “Southwestern”, protein- RNA etkileşimini inceleyen “northwesterns” ve protein- protein etkileşimini inceleyen “farwesterns”. Tüm bu tekniklere ve terimlere moleküler biyoloji literatürlerinde karşılaşabilirsiniz.
63 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 63 Southern Blotting (Southern Blot): Edwin Southern tarafından geliştirilen bu teknik DNA’daki özel gen bölgelerin direk olarak incelenmesinde kullanılmaktadır. Restriksiyon enzimleri ile müdahele edilmiş DNA parçacıkları jel elektroforezler ile ayrıştırıldıktan sonra kılcal hareketlerin gerçekleştirileceği özel blotlama yüzeylerine transfer edilirler. Sonrasında bu parçacıkların işaretlenmiş tamamlayıcı DNA parçacıkları ile bütünleştirilmesi sağlanır. Tamamlayıcı DNA parçacıkları genel olarak radyoaktif ışıma yapılanlardan seçilir ama son zamanlarda radyoaktif olmayan parçacıklarda kullanılabilinmektedir. Sonuçta bu ışımalar gözlemlenerek özel gen bölgeleri hakkında bilgiler toplanılır. Fakat PCR tekniklerindeki hızlı gelişmeler sayesinde Southern Blot tekniği laboratuarda çok sık kullanılmamakla beraber yinede gen nakavt ve embriyonik kök hücre hatlarının incelenmelerinde kullanılmaktadır. .
64 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 64 Northen Blotting (Northen Blot): Northen Blot farklı RNA örneklerindeki özellikli RNA ekspresyonu desenlerinin çalışılmasında kullanılmaktadır. RNA denatürasyonun sağlandığı jel elektoroforez tekniği ile bağlantılı çalışmaktadır
65 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 65 Diğer blotlama sistemlerinde olduğu gibi jel elektroforez ile boyutsal ayrışımı tamamlanmış RNA’ların özel bir blotlama yüzeyine transfer edilir ve gözlenmek istenilen RNA dizisi bu yüzeyde işaretlenir. Farklı işaretleme sistemleri mevcut olmak ile beraber genel olarak işaretlemeler RNA dizilerinin büyüklüklerini göstermektedir. Blotlama yüzeyinde belli bölgelerdeki yoğun yapı ilgilenen RNA dizisinin örnekte hangi yoğunlukta olduğunu gösterir. İlgilenilen RNA dizisinin bulunduğu bandın koyuluğu örneğinizden ne yoğunlukla o bölgenin ifade edildiğini de gösterir. Bu işlem genel olarak farklı RNA örneklerin ne miktarda ortamda ifade edildiğine bakılarak gen ekspresyonları hakkında bilgi elde edilebilmesi için kullanılır. Canlı organizmalarda hangi koşullarda ve zamanda gen ekspresyonlarının olduğunu belirlemek için kullanılan temel tekniklerden biridir.
66 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 66 Western Blotting (Western Blot): Antikorlar çok az miktarda proteinin fare, tavşan, koyun (polyklonal antikorlar) veya hücre kültürlerine (monoklonal antikorlar) enjekte edilmesi sonucu hücreler tarafından üretilen biyolojik moleküllerdir.
67 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 67 Antikorlar moleküler biyolojide birçok teknik ve analizde etkili bir şekilde kullanılmaktadır. Western Blotta, proteinler öncelikli olarak SDS (sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) jelinde büyüklüklerine göre ayrılırlar. Bu proteinler daha sonra PVDF, nitrocellulose, naylon veya diğer destekleyici yüzeylere transfer edilir ve antikor propları ile bu yüzeyler yıkanır. Antikorlar ilgilenilen proteinler ile bağlantı kurar. Bu bağlantıyı gözlemlemek için renk üretici olarak kullanılan “chemiluminescence” veya “autoradiography” gibi çeşitli yöntemler kullanılır. Zaman zaman da bu bağlantının doğal olarak ifade edilmiş protein yoğunluğunu tespit etmek için antikorlar ile ikinci bir bağlantı kuracak enzimlerde kullanılmaktadır. “Western Blotting” sadece proteinlerin tespitleri için değil aynı zamanda onların niceliksel bilgilerini de araştırmacılara sağlarlar. Analog olarak “Western Blotting” canlı hücre dokularındaki özellikli proteinlerin boyanması içinde kullanılır. Ama yaygın olarak bu işlem için hücre biyolojisinde FISH olarak adlandırılan “immunostaning” teknikleri kullanılmaktadır.
68 68 Eastern Blotting (Eastern Blot): Bu teknik proteinlerin post-translasyonel değişikliklerini tespit etmek için kullanılır. Özel malzeme kullanılarak proteinlerdeki değişimleri gözlemlemek için proplanmış PVDF veya nitrocellulose yüzeylerine proteinler gömülür. Sonrasında diğer blotlama tekniklerinde olduğu gibi işaretlemeler yaptırılarak gözlemler elde edilmeye çalışılır. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
69 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 69 DNA Arrays (DNA dizileme) Tekniği: DNA dizileme tekniği; tek iplikli DNA oligonükleotid parçacıklarını içeren, mikroskop slâydı üzerinde katı bir yüzeye tutulmuş noktalar kümesinden oluşmaktadır. Bu sayede büyük parçalı DNA dizilerini bile 100 mikron gibi çok küçük noktalar üzerinde gözlemlenebilinir hale getiriliyor. Her noktada ise “Southern Blotting” tekniğinde de olduğu gibi incelenen DNA örneğinin tamamlayıcı zinciri bulunmaktadır. Bu teknik ile bir organizmanın gen ekspresyonu hakkında detaylı bilgi sahibi olunabilinmekte. Bu teknikte, doku içinde RNA izole edilerek işaretlenmiş kopya DNA’lara (c DNA) dönüştürülür. Bu cDNA daha sonra dizi üzerindeki parçalar ile görsel bir hibridizasyon gerçekleştirir.
70 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 70 Çoklu dizileme tekniklerinin bulunması ile sağlıklı hücrelerin DNA dizilimleri ile kanserli hücrelerin DNA dizilimleri karşılaştırılabilinmektedir. Ayrıca herhangi bir organizmada ortam şartlarına göre gen ekspresyonun ne şekilde değişeceği de belirlenebilinir. Örneğin 7.000 gene sahip bir maya olan ''Saccharomyces cerevisiae'' gen ekspresyonlarının sıcaklığa bağlı olarak nasıl değişim gösterdiği de bu teknik ile tespit edilebilinir. Mikro-dizilim teknikleri birden farklı yöntemle üretilebilinir. Genel olarak, 100 mikro çapında kuyucukların oluşturulduğu silikon çipler kullanılır. Bu çiplerin üzerinde 100 den 10.000 ne kadar kuyu olabilmektedir. Dizileme teknikleri sadece DNA’lar için değil aynı zamanda antikorlar içinde dizayn edilip protein ekspresyonları hakkında moleküler biyologların bilgiler elde etmesini sağlarlar.
71 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 71 Allele Specific Oligonucleotide (ASO): ASO DNA’nın bir ipliğinde meydana gelen mutasyonların tespitinde kullanılır. Bu teknik PCR ve Jel elektroforez’e ihtiyaç duyulmadan kullanılmaktadır. 20-25 nükleotitli problar ile parçalanmamış DNA işaretlenir. Bu problarda işlem sürecinde hibridizasyonlarmeydana gelir. Hatta baz değişikleri gizli hibridizasyonlar ile değişir. Sonra hedef DNA yıkanır ve hibridize olmamış problar ortamdan bu sayede temizlenir. Problar ile hibridize olmuş hedef DNA bu probların yaydığı radyoaktif veya floresans ışımalar ile analiz edilir. Tüm moleküler biyoloji tekniklerinde olduğu gibi bu teknikte yapılan değişikliklerin başarılı sonuçlandığı göstermek için önemlidir. Bir baz çiftindeki dizilim farklılıklarını tanımlamak için “IlluminaMethylation Assay” tekniği ASO’ya göre daha avantaj sağlamaktadır.
72 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 72 Eski Teknolojiler: Moleküler Biyolojide teknolojiler geliştikçe eski teknolojiler artık tarih sayfalarında yerini almaktadır. Örneğin, jel elektroforez geliştirilmeden önce DNA parçacıklarının ayrılması “sükroz gradienti” üzerinde çok uzun süreler sonucu yapılıyordu. Ama buna rağmen yeni teknolojilerin çözüm bulamadığı bazı problemlerin çözümünde eski teknolojiler kullanılabilinmektedir.
73 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. BÖLÜM-5 The Polymerase Chain Reaction
74 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 74 Polimeraz Zincir Reaksiyonu, DNA’nın belirli bir bölgesinin tüp içinde çoğaltılması işlemidir. Bu teknik ile DNA molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını yapmak mümkündür. PCR,1985 yılında Cetus adlı biyoteknoloji firmasında çalışan KaryMullis adlı araştırmacı tarafından bulunmuştur.Bu buluşu,KaryMullis ‘in 1993 yılında Nobel Kimya ödülünü almasını sağlamıştır.
75 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 75 • PCR, DNA dizi analizinde ve DNA haritalanmasında, Genetik hastalıkların teşhisinde, DNA parmakizi analizinde, İnsan Genom Projesi ve diğer Genom Projelerindeki araştırmalarda, Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde, Tarımda, Sistematik ve evrim çalışmalarında kullanılmaktadır.
76 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 76 PCR tekrarlanan 3 basamak şeklinde gerçekleşir.Bu basamaklar; 1.Amplifiye edilecek DNA ‘nın yüksek sıcaklıkta denatürasyonu (94ºC ), 2.Primerlerin DNA üzerindeki hedef bölgelerle özgül hibridizasyonuna olanak verecek sıcaklıktaki annealing-birleşme reaksiyonu, 3.Taq DNA polimeraz enziminin yüksek aktivite gösterdiği sıcaklık olan 72 ºC ‘ de primerlerin uzaması-tamamlayıcı zincir sentezi olarak tanımlanabilir.
77 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 77 Polimeraz zincir reaksiyonu için, Kalıp DNA molekülüne, 20-25 baz uzunluğunda ve kalıp zincirin 5’ ve 3’ uçlarındaki DNA dizilerine komplementer olan sentetik oligonükleotitlere, Serbest dNTP ‘lere ( dATP , dCTP , dGTP , dTTP ) Taq DNA polimeraz enzimine Enzimin çalışacağı uygun koşulları sağlayan tampon sistemine ihtiyaç vardır.
78 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 78
81 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 81 Tek örnek için PCR karışımının hazırlanması ( 100 μl toplam hacim ) : DNA 100 ng 10 X Tampon 10 μl dNTP 2 μl ( 200 μmol olacak şekilde) 25 mM MgCl2 6 μl F primer 100 pmol R primer 100 pmol sdH2O 80 μl Taq polimeraz 2.5 ünite Dört tür dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
82 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 82 PCR Koşulları : 94 ºC denatürasyon 55-60 ºC annealing 72 ºC polimerizasyon Annealing derecesi primerin baz içeriğine ve uzunluğuna bağlı olarak değişken bir değerdir.Her primer için annealing değerleri hesaplanır. 2( A + T ) + 4 ( G + C ) Örnek Dizi : 5’CCTTAAGCTGGTGTCCAAAT 3’ 2 ( 11 AT) + 4 (9GC) = 58 0C 5’ GCTAGCAATATTTGTAAGCAT 3’ 2 (14 AT) + 4 ( 7 GC ) = 56 0C
83 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. PCR CİHAZI THERMAL CYCLER
88 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 88 MEHMET KARCİ ‘NIN TEZ ÇALIŞMASI UYGULAMALI GEN AMPLİFİKASYONU: PCR TEKNOLOJİSİ PCR (POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU) Standart PCR Reaksiyon Karışımı: Çalışılan standart PCR karışımı (25 μl) aşağıdaki şekilde hazırlanır. Reaksiyonların tamamı 30 döngü uygulanır. Tablo 1. PCR Reaksiyon Bileşenleri Bileşen Hacim Final Konsantrasyonu Otoklavlanmış-filtre edilmiş su 20.7 μl –(pH 7.0) 2- 10 X PCR Tampon* 2.5 μl 1 X
89 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 89 3. dNTP karışımı (herbiri 0.2 μl 200 μM herbir nükleotitden 25 μM) 4. Primer karışımı (herbiri 0.4 μl 0.4 μM herbir primerden 25 pmol/μl) 5. Taq DNA polimeraz 0.2 μl 1 ünit/25 μl (native enzim=doğal yapıda enzim) 6. Genomik DNA kalıbı 1.0 μl 100 ng/μl (100 ng/μl) *PCR tamponu satıcının (Perkin Elmer Cetus) tavsiyesi üzerine kullanılmıştır. 10 X Tampon : 500 mMKCl, 100 mMTris-HCl (pH 8.3), 15 mMMgCl2 (PCR karışımında bu maddelerin final konsantrasyonları şöyledir : 50 mMKCl, 10 mMTris-HCl, 1.5 mMMgCl2) Yukarıda miktarı belirtilen tampon daha fazla hazırlanabilir (10-15 ml) ve bu tampon tüplerde –20 oC’de uzun süre saklanabilir
90 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 90 Pipetleme ve DNA Kalıbı Pipetlemeye su ile (ilk olarak) başlanmak daha iyi olur. Daha sonra sırasıyla diğer bileşenler pipetlenir. PCR reaksiyon bileşenleri farklı bir sırada pipetlenirse sonuçlarda pek farklılık görülmez. DNA kalıbına primer bağlanma ihtimalini azaltmak ve ilk denatürasyon basamağından önce polimerazın çalışmasını engellemek amacıyla; reaksiyon bileşenlerinin pipetlenmesi buz üzerinde yapılır ve tüpler de buz içinde tutulur. Plazmidler laboratuvarda kullanılıyorsa; pipetleme steril hava akımının olduğu yerlerde; genomik DNA ya da fazla miktarda DNA kalıp olarak kullanılıyorsa pipetleme bençlerde de yapılabilir. PCR’da kalıp olarak kozmidler, fajlar ya da plazmidler kullanılıyorsa, aerosol rezistant pipet tipinin kullanması gereklidir. Aksi takdirde, çoğu kez yanlış pozitif sonuçlara karar verilir (kalıp DNA miktarının amplifikasyon için yeterli olmasına rağmen).
91 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 91 Genomik DNA benzeri kompleks DNA kalıplar kullanılıyorsa (bu durumda 10-100 ng miktarında örnek reaksiyona girer) bu tedbir gerekli olmayabilir. Yine de, her PCR reaksiyonu için aerosol rezistan pipet tiplerinin kullanılması güvenirlik açısından önemlidir. Düşük miktarlarda(1-2 μl) kompleks DNA (genomik DNA) örneklerinin pipetlenmesi sırasında karşılaşılan diğer bir problem ise, herbir PCR tüpüne gerçekte konulan DNA miktarında meydana gelebilecek farklılıktır. Fig. 5 ------
92 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 92 Fig. 5. Pipetleme hatasına örnek çoklu (multiplex) PCR test reaksiyonu. İki farklı genomik DNA örneği (herbiri 100 ng/μl) Mix J’li çoklu PCR karışımında kullanıldı. 11 farklı gen bölgesi (165 ve 85 bp uzunluğunda) aynı zamanda amplifiye edildi. İşaretleme radyoaktif dCTP ile, ürünlerin ayırımı da PAA jel ile yapılmıştır. A örneğinin herbirinden (1-4 nolu tüpler) 1 μl ve B örneğinin (5-8 nolu tüpler) herbirinden de 1 μl kuyucuklara yüklendi. Sol tarafta, DNA her tüpe ayrı ayrı pipetlendi. Sağ tarafta, DNA diğer PCR bileşenleri ile karıştırıldı ve bu karışım tüplere eşit miktarlarda bölündü. Sol taraf amplifikasyonlar, genomik DNA’nın 1 μl’sinin değişik miktarlarda DNA içerebildiğini işaret etmektedir. Bu durum, özellikle PCR reaksiyonlarının ve PCR niceliğinin yorumlanmasına negatif etki yapabilir. Sağ taraf amplifikasyonları birbirleriyle daha uyumludur (1-4 ve 5-8 karşılaştırılınca). Küçük değişiklikler, termaldöndürücünün metal bloklarındaki değişik alanlarda sıcaklık farklılıklarından kaynaklanabilir
93 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 93 İlk PCR Programı: Spesifik olmayan ürünler oluşturmadan, spesifik bir gen bölgesini amplifiye etmek optimal bir PCR reaksiyonu için gereklidir. Annealing sıcaklığı yeterince yüksek olmak zorundadır; bu olay reaksiyon sırasında hatasız DNA-DNA birleşimine olanak sağlar. Verilen herhangi bir primer çifti için PCR programı, primerin kompozisyonu (GC içeriği) ve beklenilen PCR ürününün uzunluğu temel alınarak seçilebilir. Bu gibi durumların çoğunda, amplifiye olması beklenen ürünler kısmen küçüktür (0.1-2 ya da 3 kb). Uzun aralıklı (long-range) PCR için (amplifiye ürünler 10-20 ya da 30 kb) ticari kitler kullanışlıdır. Taq polimerazın aktivitesi optimal sıcaklıkta (72-78 oC ) yaklaşık 2000 nükleotit/dakikadır ve reaksiyonda uzatma zamanı (extention time) uygun şekilde hesaplanabilir.
94 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 94 Enzim aktivitesi reaksiyon sırasında her zaman optimal olmayabilir. Amplifiye olan ürünlerin kb sayısına eşit olacak şekilde uzatma zamanı yazar tarafından uygulanır (1 kb için 1 dakika, 2 kb için 2 dakika gibi). Daha sonraları, ürünler bilindiğinde uzatma zamanı düşürülebilir. Birçok araştırmacı, aktüel döngü başlamadan önce ilk denatürasyon basamağını 2-5 dakika uygulamaktadır. Bu olayın, hedef DNA’nın denatürasyonunu kolaylaştırdığı farzedilmektedir. Ayrıca, birçok makalede 5-10 dakikalık en son bir uzatma zamanı tanımlanmıştır (böylece son döngü sırasında başlatılan birçok PCR ürününün uzamasının devamı sağlanmış olur). 30-60 saniyelik bir annealing zamanı şimdiye kadar test edilen bütün primer çiftleri için yeterlidir. Annealin sıcaklığı primerlerin erime (melting) sıcaklığı temel alınarak seçilebilir. Bu yüzden, birçok kez kullanılan basit bir prosedürde, başlangıç annealing sıcaklığı yazar tarafından 54 oC olarak kullanılmıştır (uzunluğu 20 bp ya da daha uzun olan birçok primer için bu durum iyidir.)
95 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 95 Spesifik olmayan ürünler oluşursa bu sıcaklık artırılmalıdır. Eğer reaksiyon istenileni veriyorsa (sadece istenilen ürün sentezlenmiş ise) bu sıcaklıkta devam edilir. İki primerin birbirine yakın erime sıcaklığı ya da Tm derecesine sahip olması arzu edilir (5 oC ya da daha düşük). İki primer arasındaki Tm farklılığı yüksek ise, 5’ ya da 3’ uçta yeralan primerin uzunluğunun artırılması ile düşük Tm derecesi artırılır. Bu çalışmada 70 ya da daha fazla primer kullanılmıştır. 94 oC lik 30-60 saniyelik denatürasyon zamanında iyi PCR ürünleri alınmıştır. Daha uzun bir denatürasyon basamağında, yüksek sıcaklıkta Taq polimerazın zamanı uzayacak ve polimeraz moleküllerinin % aktivite kaybı artacaktır. Döngü Sayısı: Genelde, 30 döngü alışılmış PCR için yeterli olur. Döngü sayısındaki artış ürün miktarında keskin değişmeler yapmayacaktır.
96 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 96 Spesifik olmayan ürünler oluşursa bu sıcaklık artırılmalıdır. Eğer reaksiyon istenileni veriyorsa (sadece istenilen ürün sentezlenmiş ise) bu sıcaklıkta devam edilir. İki primerin birbirine yakın erime sıcaklığı ya da Tm derecesine sahip olması arzu edilir (5 oC ya da daha düşük). İki primer arasındaki Tm farklılığı yüksek ise, 5’ ya da 3’ uçta yeralan primerin uzunluğunun artırılması ile düşük Tm derecesi artırılır. Bu çalışmada 70 ya da daha fazla primer kullanılmıştır. 94 oC lik 30-60 saniyelik denatürasyon Tablo. 2. İlk PCR Programının Dizaynı İsim Sıcaklık Zaman İlk denatürasyon 94 oC İsteğe bağlı Denatürasyon 94 oC 30-60 sn Annealing (bağlanma) 54 oC 30-60 sn Extension (uzatma) 72 oC 30-90 sn Son uzatma 72 oC İsteğe bağlı
97 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 97 Termal döndürücü ve PCR Tüpleri: PCR tüplerinin ve termaldöndürücünün farklı tipleri mevcuttur. Bazı potansiyel yararlı gözlemler aşağıda belirtilmeye çalışılmıştır : Aynı PCR programı değişik termaldöndürücülerde önemli bir farklılık olmadan çalışacaktır (sıcaklık ve zaman profilleri farklı olabilir), böylece aynı primerin kullanıldığı PCR sonuçları değişik olabilir. Bununla birlikte, döngünün uygun şekilde ayarlanması ile aynı sonuçlar birçok termaldöndürücüde gözlenebilir. iyi PCR ürünleri alınmıştır. Daha uzun bir denatürasyon basamağında, yüksek sıcaklıkta Taq polimerazın zamanı uzayacak ve polimeraz moleküllerinin % aktivite kaybı artacaktır. Döngü Sayısı: Genelde, 30 döngü alışılmış PCR için yeterli olur. Döngü sayısındaki artış ürün miktarında keskin değişmeler yapmayacaktır.
98 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 98 Yeni birçok PCR makinesi 0.2 ml ince-duvarlı PCR tüplerine uygun hale getirilmiştir. Tüplerin bu tipleri için tüpten tüpe sonuçlardaki farklılıklar çoğunlukla ihmal edilir (plastik ve metal arasındaki ilişki iyidir, ısıtma olayıda buna yardımcı olur). Eski makine tipleri 0.5 ml ya da 1.5 ml tüplere uygundur. Şirketler arasında duvar kalınlığı ve şekilde önemsiz farklılıklar olmamasına rağmen, termaldöndürücülerin metal blokları ve tüpler arasındaki ilişki her zaman iyi olmayabilir. Çoğunlukla bu tür durumlarda amplifikasyonlar olmaz ya da çok az olur. Böyle bir duruma örnek aşağıda verilmiştir. Bazı firmalar, reaksiyon sırasında PCR tüplerinin içine yerleştiği küçük su banyolarının sıcaklığını kontrol eden makineler sunmaktadır. Bu durumda su ve plastik arasındaki termal değişim iyi olmakta, PCR sonuçlarındaki varyasyonlar en aza düşmektedir.
99 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 99 Fig. 6. Metal blok ve bazı tüpler arasında uygun ilişkinin kaybolmasından kaynaklanan amplifikasyon varyasyonları. PCR karışımı 9 farklı tüpte aynı bileşenleri eşit şekilde içermektedir ve tüpler termaldöndürücününmetal bloklarının farklı kuyularına yerleştirilmiştir. 2,4,5 ve 9 reaksiyonlar negative sonuç vermiştir
100 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 100 PCR PRİMERLERİNİN SEÇİMİ VE DİZAYNI PCR için primerlerin dizaynında aşağıdaki basamaklar/yollar test edilmiştir ve yararlı oldukları kanıtlanmıştır. Primerlerin boyutları 18-24 bp arasındadır. Büyük primerler (30-35 bp) kısa primerler ile karşılaştırıldığında bunların daha benzer döngü şartlarında çalıştıkları görülür ve bu durum PCR’ı daha da kolaylaştırır. Tm derecesi ya da erime sıcaklığı yakın olan iki primerin kullanılması faydalıdır. İki primer arasındaki Tm farklılığı yüksek ise; düşük Tm derecesi 5’ ya da 3’ uçta yeralan primerin uzunluğunun artırılması yoluyla yükseltilebilir.Pürin : pirimidin içeriği 1 : 1 civarında olmalıdır (%40-60 olabilir).Primer sekansı 1-2 pürin bazıyla başlamalı ve bitirilmelidir. Her primer çifti primer-primer etkileşimi bakımından test edilmelidir. Bu amaçla kullanılabilecek yararlı Macintosh programı “CPrimer” dir. Bu program sekansa giriş için erime sıcaklığını da verir. Bu şekilde PCR programlarının dizaynına yardımcı olur. Bazı web sitelerinin direkt olarak kullanılabilen programları aynı fonksiyonu yapabilir (erime sıcaklığının, uygun primerlerin seçilmesi gibi).
101 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 101 Primer sekansları; istenilen DNA sekanslarıyla ve genomda başka yerdeki gen bölgeleri ile ya da sıralı sekanslar ile benzerlikleri bakımından kontrol edilmelidir. Eğer iki gen bölgesi çok benziyor ise ( örneğin across türler); amplifiye olan gen bölgesinin 3’ ucuna spesifik olan primer en az 1-2 baz fazla olacak şekilde dizayn edilir. Döngü şartları ve tampon konsantrasyonları her primer çifti için ayarlanabilir. Sekonder ürün oluşturulmadan istenilen gen bölgesinin amplifikasyonu spesifikleştirilmiş olur. Bu durum mümkün değil ise, primerlerin sekansları (her ikiside) 4-5 baz uzatılır ya da primer çifti tamamen değiştirilir.
103 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 103 Soru: PCR reaksiyon hacmi sonuca olumsuz etki eder mi? Yanıt : Hayır. Özellikle de küçük hacimli, ince duvarlı, 0.2 ml plastik tüpler termal döndürücünün 96 kuyucuklu metal bloklarına uygundur. Gözlemlerin birkaçı şu şekilde sıralanabilir : Eğer eski model termal döndürücü kullanılıyorsa (ısıtma kapağı olmayan) PCR reaksiyonları küçük hacimlerde yapılır ve mineral yağı reaksiyon karışımlarını örtmek için gereklidir. Yağın kullanılması tüpteki sıvının hacmini artırır ve az da olsa sonucu etkiler. Ayrıca, eski termal döndürücülerde büyük, kalın duvarlı plastik tüplerin kullanılması gerekiyorsa metal bloklara yerleştirme olayında düzensizlikler oluşur ve PCR sonuçlarında değişkenlik ihtimali artabilir. 96 kuyucuklu metal bloklar için dizayn edilen küçük, ince duvarlı tüpler küçük hacimli PCR reaksiyonları için idealdir. Termald öndürücülerin ısıtma kapağı varsa mineral yağına gereksinim yoktur. 100, 25, 5 ml. karışımlar kullanılarak reaksiyonların benzer sonuçlar verip-vermediği test edilir.
104 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 104 Önemli bir noktayı da belirtmek gerekirse; DNA kalıbı az miktarda kullanılıyorsa az hacimli PCR’ lar çok yararlı olabilir. Kalıp DNA miktarı sabit olduğunda, genelde, reaksiyon karışımı olan 5 m l 100 m l ile karşılaştırıldığında reaksiyonun her mikrolitresindeki PCR ürün miktarı daha yüksek bulunacaktır. Böyle bir durum PCR ürünlerinin görünmesine imkan verir, bazen hacmin fazla olduğu reaksiyonlarda bantlar görünmeyebilir.
105 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 105 ÇOKLU PRİMER ÇİFTLERİ Tek Gen Bölgesi Amplifikasyonu : Çoklu (multiplex) bir PCR dizaynındaki ilk basamak primer çiftlerinin seçimidir. Verilen bütün gen bölgelerinin optimal amplifikasyonunu sağlayan bir PCR programını bulmak oldukça önemlidir (Fig. 9). Böyle bir durum annealing, uzatma zamanı ve sıcaklığın ayarlanması yoluyla başarılabilir.
106 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 106 Çoklu Eşmolar Primer Karışımları: Sonraki basamak; her primerin eşmolar oranda kullanılmasıyla istenilen primer çiftlerinden oluşan çoklu karışımlardır. Çoklu karışımlar PCR amplifikasyonu yapabilir, önce tek primer çiftinde olduğu gibi tamamen aynı PCR programı kullanılır. Çoğu kez, bu olay bazı gen bölgelerinin tercihen amplifikasyonu ile sonuçlanacaktır. Böyle bir durumda, primer konsantrasyonunda ve döngü şartlarında ek düzenlemeler yapmak gerekli olacaktır. Gerçi, bazen spesifik olmayan ürünler tek gen PCR’ın da görülebilir (sarı ok, PCR ürün # 2), bu spesifik olmayan ürünler çoğunlukla çoklu PCR yapıldığında görülmez olur. Bu durum muhtemelen spesifik olmayan ürünleri örten birçok spesifik gen bölgesinin aynı zamanda amplifikasyonu yoluyla olur.
108 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 108 Döngü şartlarının Ayarlanması : Annealing zamanı ve sıcaklık Uzatma zamanı ve sıcaklık Örneğin Fig.11’de uzatma sıcaklığının etkisi gösterilmektedir. Eşmolar karışımlar iki farklı PCR programı kullanılarak amplifiye edildi. Birinci programda 65 oC (sarı hat) ve diğerinde 72 oC (yeşil hat) uzatma sıcaklığı kullanılmıştır. Program A kullanıldığında genelde A, B ve D için PCR ürünlerinin miktarı daha fazladır. Bu olayda şunu göstermektedir, 72 oC uzatma sıcaklığı bazı gen bölgelerinin (pembe oklar) amplifikasyonunu negatif etkilerken, görülebilen bazı spesifik olmayan ürünler de (sarı ok) oluşturmaktadır. Aynı örneklerde kısa PCR ürünleri için daha yüksek annealing sıcaklığının kullanılması, annealing sonrası polimerazca kopyalanma şansı bulunan DNA zincirinde azalma meydana getirir. Muhtemelen bu sıcaklık DNA heliksinin stabilitesine zarar verir.
110 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 110 Primer Miktarı ve Tampon Konsantrasyonu: Fig. 11’de bulunan DNA ürünlerinin bazılarının amplifikasyonunu düzeltmek için primerlerin miktarları bu gen bölgelerinde 2-5 X artırıldı. Aynı zamanda, PCR tampon konsantrasyonu 2 X artırıldı. Bu modifikasyonlar çok daha etkili olmakta ve amplifikasyonu (spesifik olmayan ürünlersiz) gerçekleştirmektedir.
111 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 111 PCR PRİMERLERİNİN MİKTARI Çoklu PCR Primer Konsantrasyon Değerleri: PCR reaksiyonu sırasında mevcut DNA primerlerinin miktarları sonuçları etkiler. Bir PCR reaksiyonunda primer konsantrasyonu (örneğin tek gen bölgesi amplifiye edilcekse) herbir primerden 100-500nM olacak şekilde kullanılır (primerlerin herbiri 10-25 m Marasındaki konsantrasyonlarda değişik kaynaklardan alınabilir. Çoğunlukla, 0.5-1 m l primer solusyonu 25-100 m l bir PCR reaksiyonu için yeterlidir). Eşmolar primer karışımlarının kullanıldığı çoklu bir PCR test tüpünde, tek tek primerlerin miktarı 500-15 nM arasında değişir. 14 adet primerin (7gen bölgesi için) kullanıldığı karışım A’da ve karışım B’de final konsantrasyonu, karışım A için 7000-200 nM arasında, karışım B için 5000-150 nM arasında değişmektedir. Gerçi eşmolar primer karışımları çoğu kez bütün gen bölgelerinin optimal amplifikasyonu için kullanılmaz. Bu test tüpü kaçınılması gerekli olan oldukça düşük ve oldukça yüksek primer miktarlarının gözlenmesine imkan vermektedir.
113 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 113 Primer ve Kalıp Konsantrasyonu : Sınırlar dahilinde, primer konsantrasyonunda artış PCR reaksiyonlarının sonuçlarını düzeltebilir ve PCR reaksiyonlarını optimize etmede gözönünde bulundurulmalıdır. Bu suretle aşağıda Fig. 14’de kalıp DNA ve primer konsantrasyonlarındaki artış PCR sonuçlarını düzeltmiştir.
114 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 114 PCR TAMPONLARI Yaygın şekilde çok kullanılan PCR tamponu sadece Tris, MgCl2 ve KCl içermektedir (örneğin Perkin Elmer Cetus). Biraz daha kompleks bir tampon önceleri DMD gen ekzonlarının çoklu reaksiyonları için öneriliyordu. Bu tamponların çoklu PCR reaksiyonunda Taq polimerazın aktivitesindeki etkileri karşılaştırıldı. Fig.15’de görüldüğü gibi, dört farklı genomik DNA kalıbı üzerinde yapılan PCR reaksiyonları, 1 X DMD tamponuna göre 1.6 X tamponunda daha etkin (daha fazla PCR ürünü ) oluşturmaktadır. Kalıp DNA ve primer bütün reaksiyonlarda aynı tutulup, aynı zamanda aynı şartlarda yapıldı. Jel üzerindeki herbir hatta ürünler eşit miktarlarda yüklendi.
115 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 115 Tablo. 3. PCR tamponlarının kullanılması. 10 X PCR Tamponu 5 X DMD Tamponu 500 mMKCl 83 mM(NH4)2SO4 100 mMTris-HCl 335 mMTris-HCl (pH 8.3) 15 mMMgCl2 33.5 mMMgCl2 Reaksiyondaki optimal 50 mMb -merkaptoetanol dNTP konsantrasyonu 34 mMEDTA 200 m M Reaksiyondaki optimal dNTP konsantrasyonu = 6000 m M
117 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 117 TUZ (KCL) KONSANTRASYONU Birden fazla gen bölgesinin çoklu PCR amplifikasyonu için ya da başarılı PCR için (özellikle 100-1000 bp arasındaki ürünler için) tampon konsantrasyonunun 1.4 X-2 X yükseltilmesi (ya da sadece KCl konsantrasyonunun 70-100 mMcivarına yükseltilmesi) reaksiyonun etkinliğini artırmaktadır.
118 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 118 Gerçektende KCl konsantrasyonunun etkisi test edilen herhangi bir düzenleyiciye göre (DMSO, gliserol, BSA) daha önemli bulunmuştur. Genel olarak, uzun amplifikasyon ürünleri oluşturan çoğu primer çifti düşük tuz konsantrasyonlarında daha iyi çalışırken, kısa amplifikasyon ürünü oluşturan çoğu primer çifti yüksek tuz konsantrasyonunda daha iyi çalışır. Aşağıdaki 3 figürde iyonik kuvvet artışına bağlı olarak kısadan uzuna doğru ürünlerin yoğunlukları verilmiştir. Tuz konsantrasyonundaki bir artış kısa DNA’ya göre uzun DNA’yı daha yavaş denatüre eder. Bu nedenle tercihen kısa moleküller amplifiye edilecektir. Bununla birlikte bazı primerler tampon/tuz konsantrasyonlarının geniş aralığında iyi çalışır. Farklı tampon konsantrasyonlarında çoklu reaksiyon örnekleri Fig. 16, 17 ve 18’de gösterilmektedir. Fig 16’da gen bölgesi 6 için iki primerin erime sıcaklığı 58 oC iken, gen bölgesi 5 için erime sıcaklığı 52 oC civarındadır. Aynı iyonik kuvvette (1 X tampon) ve annealing sıcaklığında (54 oC) gen bölgesi 6 amplifikasyonunun gen bölgesi 5’in daha ilerisinden yapılması önerilir.
119 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 119 Annealing sıcaklığını aynı tutulması sırasında, gen bölgesi 5’e primerlerin bağlanmasını artırmak için PCR tamponunun konsantrasyonunun (stringency) düşürülmesi gerekmektedir. Bu olay, KCl konsantrasyonunun (ya da tampon) artırılması ile sağlanabilir. Gen bölgesi 7 farklı bir örnektir, her iki primer gen bölgesi 6 için kullanılan (58 oC) primerler ile aynı erime sıcaklığına sahiptir. Bunlar (6 ve 7 gen bölgeleri) 1 X tamponda iyi amplifiye olmamıştır, buna karşılık tuz konsantrasyonundaki artışa cevap iyi olmuştur. Bu durum; 7. ürünün tümünün 6. ürüne göre daha düşük GC içeriğine sahip olması şeklinde açıklanabilir. Uzatma sıcaklığına maruz bırakıldığında ürün 7’nin DNA heliks stabilitesinde azalma yapar. Yeni zincirlerin bazısı, polimeraz onları tam amplifiye etmeden önce kalıptan ayrılabilir. Tamponun (1.6 X-2 X) konsantrasyonunun azalması, yeni sentez edilen zincirlerin kalıba daha iyi bağlanmasını (yapışmasını) sağlayabilir ve polimerazın görevini sonlandırmasın imkan sağlar. Sadece KCl ya da Tris-HCl konsantrasyonunda değişkenlik olan PCR reaksiyonlarının, KCl konsantrasyonlarından etkilendikleri gösterildi.
120 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 120 Tris-HCl konsantrasyonu, konsantrasyonun geniş aralığında reaksiyonun sonuca etki etmezken, MgCl2 konsantrasyonu az da olsa farklı etkiye sahiptir.
121 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 121 PCR PROGRAM DİZAYNI Temel Prensipler : Spesifik olmayan ürünlerin oluşturmadan, spesifik bir gen bölgesinin çoğaltılması, optimal bir PCR reaksiyonu için gereklidir. Bu yüzden, reaksiyon sırasında DNA-DNA eşleşmesinin çok iyi olması için annealing sıcaklığının yüksek olması gerekir. Verilen herhangi bir primer çifti için PCR programı; primerin baz kompozisyonu (GC içeriği) ve beklenilen PCR ürününün uzunluğu temel alınarak seçilebilir. Bu durumlarda genelde amplifiye olması beklenilen ürünler kısmen küçüktür (0.1-2 ya da 3 kb). Uzun aralıklı PCR için (amplifikasyon ürünleri 10-20 ya da 30 kb) ticarı kitler avantajladır. Taq polimerazın aktivitesi, optimal sıcaklıkta (72-78 oC) yaklaşık 2000 nükleotit/dakikadır ve reaksiyonun uzatma zamanı uygun şekilde daha sonra ayarlanabilir. Reaksiyon sırasında, enzim her zaman optimal aktivite göstermeyebilir. Uygulayıcı tarafından, uzatma zamanını (dakikada) amplifiye olan ürünün kb sayısına eşit olarak ayarlamak çoğu kez uygulanan bir yöntemdir (1 kb için 1 dakika, 2 kb için 2 dakika gibi). Sonra ürünler tanımlanınca, uzatma zamanı daha da indirilebilir.
122 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 122 Birçok araştırmacı aktüel döngü başlangıcı öncesinde ilk denatürasyon basamağını 2-5 dakika olarak kullanır. Bu durumunun, hedef DNA’nın denatürasyonuna daha da yardımcı olduğu ifade edilmektedir. Ayrıca, 5- 10 dakikalık bir enson uzatma zamanı birçok yayında belirtilmiştir (son döngü esnasında başlayan birçok PCR ürününün ya da büyük bir kısmının uzamasının sonlanmasına yardımcı olduğu ifade edilir). Bu iki basamak farklı gen bölgeleri için test edilmiştir, ne ilk denatürasyon ne de son uzatma zamanı PCR reaksiyonunun sonucunda değişme yapmamıştır. Bundan dolayı, uygulayıcının düşüncesine göre bu basamaklar artık kullanılmayanilir. Annealing zamanı, primerlerin erime sıcaklığı temel alınarak seçilebilir. Bazen sonuçlar beklenildiği gibi olmayabilir. Bundan dolayı, 54 oC yazar tarafından başlangıç annealing sıcaklığı olarak kullanılmıştır (20 bp civarında ya da daha fazlasında birçok primer için çoğunlukla iyi sonuç verdi). Eğer spesifik olamayan ürünler oluşursa, bu sıcaklık artırılmalıdır. Eğer reaksiyon özgül ise (sadece beklenen ürünler sentez ediliyorsa) sıcaklık olduğu gibi kullanılmalıdır.
123 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 123 Bu çalışma esnasında 70 ya da daha fazla primer kullanılmıştır. 30-60 saniyelik bir denatürasyon zamanı etkili ve başarılı bir PCR için yeterli görülmüştür. Denatürasyon zamanındaki bir uzama, yüksek sıcaklık altında Taq polimerazın zamanını artıracak ve polimerazmoleküllerde aktivite kayıp yüzdesini çoğaltacaktır. Döngü sayısı. Genelde, 30 döngü PCR reaksiyonları için yeterli olacaktır. Döngü sayısındaki bir artış ürünlerin miktarında keskin bir değişim yapmayacaktır. Annealing Sıcaklığının ve Amplifiye Olan Gen Bölgesi Sayısının Etkisi : Diğer PCR’lardan farklı olarak çoklu reaksiyonlar yeterli bir sıcaklıkta (stringent) tamamlanmalıdır. Birçok bireysel gen bölgesi 56 oC –60 oC’lik bir annealing sıcaklığında spesifik olarak amplifiye edilebilir. Deneylerin gösterdiğine göre, annealing sıcaklığının 4-6 oC düşürülmesi çoklu karışımlarda aynı gen bölgesinin birlikte amplifikasyonu için gereklidir. Bu durum aşağıda fig 19’da gösterilmektedir. Aşağıdaki ifade, tek parametrenin değiştirildiği (annealing sıcaklığı) şartlarda yapılan aynı PCR reaksiyonlarını göstermektedir. Karışım C ve C*’nün çoklu PCR amplifikasyonu için annealing sıcaklığı yaklaşık 54 oC görülmektedir.
124 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 124 Bireysel gen bölgeleri (örneğin Y) 60 oC’ de amplifiye olabilir. 54 oC’de çoklu karışımda bazı spesifik olmayan amplifikasyonlar hala görünür. Bu durum (non-spesifik bantların görüntüsü), spesifik gen bölgelerinin sayısını artıran aynı zamanlı amplifikasyonlar aşılır ve bu yüzden artıklar görülmez. PCR’da baz kompozisyonundaki farklılıklardan dolayı (ürünlerinin uzunluğu ya da sekonder yapısı), bazı gen bölgeleri diğerlerine göre daha etkin amplifiye olur. Birçok gen bölgesi aynı zamanda amplifiye olursa (çoklu amplifikasyon), etkin şekilde amplifiye olan gen bölgesi etkisiz amplifiye olan gen bölgelerinin ürün miktarını negativ etkileyecektir. Bu fenomen PCR reaksiyonunda enzimlerin ve nükleotitlerin kısmen sınırlı kullanımından dolayıdır. Bunun için çoklu prosedürde daha etkin amplifiye olan gen bölgesi rekabeti kazanır ve amplifiye olan ürünlerin etkinliğini azaltır. Böylece ürünlerde zayıf görüntü ya da görünmezlik oluşturur. (aşağıda Fig 19’da annealing sıcaklığında kompleks durumlar belirtilmiştir. Aynı anda amplifiye olan gen bölgelerinin sayısı ve tampon konsantrasyonu paralel reaksiyonlarda değiştirilmişti)
125 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 125 Fig.19. Karışım C*, karışım C ve primer Y’nin çoklu amplifikasyonları. Annealing sıcaklığı farklı olan (48 oC, 54 oC ya da 59 oC) üç PCR programında üç farklı DNA kalıbı kullanılmıştır. Mix C* (her jeldeki ilk üç bant) ve Mix C (1 X ya da 2 X PCR tamponunda 7-12 hatlar) ve primer Y (4-6 hat, mavi ok) . Her jeldeki 1-9. hatlar 1 X PCR tamponundaki reaksiyonları gösteriyor.
126 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 126 Her jeldeki 10-12. hatlar 2 X PCR tamponundaki reaksiyonlar gösteriyor. Her jeldeki 7-12. hatlar (1 X ve 2 X altındaki ) primer karışım C’lidir. İlk jelin sol bölgesindeki 5 ok karışım C*’nin beklenilen ürünlerini işaret etmektedir. Her jeldeki en uzun spesifik ürün kırmızı okla işaret edilmektedir. Sarı oklar, karışım C* ile karşılaştırılan karışım C’deki beklenilen 2 ekstra ürünü (toplam 7 ürün) işaret etmektedir. Mavi oklar, son iki jelde bazı reaksiyonlarda Y ürünlerinin kaybını ya da ilk jelde Y ürünlerinin pozisyonunu işaret etmektedir. Çoklu karışım 48 oC’de birçok non-spesifik bant göstermektedir. 1 X PCR tamponunda, karışım C* de karışım C’ye göre Y ürünleri daha belirgindir. PCR tampon konsantrasyonu 1 X- 2 X aralığında bütün spesifik ürünlerin amplifikasyonuna olanak verir ve çoğu non-spesifik uzun ürünlerin yoğunluğunun azalmasına yardım eder (7-9, 10-12 hatlar karşılaştırılınca). 2 X tamponunda görülen belirgin 470-480 bp nonspesifik bant (mor ok) farklı primerlerin değiştirilmiş oranları sayesinde elemine edildi. 59 oC’de sadece Y ürünü görülebilir. Bunun olabilmesi için, 2 X tamponu kullanılmalısa ya da gen bölgesi tekbaşına amplifiye olmalıdır.
127 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 127 Döngü Sayısı : Primer mix C* iki farklı genomik DNA kalıbını amplifiye etmek için kullanıldı. Aynı DNA kalıbı için sonuçlara bakıldığında, bütün tüpler arasında iki genomik DNA’nın birinde daha iyi olduğunu ortaya çıkardı. Bu durum muhtemelen DNA miktarından ya da kalitesinden dolayıdır. Ürünlerin miktarları arasındaki en belirgin varyasyon 24. döngü civarındadır (etidyumbromid ile boyanan jeller için). 28-30 döngü genel olarak reaksiyonda yeterlidir. Döngü sayısının 45 üzerine çıkmasıyla çok küçük değişimler gözlenmiştir ya da hiç değişim gözlenmemiştir.Döngü sayısı 60 üzerine çıktığında küçük kantitatif faydalardan bahsedilebilir (Fig.20)
128 KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti. 128 Her jeldeki 10-12. hatlar 2 X PCR tamponundaki reaksiyonlar gösteriyor. Her jeldeki 7-12. hatlar (1 X ve 2 X altındaki ) primer karışım C’lidir. İlk jelin sol bölgesindeki 5 ok karışım C*’nin beklenilen ürünlerini işaret etmektedir. Her jeldeki en uzun spesifik ürün kırmızı okla işaret edilmektedir. Sarı oklar, karışım C* ile karşılaştırılan karışım C’deki beklenilen 2 ekstra ürünü (toplam 7 ürün) işaret etmektedir. Mavi oklar, son iki jelde bazı reaksiyonlarda Y ürünlerinin kaybını ya da ilk jelde Y ürünlerinin pozisyonunu işaret etmektedir. Çoklu karışım 48 oC’de birçok non-spesifik bant göstermektedir. 1 X PCR tamponunda, karışım C* de karışım C’ye göre Y ürünleri daha belirgindir. PCR tampon konsantrasyonu 1 X- 2 X aralığında bütün spesifik ürünlerin amplifikasyonuna olanak verir ve çoğu non-spesifik uzun ürünlerin yoğunluğunun azalmasına yardım eder (7-9, 10-12 hatlar karşılaştırılınca). 2 X tamponunda görülen belirgin 470-480 bp nonspesifik bant (mor ok) farklı primerlerin değiştirilmiş oranları sayesinde elemine edildi. 59 oC’de sadece Y ürünü görülebilir. Bunun olabilmesi için, 2 X tamponu kullanılmalısa ya da gen bölgesi tekbaşına amplifiye olmalıdır.
129 İNSAN VÜCUDUNDA YAKLAŞIK OLARAK YÜZ TRİLYON HÜCRE,ALTI MİLYAR KİLOMETRE UZUNLUĞUNDA DNA BULUNMAKTADIR. GENLERİN SAYISI,ÇALIŞMASI VE DİZİLİMİ GÖZÖNÜNE ALINDIĞINDA «İNSAN» «BENZERSİZ BİR VARLIKTIR». TÜM BU EĞİTİM BOYUNCA GÖSTERMİŞ OLDUĞUNUZ SABIR VE İLGİ İÇİN TEŞEKKÜR EDERİM… KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
130 GÖZDEN GEÇİRME VE ÖZET KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
131 SORULARINIZI YANITLAYALIM ? KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
132 İletişim KariyerBenim Eğitim & Danışmanlık & Bilişim Ltd.Şti. Adres : Aksaray Üniversitesi Kampüs Çarşı 68100 Aksaray / Merkez Facebook : www.facebok.com/kariyerbenim Twitter : www.twitter.com/kariyerbenim Mail : info@kariyerbenim.com Kurumsal Danışma Hattı : +90 543 61 00 714 Web : www.kariyerbenim.com GB-Lab. KariyerBenim Eğitim & Danışmanlık & Bilişim Ltd.Şti.’nin Ürünüdür. KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.

Check these out next

PCR

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Apresentações para você(18)

Similar a PCR(20)

Último(20)

PCR