PCR

Polimeraz Zincir Reaksiyonu
The Polymerase Chain Reaction
PH.DR.BIOCHEM.
E.Çiğdem Sidar LeadAuditor(QMS)
GB-Lab. Company Trainer
2014

3
KariyerBenim Eğitim & Bilişim & Danışmanlık Ltd.Şti.
Facebook
www.facebook.com/kariyerbenim
Twitter
#BugünKariyerBenim
E-Mail
info@kariyerbenim.com
Eğitim sonrası görüş ve önerilerinizi sosyal medya
iletişim yollarıyla bizlere gönderebilirsiniz.

4
4
Eğitimden Önce ;

5
TANIŞMA
ADINIZ
SOYADINIZ
PCR
BİLGİNİZ ?
EĞİTİMDEN
BEKLENTİNİZ ?

6
BÖLÜM-1
TANIMLAR

7
TANIMLAR
Hücre : Canlının canlılık
özelliklerini taşıyan yapı ve
görev bakımından en
küçük parçasıdır.

8
TANIMLAR
KALITIM : Bir bireyin kendi ata dölüne benzeme eğilimine soyaçekim
(kalıtım) denir.
GENETİK : Anne, baba ve yavru arasındaki benzerlik ve farklılıkları
neden ile bu özelliklerin nesilden nesile geçişini inceleyen bilim
dalıdır.
GEN : Ebeveynden çocuklarına geçen belirli bir karakteristiği taşıyan
biyolojik birimdir. Genler birtakım emirlerle hareket ederek
büyümemizi ve vücudumuzun çalışma biçimini belirler. Göz rengi, kan
grubu veya boy gibi çoğu özelliğimizden genler sorumludur. Genler
kromozomların üzerinde yer alırlar. Bir kromozomun belirli bir kısmını
oluşturan nükleotid dizisidir.

9
TANIMLAR
ENZİM (ENZYME) : Biyokimyasal bir reaksiyonu katalizleyen protein. Enzimler, özgüllükten sorumlu bir
protein kısmından (apoenzim) ve aktivite için gerekli, protein olmayan bir kısımdan (koenzim) oluşur. Bir
enzim ile katalizlenen kimyasal reaksiyonların çoğu altı ana gruptan birine dahildir :
1. Hidrolazlar ile Hidroliz (H2O ekleyerek kesme işlemi),
2. Transferazlar ile, bir molekül grubunun verici molekülden alıcıya transferi,
3. Oksidaz ve Redüktazlar ile, oksidasyon ve redüksiyon (oksitlenecek bir molekülden bir ya da daha
çok elektronun veya hidrojen atomunun redüklenecek olan diğer bir moleküle aktarılması),
4. İzomerazlar ile, izomerine dönüştürme (bir atomun ya da işlevsel grubun bir molekül içerisindeki
konumunun değiştirilmesi,
5. Ligazlar (sentetazlar) ile, iki sübstrat molekülün başka bir molekül oluşturmak üzere birleştirilmesi,
6. Liyazlar ile, bir molekülün oluşacak moleküllerden birinde ya da her ikisinde çift bağ oluşturularak,
nonhidrolitik bir tepkime ile açılması.

10
TANIMLAR
GEN AMPLİFİKASYONU: Diğer genlerde orantılı bir artış olmaksızın, seçici olarak belli bir genin çok sayıda
kopyasının yapılması.
GENETİK MARKER: Allellerin atasal kökenini belirlemek için kullanılabilen, polimorfik genetik özellik.
GENOTİP: Bir bireyin ya da bir hücrenin genetik içeriğinin tamamı ya da bir kısmı.
FENOTİP: Bir hücre ya da bireydeki bir ya da daha fazla genin gözlenebilir etkisi.
ALLEL (ALLELMORF): Bir genin, belirli bir gen bölgesinde bulunan alternatif formlarının herbiri.
ANNEALİNG: Komplementer nükleik asit ipliklerinin eşleşerek ( DNA ile DNA, RNA ile RNA veya DNA ile
RNA ) çift iplikli molekül oluşturmaları.
AMPLİFİKASYON: Bir DNA dizisinin ayrı kopyalarının yapılmasıdır.

11
TANIMLAR
GENOMİK (IMPRINTING) : Atasal kökene bağlı olarak, bir kromozom bölgesinin ya da bir allelin farklı
ekspresyonu.
HİBRİDİZASYON : Bitki ve hayvanlarda, aynı türden farklı genotipe sahip bireylerin çaprazlanmasıdır.Terim
genellikle daha dar anlamda kullanılır : Komplementer iki DNA tek ipliğinin birleştirilmesi ( DNA / DNA
hibridizasyonu), komplementer DNA ve RNA ipliklerinin birleştirilmesi ( DNA / RNA hibridizasyonu ), farklı
türden kültür hücrelerinin invitro ortamda birleştirilmesi (hücre hibridizasyonu) gibi.

12
TANIMLAR
İNDÜKLEYİCİ : Bir genin ekspresyonunu uyaran molekül.
KONTİG : Çakışan DNA fragmanları serisi (contiguous sequences = bitişik diziler)
KROMATİN : İnterfaz nükleusunda görülen boyanmış madde. DNA, bazik kromozomal proteinler
(histonlar), histon –olmayan kromozomal proteinler ve az miktarda RNA dan ibarettir.
CROSS-OVER : 1. Mayozun diploten evresinde kiyazma oluşumu ile,homolog kromozomlar arasında
genetik bilgi değiştokuşu; komşu gen lokuslarının (bağlı) genetik rekombinasyonu ile sonuçlanır. Somatik
hücrelerde mitoz sırasında da oluşabilir. Eşit olmayan cross-over, rekombinasyon bölgesinde homolog
DNA bölgelerinin yanlış eşleşmesinden kaynaklanır. Bu durum, yapısal olarak değişmiş, birinde
duplikasyon diğerinde delesyon oluşmuş DNA segmentleri ya da kromozomlarla sonuçlanır.

13
TANIMLAR
BAZ ÇİFTİ (bp): DNA’ da, biri pürin ve diğeri pirimidin olmak üzere karşılıklı gelerek hidrojen bağları ile
bağlanmış iki baz. Bir DNA çift sarmalında normal baz çiftleri, A ile T ve C ile G dir. RNA ‘da başka çiftler de
oluşabilir.
cDNA: RNA kalıp üzerinden revers transkriptaz enzimi aracılığıyla sentezlenen komplementer DNA.
EKSPRESYON: Aktif bir genin görülen etkisi.
EKSPRESİTİVE: Bir genin ya da genotipin fenotipe yansıma derecesini tanımlar. Ekspresivitenin olmayışı
nonpenetrans olarak adlandırılır.
ELEKTROFOREZ : Moleküllerin, elektriksel alanda göç hızlarının farklılığından yararlanılarak ayrılmaları.
Destekleyici ortam olarak, nişasta, agaroz,akrilamid gibi jel yapılı maddeler kullanılır. Daha detaylı
moleküler değişiklikler, iki yönlü elektroforez veya izoelektrik noktada hareketin durdurulması (izoelektrik
odaklama) gibi modifikasyonlarla saptanabilir. (Agaroz Jel, Poliakrilamid Jel, Değişken alanlı jel (PFGE),
kapiller elektroforez türleri bulunmaktadır.

14
TANIMLAR
LİGAND: Bir reseptöre bağlanarak hücre içinde sinyal başlatan bir molekül,
Örnek : hormon.
MAYOZ: Germ hücresi çekirdeğinde gözlenen özel bir bölünme biçimidir, kromozom sayısını diploidden
haploide indirger. İlk mayotik bölünmenin profazı özellikle önemlidir ve şu evrelerden oluşur. Leptoten,
Zigoten, Pakiten, Diploten, Diyakinez.
MEGABAZ (MB): Bir milyon baz çifti.
MENDELYAN KALITIM : Mendel yasalarına uygun olan kalıtımdır. Karşıt olarak, sitoplazmik kalıtım
faktörlerinin (mitokondriyal DNA) denetlediği ekstrakromozomal kalıtımdan söz edilebilir.
MİTOZ : Somatik hücre bölünmesi sırasında, profaz, metafaz, anafaz ve telofaz evrelerini kapsayan
çekirdek bölünmesi.

15
TANIMLAR

16
Mayozda da mitozda olduğu gibi profaz, metafaz, anafaz ve telofaz olarak adlandırılan dört evre vardır. Bu
evreler arada interfaz olmaksızın peş peşe iki kez gerçekleşir ve sonuçta genetik özellikler bakımından 2
çeşit dört yavru hücre meydana gelir.
Mayoz bölünme ile mitoz bölünme arasındaki en büyük farka profazda rastlanır. Mayoz bölünme iki
aşamada gerçekleşir. Bu aşamalar, Mayoz-1 ve Mayoz-2 olarak adlandırılır.
Profaz I DNA ipliklerinin kısalıp kalınlaşmaya başlaması ile başlar. Bu evre sınırları kesin olmayan 5 evreye
ayrılıp incelenir.
Bu evreler;
Leptoten: Kromozomların mikroskopla seçilebildikleri andan itibaren başlar. İki eş kromatit birbirine sarılı
halde bulunur. Ayrıca kromatinler üzerinde kromomer denilen ve koyu boyanan bölgeler fark edilir.

17
Zigoten: Biri anneden diğeri babadan gelen ve birbirlerine benzeyen homolog kromozomlar yan yana
gelerek eşleşmeye başlarlar. Bu eşleşme bir uçtan diğer uca doğru devam eder. Bu evrede her biri iki
kromatit taşıyan iki kromozomun yan yana durmasıyla sanki canlı n sayıda kromozom taşıyormuş gibi
görülür. Görülen bu yapıya tetrat denir.
Pakiten: Homolog kromozomların eşleşmesi tamamlanır ancak kromozomlar kısalmaya devam eder.
Ayrıca bu evrede mitozdan farklı olarak tetratlar arasında genetik madde alışverişi olur. Buna crossing-over
denir. Bu olay homolog kromozomların birbiri üzerine çakışan (kiyazma "chiasma") kısmında
gerçekleşir.
Diploten: Kromozomların sentromerleri ayrılmamıştır. Dört kromatit için iki sentromer vardır. Tetrat'taki
homolog kromozomlar birbirinden ayrılmaya başlar. Ancak kiyazma bölgelerinde ayrılma olmaz ve
kiyazmalar uca doğru kaymaya başlar.
Diakinez: Kromozomlar son halini alır. Çekirdekçik kaybolur. Çekirdek zarı parçalanır.

18

19
NORTHERN BLOT : RNA moleküllerinin bir membrana transferi.
ÖKARYOT: Prokaryotların aksine,kromozom içeren bir çekirdeğe sahip olan ve mitoz ve mayozla bölünen
hücrelere sahip hayvan ve bitkilerdir.
POLİMERAZLAR: DNA ve RNA oluşturmak üzere (replikasyon veya transkripsiyon) nükleotid birleşimini
katalizleyen enzimler.
REKOMBİNANT DNA: Farklı kökenli bölümlere sahip bir DNA molekülü.
REKOMBİNASYON: Mayoz sırasında homolog kromozomlar arasında kros-over sonucu yeni gen
bileşimlerinin oluşması.
RENATÜRASYON DNA: Komplementer DNA tek ipliklerinin çift sarmal DNA oluşturmak üzere
birleştirilmesi .

20
RESEPTÖR : Bir hücre sinyalinin iletilmesi ile görevli transmembran veya sitoplazmik protein molekülü.
TRANSDÜKSİYON : Bir hücreden (bakteri) diğerine özelleşmiş viruslarla(bakteriyofaj) gen taşınması.
TRANSFEKSİYON : Saf DNA ‘nın canlı bir hücreye sokulması.
TRANSFORMASYON : Bu terim biyolojide birkaç farklı anlam taşır. Genetikte üç tip transformasyon
tanımlanmıştır.
1) Malign transformasyon; proliferasyon kontrolünün kaybolması ile normal hücrenin malign durma
geçmesi,
2) Genetik transformasyon; genetik bilgi aktarımı yoluyla bir hücrenin genetik niteliğinin değişmesi,
3) Blastik transformasyon; lenfositlerin mitojenik maddelere (örn : fitohemagglutinin veya özgül antijen)
tepkisi ile hücre bölünmesinin başlaması.

21
TRANSKRİPSİYON : DNA ‘ da taşınan bilginin yayınlanmasında ilk adım olarak mesajcı RNA (mRNA) nın
sentezi.
TRANSKRİPT : Aktif bir genin DNA’sının bir bölümünün RNA kopyası.
TRANSLASYON : Genetik bilginin yayımlanmasında ikinci aşama. Bu aşamada, mRNA’daki triplet dizini,
gen ürünü olan polipeptidi oluşturacak aminoasit dizinine çevrilir.
TRANSLOKASYON : Bir kromozomun tamamını veya parçalarının diğer bir kromozoma aktarılmasıdır.
Homolog olmayan parçaların değişmesiyle sonuçlanan resiprokal translokasyon yaygındır. İki akrosentrik
kromozom arasında, kısa kolların kaybı ve sentromerlerden birleşme ile oluşan translokasyon, füzyon tipi
translokasyondur. (Robertsonyan translokasyon).

22
WESTERN BLOT (IMMÜN BLOT) : Protein antijenlerin tanımlanmasında kullanılan bir teknik.
REPLİKASYON : DNA’nın kendisini eşlemesi.
MUTASYON : Genetik materyaldeki kalıcı değişiklik. Bir gen içerisinde baz çiftlerinin katılması (insersiyon),
kaybı ya da değişmesi şeklinde nokta mutasyonu olarak veya kromozom yapısındaki değişmeler şeklinde
kromozomal mutasyon olarak farklı tipte görülebilir. Yanlış anlamlı (missen) mutasyon, gen ürününde
yanlış amino asidin bağlanmasına neden olan bir değişikliktir. Anlamsız (nonsens) mutasyon, bir genetik
mesajın ortasında dur kodonu oluşturarak tümüyle işlevsiz bir gen ürünü çıkmasına neden olan bir
değişikliktir.
GEN LOKUSU : Bir genin bir kromozom üzerindeki konumu.

23
FOSFODİESTER BAĞI : DNA ya da RNA ‘da bitişik nükleotidleri bağlayan kimyasal bağ.
DUPLİKASYON : Hatalı kros-over sonucunda bir kromozom segmentinin fazladan eklenmesi. fazladan
eklenmiş DNA nükleotid baz çiftleri anlamına da gelir. Genlerin duplikasyonu ökaryotların evriminde
önemli rol oynar.
DUR KODONU (SONLANMA-TERMİNASYON-KODONU): Translasyonun sonunu belirleyen üç tripletten
(UAG,UAA,UGA) biri.
STS (SEKANS ETİKETLİ BÖLGE) : Bilinen dizideki, kısa DNA bölgesi.
TELOMER: Bir kromozomun her iki ucunda, özel konsensüs diziler içeren uç bölgeler.

24
DENATÜRASYON : Protein veya nükleik asitlerin doğal yapısında mevcut olan sekonder, tersiyer ve
kuaterner yapılarının bazı fiziksel (yüksek sıcaklık, radyasyon) ve kimyasal (kuvvetli asit veya baz, organik
çözücüler (alkol, kloroform vb.), yoğun inorganik tuz çözeltisi) dış etkilerle bozularak primer yapılarına
dönüşmeleri sürecidir. Canlı bir hücredeki proteinlerin denatüre olması, hücresel aktivitelerde bozulma ve
belki de hücrenin ölümüyle sonuçlanır.
Yumurtanın sahanda pişirilmesi sonucunda yumurtanın ısı etkisiyle katılaşması ve beyaza dönmesi
denatürasyona bir örnektir. Kaynamış sütün üzerinde oluşan kaymak da bir denatürasyon olayıdır.
Yumurta akının denatürasyonunun geri dönüşümsüz olmasına rağmen diğer birçok denatürasyon olayı
geri dönüşümlüdür.
NÜKLEİK ASİT DENATÜRASYONU : DNA gibi nükleik asitlerin denatürasyonu, yüksek sıcaklıkta iki
zincir arasındaki hidrojen bağlarının koparak çift zincirli yapının iki tane tek zincire dönüşmesiyle oluşur.
Bu durum, polimeraz zincir tepkimesi (PCR) esnasında ortaya çıkabilir.

25
Tavlama esnasında sıcaklığın yavaş yavaş düşürülmesi birbirini tamamlayıcı zincirler arasında baz çiftinin
doğru bir şekilde oluşmasını sağlar. Sıcaklığın ani bir şekilde düşürülmesiyse primerin hatalı DNA dizileriyle
hibritleşmesine yol açar.
GENOM : Bir kalıtım birimidir. Bir organizmanın kalıtım materyalinde bulunan genetik şifrelerin tamamını
simgeler. Canlıların en temel birimi olan hücrede fizikokimyasal özelliklerin ortaya çıkarılmasında
kullanılan genetik talimatların hepsine de genom denilebilir. Her canlının hücrelerinin içine yerleştirilmiş
genetik program, o canlının "genom"unu oluşturur.
HİDROJEN BAĞI : Bir molekülde oksijen, azot veya flor gibi elektronegatif bir atoma bağlı hidrojenin
kısmi artı yükle yüklenmesi sonucu, başka veya aynı moleküldeki elektonegatif atom ile yaptığı kuvvetli
bağdır.
Van der waals kuvvetinden güçlü olmasına karşın, tipik hidrojen bağı iyonik bağ ve kovalent bağdan daha
güçsüzdür. Proteinler ve nükleik asitler gibi makromoleküller içinde, aynı molekülün iki parçası arasında
var olabilir.

26
NÜKLEOTİT : Bir fosfat,beş karbonlu bir şeker (deoksiriboz) ve bir azotlu organik bazdan oluşan bir
kimyasal bileşiktir.En yaygın nükleotitler nükleik asitlerin yapı taşlarıdır.Ayrıca koenzim A, flavin adenin
dinükleotit, flavin mononükleotit,adenozin trifosfat ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat gibi
koenzimler de nükleotittir. Koenzimlerin hücre metabolizması ve sinyal iletiminde önemli rolleri vardır.
Nükleotitlerin baz kısmı olan nükleobazlar pürinler ve pirimidinler olarak ikiye ayrılır.Adenin ve guanin
birer pürin,sitozin,timin ve urasil ise birer pirimidindir. Nükleotitlerin pentoz kısmı riboz veya deoksiriboz
dur.Şeker kısmı deoksiriboz ise nükleotidin adının başına deoksi eklenir. Nükleotidin fosfatsız kısmına
nükleozit denir. Nükleozit kısmına bir, iki veya üç fosfat grubu eklenebilir ve bunlara sırasıyla nükleotit
monofosfat, difosfat ve trifosfat denir.

27

28
Ürünlerine büyük gereksinim duyulan, (özellikle işlevsel enzim üretenler) bazı genlerin seçilerek
çoğaltılmasına ilişkin düzenek, ilk defa Pavan tarafından tahmin edilmiş, fakat başlangıçta kimsenin
dikkatini çekmemiştir. Klasik gen tanımında, her genin belirli bir işlevi yönettiği bilinmektedir.
Bu varsayım, mRNA üreten yapısal genlerin birçoğu için geçerlidir. Fakat doğrudan doğruya yapısal özellik
saptamayan bazı genler için de gen çoğaltılması görülür. Bu genler, özellikle kromozomların
heterokromatin ve çekirdekçik organizatör bölgelerinde toplanmıştır.

29
Kromozom şeması: (1) Kromatid. Kromozomun S fazından sonraki iki eşit
parçasından her biri. (2) Sentromer. Kromatidlerin temas ettiği ve
mikrotübüllerin bağlandığı yer. (3) Kısa parça (4) Uzun parça. NOT: Genetikte
kromozomlar, genellikle kısa bacaklar üstte olacak şekilde gösterilir.

30
Ürünlerine büyük gereksinim duyulan, (özellikle işlevsel enzim üretenler) bazı genlerin seçilerek
çoğaltılmasına ilişkin düzenek, ilk defa Pavan tarafından tahmin edilmiş, fakat başlangıçta kimsenin
dikkatini çekmemiştir. Klasik gen tanımında, her genin belirli bir işlevi yönettiği bilinmektedir.
Bu varsayım, mRNA üreten yapısal genlerin birçoğu için geçerlidir. Fakat doğrudan doğruya yapısal özellik
saptamayan bazı genler için de gen çoğaltılması görülür. Bu genler, özellikle kromozomların
heterokromatin ve çekirdekçik organizatör bölgelerinde toplanmıştır.

31
BÖLÜM-2
DNA

32
DNA
1-) DNA NEDİR VE NEREDE BULUNUR ?
DNA "Deoksi Ribo Nükleik Asit" isimli bir tür molekül grubunun kısaltılmış ismidir DNA'nın çift zincirli ip
merdivene benzer Çift zincirli yapıdaki DNA zinciri oldukça uzun bir zincirdir Bu zincir hücre içindeki özel
enzimler ve Proteinler aracılığı ile paketlenir. Nasıl ki uzun bir ipi makaraya düzenli bir şekilde sarıyorsanız,
hücrede buna benzer bir mekanizma ile DNA yı paketleyerek çekirdeğinin (Nukleus) içine yerleştirir DNA
her hücrede bulunur. Örneğin böbreklerinizin hücrelerinde karaciğerinizin hücrelerinde, kemik
hücrelerinizde kısacası vücudunuzdaki her hücrede DNA molekülü mevcuttur.
2-) DNA’NIN KEŞFİ:
MIESCHER 1869 yıllarında ilk olarak Miescher tarafından hücre çekirdeğinde özel bir Madde bulundu ve
buna Miescher Nüklein adını verdi Daha sonra ise nükleit asitlerin iki tipte olduğu anlaşıldı . Birincisi
timüsten elde edilen timonükleik asit ikincisi bira mayalarından elde edilen zimonükleik asit Timonükleik
asit hayvanlar alemine zimonükleik asit ise bitkiler alemine özgü sayıldı.

33
FEULGEN – ROSSENBECK 1924 yıllarında ise Feulgen ve Rossenbeck timonükleik asidin çok duyarlı bir
tepkimesini tanımladılar böylece her iki nükleik asidin her iki canlılar aleminde bulunduğu ispat edilebildi.
ondan sonra timonükleik asit çekirdeğe , zimonükleik asit ise sitoplazmaya ait özgü yapı maddeleri sayıldı.
LEVENE – MORİ 1929 yılında Levene ve Mori tarafından timonükleik asidin DNA zimonükleik asidin ise
RNA Olduğu anlaşıldı.
WATSON – CRICK 1953 yılında Watson ve Crick DNA molekülünün kendine has özelliklere sahip bir çift
sarmal yapı halinde bulunduğunu ileri sürdüler. Bu araştırıcıların önerdikleri DNA yapısı o tarihlerde başka
araştırıcılar tarafından ortaya konulan DNA ya ilişkin önemli bulgulara dayanmaktadır. Bunlardan biri,
Wilkins ve Franklin tarafından, izole edilmiş DNA fibrillerinin X-ray ışınlarını kırma özelliklerinin
açıklanmasıdır. Elde edilen X ışını fotoğrafları, DNA nın zincirlerindeki bazların diziliş sırasına bağlı
olmaksızın, çok düzenli biçimde dönümler yapan bir molekül olduğunu göstermektedir.

34
Ayrıca TMV (Tütün Mozaik Virüsü) üzerinde yapılan çalışmalar da DNA ile ilgili çalışmalarda ışık tutmuştur.
İşte Watson ve Crick bu bulguları değerlendirerek böyle özelliklere sahip DNA makro molekülünün
sekonder yapısına ait bir model geliştirdiler. Bu modele göre, bir çok sorunun açıklanması
yapılabildiğinden dolayı 1962 yılında bu iki bilim adamına NOBEL ÖDÜLÜ verildi.
Bir başka önemli bulguda Chargaff tarafından saptanmıştır Herhangi bir türe ait DNA nın nükleotidlerine
parçalandığında serbest kalan nukleotidlerde adenin miktarının timine, guanin miktarının da sitozine
daima eşit olduğunun saptanmasıdır Yani Chargaff kuralı‘na göre doğal DNA moleküllerinde adeninin
timine veya guaninin sitozine oranı daima 1’e eşittir (A/T=1 ve G/C=1).
3-) DNA’NIN ŞEKLİ VE YAPISI
DNA molekülü, heliks (sarmal) şeklinde kıvrılmış, iki kollu merdiven şeklindedir. Kollarını, yani merdivenin
kenarlarını, şeker (deoksiriboz) ve fosfat molekülleri meydana getirir. Deoksiriboz ile fosfat grupları ester
bağlarıyla birbirlerine bağlanmıştır.

35
İki kolun arasındaki merdiven basamaklarında gelişigüzel bir sıralanma yoktur her zaman Guanin (G)
Sitozin’in (C ya da S) Adenin (A) Timin’in (T) karşısına gelir
Hem pürin (yani adenin ve guanin) ile pirimidin (yani sitozin ile timin) arasındaki hidrojen bağları, hemde
diğer bağlar, meydana gelen heliksin düzgün olmasını sağlar. Pürin ve pirimidin bazları, yandaki şekerlere
(Riboz), glikozidik bağlarla bağlanmıştır. Baz, şeker ve fosfat kombinasyonu, çekirdek asitlerinin temel
birimleri olan nükleotidleri meydana getirmiştir. Dört çeşit nükleotid vardır. Bunlar taşıdıkları bazlara göre
isimlendirilirler (Adenin, Guanin, Sitozin,Timin)
NÜKLEOZİT
AZOTLU ORGANİK BAZ + DEOKSİRİBOZ ŞEKERİ + FOSFORİK ASİT
NÜKLEOTİT
Nükleotidler birbirlerine fosfat bağlarıyla bağlanarak, şeker ve fosfat kısımlarının birbirlerini izlediği
serilerden oluşan bir omurgaya sahip uzun ve dallanmış polinükleotid zincirlerini meydana getirmiştir.
Kovalent ester bağları veya fosfodiester bağları olarak da bilinen bu bağlar son derece kuvvetlidir.

36
Fosfodiester bağlarının varlığı DNA molekülünün tek zincirli yapı halinde iken bile dayanıklı ve stabil
yapıda olmasını sağlar. genetik mühendisliğinin hedeflerinden biri olan klonlama çalışmaları, doğal yolla
gerçekleşmesi mümkün olmayan kovalent bağ kırılmalarını gerçekleştirerek yeni türler oluşturma
çabalarını arar.
Hidrojen bağları daima bir pürin(A,G) ile bir pirimidin (T,C) bazı arasından meydana gelir. A-T baz çiftinde 2
hidrojen bağı, G-C baz çiftleri arasında ise 3 hidrojen bağı bulunmaktadır. Hidrojen bağlarının özelleşmesi;
anahtar kilit modelinini andıran, uygun nukleotid moleküllerinin karşılıklı gelerek birbirlerine yine uygun
sayıda hidrojen bağları ile bağlanmasını sağlar. Böylece zincirin bir kolunda bulunan nukleotidlerin
dizilişi,karşı kolda bulunan nukleotidlerin dizilişini bir çeşit dikte ve kontrol eder. Tesadüfe bırakmayan bir
titizlikle molekül yapısı oluşturulur ve kontrol edilir.
DNA molekülünün en önemli özellik iki polinükleotid zincirin birbirinin tamamlayıcısı olmasıdır.

37
Pozitif (+) ve negatif (–) iki polinukleotid zincirlerinin tamamlayıcılık özelliği,genetik materyalin işlevlerini
doğru biçimde nasıl yapabildiğinin açıklanması açısından DNA’nın en önemli temel özelliklerinin başında
gelir.
DNA bir organizmanın oluşuma ilişkin bilgileri taşır DNA molekülleri, hücre çekirdeğinde bulunurlar ve
vücudumuzda bulunan tüm proteinleri oluşumu sırasındaki kodlamış bilgileri içerir.DNA’nın protein yapma
işlemi ,inanılmayacak derecede kusursuzdur .

38

39

40
Pozitif (+) ve negatif (–) iki polinukleotid zincirlerinin tamamlayıcılık özelliği,genetik materyalin işlevlerini
doğru biçimde nasıl yapabildiğinin açıklanması açısından DNA’nın en önemli temel özelliklerinin başında
gelir.
DNA bir organizmanın oluşuma ilişkin bilgileri taşır DNA molekülleri, hücre çekirdeğinde bulunurlar ve
vücudumuzda bulunan tüm proteinleri oluşumu sırasındaki kodlamış bilgileri içerir.DNA’nın protein yapma
işlemi ,inanılmayacak derecede kusursuzdur .

41
BÖLÜM-3
TARİHÇE

42
 1865'te doğa bilimlerine tutkun Avusturyalı keşiş Gregor Mendel manastırının avlusundaki bahçede 7
özellik (tanenin biçimi ve rengi, kabuğunun rengi vs.) gösteren yenilebilir bezelyeler üzerinde
çalışmaya karar verdi. Deneylerinden yola çıkarak, yazdığı “Bitki melezleri üzerinde denemeler” adlı
makalesinde, bazı kalıtımsal özelliklerin aktarılma yasalarını açıkladı. Bu makaleyi dünyanın dört bir
tarafındaki bilim adamlarına yolladı; tepkiler olumlu olmamakla birlikte yumuşaktı. Makalesinde ileri
sürdükleri ancak 1900'lerin başında farklı bilim adamlarınca da yeniden keşfedildikten sonra kabul
edildi.
 1869'da DNA İsviçreli hekim Friedrich Miescher tarafından yalıtılabildi. İrinde fosfat halindeki zengin
bir cevheri yalıttı. Bu cevhere “çekirdek özü” anlamında "nüklein" adını verdi. Nükleinin tüm
hücrelerde, somon balığı sperminde bile mevcut olduğunu buldu.
 1879'da Walther Flemming ilk kez bir mitozu tanımladı. Gerçi mitoz, kendisinden 40 yıl önce Carl
Nageli tarafından keşfedilmişti ama, Nageli mitozu anormal bir doğa olayı olarak değerlendirmişti.
Walther Flemming hücrenin bölünmesini tanımlarken profaz, metafaz ve anafaz terimlerini ortaya
attı. Çalışması 1882’de yayımlandı.

43
 1880'de Oskar Hertwig ve Eduard Strasburger döllenmedeki temel öğenin spermatozoit (İng.
spermatozoon) denilen sperm hücreleri ile yumurta hücresinin birleşmesi olduğunu keşfetti.
 1891'de Theodor Boveri kromozomların yaşamın vazgeçilmez unsurları olduğunu gösterdi.
• 1900'de kalıtım yasaları keşfedildi; Hugo de Vries, Carl Correns ve
Erich von Tschermak-Seysenegg birbirlerinden ayrı olarak, “Mendel
yasaları”nı keşfettiler.
 1902'de Walter Sutton ilk defa, kalıtım hakkındaki kromozom kuramına, yani genleri taşıyan
unsurların kromozomlar olduklarına işaret eden bir mayoz bölünmeyi gözlemledi. Kromozomların
ayrılma modelinin Mendel’in varsayımını tümüyle desteklediğini belirtti. Aynı yıl bu çalışmasını bir
makale yayımladı.Varsayımı Thomas Morgan’ın çalışmalarıyla kanıtlandı. Yine aynı yıl, Archibald
Garrod insanlardaki bir hastalığın kalıtım yoluyla geçen bir hastalık olduğunu tanımladı: Alkaptonüri

44
•1905'te William Bateson, kalıtımsal çeşitliliklerin artık adlandırılması gerekliliğinden söz ederek, bir
mektubunda ve bir makalesinde "genetik" terimini kullandı, genetik biliminin akademik anlamda kurucusu
ve isim babası oldu.
•1909'da Wilhelm Johannsen "gen" terimini ortaya attı ve bir varlığın “görünüm”ü (fenotip) ile geni
(genotip) arasındaki farkı ortaya koydu.
•1911'de Thomas Morgan mutasyona uğramış bir beyaz gözlü Drosophila (meyve sineği) sayesinde
mutasyonların varlığını ortaya koydu. “Genetik bağlantı”ların ve "genetik rekombinasyon"un keşfi
sayesinde genlerin taşıyıcılarının kromozomlar olduğunu ortaya koydu. Alfred Sturtevant, Hermann Muller
ve Calvin Bridges ile birlikte çalıştı. 1933’de Nobel tıp ödülü aldı. Deneyleri kalıtım hakkındaki kromozom
kuramını iyice sağlamlaştırdı.
•1913'te Morgan ve Alfred Sturtevant, genlerin kromozom boyunca birbirini izleyen dizilişini ve düzenini
gösteren, Drosophila sineğinin X kromozomuna ait ilk “genetik harita”yı yayımladılar.
•1928'de Fred Griffith Streptococcus pneumoniae türündeki bakteriler üzerinde gerçekleştirdiği deneyler
sayesinde, bakterilerin “genetik dönüşüm”ünü keşfetti.

45
Dönüşüm, iki hücre arasında "genetik enformasyon aktarımı"na olanak sağlıyordu. Bununla birlikte
buradaki “dönüştürücü ilke”nin doğasını çözebilmiş değildi.
•1941'de George Beadle ve Edward Tatum Neurospora crassa’yı inceleyerek her genin bir (özellikle bir)
enzimi kodladığı varsayımını ortaya attılar.
•1943'te DNA'nın William Astbury tarafından X ışınlarıyla kırınımı sözkonusu molekülün yapısına ilişkin ilk
varsayımın ortaya atılmasına olanak sağladı: Düzenli ve periyodik bir yapı sözkonusuydu.
•1944'te Oswald Avery, Colin MacLeod ve Maclyn McCarty DNA'nın kalıtımsal bir enformasyona ilişkin bir
molekül olup, bir hücreyi dönüştürebilir özellikte olduğunu ortaya koydular. Barbara McClintock genlerin
yer değiştirebildiğini ve genomun sanıldığından çok daha az statik olduğunu gösterdi ,1983'de Nobel tıp
ödülü aldı.
1952 de Alfred Hershey ve Martha Chase şunu keşfettiler: Enfeksiyon kapma olayında bir hücreye girmesi
gereken, yalnızca, virüsün DNA’sı idi. Çalışmaları DNA’nın genlerden oluştuğu varsayımını büyük ölçüde
güçlendirdi.

46
•1953'de Maurice Wilkins ve Rosalind Franklin'in DNA molekülünün klişesini belirleyen araştırma
çalışmalarının ardından, James Dewey Watson ve Francis Crick genetik enformasyonun DNA molekülünce
taşınabileceğini açıklayarak, DNA’nın çift sarmal biçimli modelini sundular.Watson, Crick ve Wilkins bu
keşiflerinden dolayı 1962’de Nobel Tıp Ödülü aldılar.
•1955'de Joe Hin Tjio insan kromozomlarının sayısını tam olarak saptadı: 23 çift idiler.Arthur Kornberg
DNA’nın “DNA ikileşmesi”ne olanak veren bir enzim olan DNA polimerazı keşfetti.
•1957'de “DNA ikileşmesi”nin mekanizması (işleyişi) iyice aydınlığa kavuştu.
•1958'de “Down sendromlu” denilen bir çocuğun kromozomlarının incelenmesi sırasında Jérôme Lejeune
21. kromozom çiftinde fazladan bir kromozom daha bulunduğunu keşfetti. Böylece, dünyada, zihinsel
engellilik ile kromozomlara ilişkin bir anormallik arasında bağ bulunabileceği ilk kez ortaya konmuş
oluyordu. Lejeune daha sonra, çalışma arkadaşlarıyla, kromozom kaynaklı diğer hastalıkların
mekanizmasını da keşfederek, "sitogenetik" dalının ve modern genetiğin yolunu açmış oldu.

47
•1960'lı yıllarda Fransız biyolog François Jacob ve Fransız biyokimyacı Jacques Monod “protein
biyosentezi”nin mekanizmasını aydınlığa kavuşturdular. Genetik kod ilkesi kabul edilmekteydi. Jacob ve
Monod “protein biyosentezi”ndeki sentezin düzenlenmesinin proteinlere başvurduğunu gösterdiler ve
“gen ifadesi”nde rol oynayan “DNA dizileri”nin varlığını gün ışığına çıkardılar. 1965’de genetik kodun
deşifre edilmesinden dolayı Nobel ödülü aldılar.
•1968'de "Genetik kod"un çözülmesinden dolayı Nobel Ödülü verildi.
•1975'de virüslerin işleyiş mekanizmasının keşfinden dolayı Nobel Ödülü verildi. 1975'den itibaren
"genomik" önemli ekonomik ilgilerin odağı haline geldi.
•1977'de DNA'daki nükleotit dizilişleri belirlendi.
•1983'de Kary Banks Mullis tarafından keşfedilen polimeraz zincir reaksiyonu, DNA izolasyonunu ve DNA
parçalarının istenen bölgelerinin çoğaltılmasını sağladı.
•1983'de İlk genetik hastalık haritalandı (Huntington hastalığı).
•1985'de polimeraz zincir reaksiyonunun geliştirilmesi

48
•1989 ‘da, genetik hastalıkların anlaşılması, araştırılması, taranması, önceden tahmin edilmesi ve
mümkünse tedavi edilebilmesi amacıyla, genlerin kimliklerinin tek tek saptanması için, insan
“genom”unun 3 milyarı bulan “nükleotit” çiftlerinin kodlarının çözülebilmesi konusunda bir proje
oluşturulmaya karar verildi. Bu amaçla yola çıkan, 18 ülkedeki bilimcilerden oluşan ve ABD’ndeki National
Institutes of Health tarafından düzenlenen ilk çalışma ekibi “İnsan Genom Projesi” adı altında çalışmalara
başladı. Uzun soluklu bu büyük çalışma, ister istemez iş bölümünü gerektiriyordu; örneğin Fransa 14.
kromozomun DNA dizilimini çözmekten (14. kromozomla ilgili nükleotit kodlarının çözülmesinden,
dizilişlerin saptanmasından) sorumluydu.
•1990'lı yıllarda Fransa'da genomik kaynaklı tüm enformasyonu denetlemek üzere robotlardan yararlanan
yöntemler geliştirildi.
•1992-1996 yıllarında Évry'deki (Fransa) bir Généthon laboratuarında insan genomunun ilk "genetik
harita"larıWeissenbach tarafından yayımlandı.
•1994'de genetik olarak değiştirilmiş ilk besin elde edildi: domates.
.

49
•1997'de E. coli genomu dizilendi.
•1998’de, insan genomu verilerini, Craig Venter ve Perkin Elmer tarafından kurulan, merkezi
ABD’nde bulunan Celera Genomics adlı özel şirket de, National Institutes of Health’ınkinden
farklı bir teknik kullanarak toplamaya başladı bakterilerin “genetik dönüşüm”ünü keşfetti.
•1999'da 22. kromozom dizilenmesi tamamlandı. Büyük Britanya’daki Sanger Institute
tarafından düzenlenen bir ekip, ilk kez bir insan kromozomunun tüm DNA dizilimini belirlemiş
bulunuyordu: Bu, 22. kromozomdu.
•2000 yılının Haziran ayında hem NIH - NHGRI (National Human Genome Research Institute -
"Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü"), hem de Celera Genomics insan genomunun
DNA dizilimlerinin % 99’unu “saptamış” olduğunu açıkladı. National Institutes of Health
araştırma sonuçlarıyla ilgili bir makaleyi "Doğa" adlı bir bilim gazetesinde, Celera Genomics
şirketi de araştırma sonuçlarıyla ilgili bir makaleyi “Bilim” adlı bir bilim gazetesinde yayımladı.

50
•2002 yılının Temmuz ayında Tokyo Üniversitesi’ndeki Japon araştırmacılar
Escherichia coli türündeki bir bakteri üzerinde, mevcut 4 nükleotitin (A,T,G,C) yanı
sıra, 2 nükleotiti (S ve Y) daha saptadıklarını belirttiler. İlginç nokta, bu iki yeni
nükleotitle ilgili genetik kalıtın canlı varlıkların genetik kalıtıyla hiçbir ortak yana
sahip olmamasıydı; üstelik bu araştırmacılar, onlardan doğada henüz bulunmayan,
meçhul bir protein ürettiler. Kimileri bu yeni “yaratılış”tan söz etmekten
çekinmemektedir.
•2003 yılının 14 Nisan günü, insan genomunun DNA dizilimlerinin saptanması
projesinin tamamlanmış olduğu açıklandı; DNA dizilenmesinin tamamlanmasıyla,
gen kodlayan bölgelerin tümü gün ışığına çıkarılmış oldu.

51

52
BÖLÜM-4
TEKNİKLER

53
DNA GEN KROMOZOM
AİLE BİREY GENOM
POPÜLASYON

54
MOLEKÜLER BİYOLOJİ TEKNİKLERİ
1950’lerin sonu 1960’ların başında moleküler biyologlar organizma ve hücrelerdeki moleküler
birleşiklerin yalıtılmasını, betimlenmesini ve işlemlenmesini öğrendiler. Bu birleşikler canlının
genetik bilgisinin kaynağı DNA ve çeşitli enzimlerin, proteinlerin yapısal ve fonksiyonel
özelliğinde önemli rol oynayan DNA’ya çok benzeyen hatta bazı çeşitleri DNA tek ipliğinden
sentezlenen RNA’lardır. Aşağıda ise moleküler biyologların laboratuvar ortamlarında bu
moleküller üzerindeki işlemleri yürütmek için sıkça kullandıkları tekniklerden bahsedeceğiz.
Expression Cloning (Klon protein sentezi tekniği):
Moleküler biyolojide proteinlerin fonksiyonlarının çalışılmasındaki en temel tekniklerden
biridir. Bu teknikte ilgilenilen proteini kodlayan DNA’daki gen bölgesi PCR ile çoğaltılarak
sentezleme vektörü olarak da bilinen plazmidlere kesici enzimler yardımıyla bütünleştirilir.
Plazmidler yapısında promotor denilen tetikleyici bölgelerin etkisi ile istenilen proteinin
sentezlenmesini sağlar.

55
Arzu edilen protein dışındaki proteinlerin sentezlenmemesi için ise yine plazmitlerin yapısında
bulunan antibiyotik direnç bölgeleri görev yapar.
Özel gen bölgesi eklenmiş plazmitler bakteri veya hayvan hücrelerine enjekte edilir. Plazmidler
bakteri DNA’sı ile üç yöntem ile bütünleşir: Bunlar plazmidlerin direk olarak bakteri DNA’sı ile
bütünleşmesi olan “Transformasyon”, hücreler arası etkileşimle bütünleşme olan
“konjügasyon” ve virüsleri kullanarak plazmidin bakteri DNA’sı ile bütünleşmesini sağlayan
“Transdüksiyon”dur. Plazmidleri, hayvanlar gibi ökoryatik canlıların DNA’ları bütünleştirmeye
ise “Tranfeksiyon” denilmektedir. “Kalsiyum fosfat transfeksiyonu”, “elektroporasyon”,
“mikroenjeksiyon” ve “lipozom tranfeksiyonu” olmak üzere çok farklı transfeksiyon yöntemleri
mevcuttur. Plazmitleri ökoryatik canlıların DNA’sı ile bütünleştirmek için bakteri ve virüslerde
kullanılabilinmektedir. “Agrobacterium tumefaciens” olarak bilinen bakterilerin kullanıldığı bu
işleme “Baktofeksiyon” denilmektedir. Bu plazmidler enjekte edildiği organizmanın genomu
ile birleşirlerse oturmuş transfeksiyon, birleşmezlerse geçici transfeksiyon olarak
adlandırılırlar.

56
Bu işlemler sonucunda ilgilenilen protein kodu taşıyan plazmidler enjekte edildiği
organizmanın DNA’sı ile bütünleşir ve protein sentezi sürecinde kendi proteinlerini de
sentezler. Plazmidlerde bulunan promotor (tetikleyici) bölgeler sayesinde etrafa kimyasallar
sinyaller yayılır ve plazmidlerin proteinleri daha yüksek seviyede sentezlenmiş olunur. Yeteri
miktar ilgilenilen protein sentezlendikten sonra bunlar bakteri veya hayvan hücrelerinden
yalıtılır. Sonrasında elde edilen bu proteinleri fonksiyonel özellikleri, ilaç sanayisindeki etkileri
yanı sıra yeni ilaçların proteine verebileceği muhtemel zararları da gözlemlenmiş olunur.

57
BÖLÜM-5
PCR

58
58
Polimeraz zincir reaksiyonu DNA’nın kopyalanması ve
çoğaltılması için kullanılan son derece etkili ve yaygın
bir tekniktir. Özetle PCR ile tek DNA dizisi milyonlarca
kez çoğaltılabilindiği gibi DNA üzerindeki bir bölgenin
veya mutasyona uğramış bir genin belirlenmesinde
de yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.

59
59
PCR ayrıca herhangi bir DNA parçasının cDNA
kütüphanesinde olup olmadığı belirlemekte de
kullanılmaktadır. PCR’ın birçok çeşidi mevcuttur.
Örneğin, RNA’nın çoğaltılmasını ters yazılım
gerçekleştirerek sağlayan RT-PCR, DNA ve RNA
moleküllerinin sayısına aynı anda ulaşmanızı sağlayan
real-time PCR (QPCR) bazılarıdır.

60
60
PCR ayrıca herhangi bir DNA parçasının cDNA
kütüphanesinde olup olmadığı belirlemekte de
kullanılmaktadır. PCR’ın birçok çeşidi mevcuttur.
Örneğin, RNA’nın çoğaltılmasını ters yazılım
gerçekleştirerek sağlayan RT-PCR, DNA ve RNA
moleküllerinin sayısına aynı anda ulaşmanızı sağlayan
real-time PCR (QPCR) bazılarıdır.

61
61
Jel Elektroforezi:
Jel elektroforezimoleküler biyolojinin temel ve
başlıca tekniğidir. Temel olarak DNA, RNA veya
Proteinleri bir elektrik alan içerisinde ayrıştırılmasıdır.
Agoroz jel elektroforezinde DNA veya RNA’lar
boyutlarının farklılığına göre elektrik alan içerisinde
ayrılırlar.

62
62
Daha büyük boyuttaki DNA veya RNA parçaları işlem sonunda jelde geride kalırken
küçük boyutlu parçacıklar ise başlangıç noktasına göre daha fazla yer değiştirmiş
olacaklardır. Proteinler ise elektrik şarjlarına göre “SDS-PAGE” jel denilen sistem
üzerinde büyüklüklerine göre ayrıştırılırlar. Bu işlem 2D elektroforezi olarak da
bilinmektedir.
Macromolecule Blotting and Probing (Makromolekül Eleme ve
Sondalama):
“Northen”, “Western” ve “Eastern” blotlama terimleri aslında Edwin Southern’in
elenmiş DNA’daki hibirdazyonları tespit etmek için bulduğu “Southern Blotting” den
türetilmiş bir moleküler biyoloji esprisidir. Patricia Thomas, “Northen Blotting” olarak
adlandırılan RNA blotlama sistemlerini geliştirirken aslında hiçbir zaman Northen
Blotting ismini de kullanmamıştır. Tüm bu terimlerden daha sonra farklı tekniklerde
geliştirilmiştir. Örneğin, protein-DNA hibridizasyonunu inceleyen “Southwestern”,
protein- RNA etkileşimini inceleyen “northwesterns” ve protein- protein etkileşimini
inceleyen “farwesterns”. Tüm bu tekniklere ve terimlere moleküler biyoloji
literatürlerinde karşılaşabilirsiniz.

63
63
Southern Blotting (Southern Blot):
Edwin Southern tarafından geliştirilen bu teknik DNA’daki özel gen
bölgelerin direk olarak incelenmesinde kullanılmaktadır.
Restriksiyon enzimleri ile müdahele edilmiş DNA parçacıkları jel
elektroforezler ile ayrıştırıldıktan sonra kılcal hareketlerin
gerçekleştirileceği özel blotlama yüzeylerine transfer edilirler.
Sonrasında bu parçacıkların işaretlenmiş tamamlayıcı DNA
parçacıkları ile bütünleştirilmesi sağlanır. Tamamlayıcı DNA
parçacıkları genel olarak radyoaktif ışıma yapılanlardan seçilir ama
son zamanlarda radyoaktif olmayan parçacıklarda
kullanılabilinmektedir. Sonuçta bu ışımalar gözlemlenerek özel gen
bölgeleri hakkında bilgiler toplanılır. Fakat PCR tekniklerindeki hızlı
gelişmeler sayesinde Southern Blot tekniği laboratuarda çok sık
kullanılmamakla beraber yinede gen nakavt ve embriyonik kök
hücre hatlarının incelenmelerinde kullanılmaktadır.
.

64
64
Northen Blotting (Northen Blot):
Northen Blot farklı RNA örneklerindeki özellikli RNA ekspresyonu
desenlerinin çalışılmasında kullanılmaktadır. RNA denatürasyonun
sağlandığı jel elektoroforez tekniği ile bağlantılı çalışmaktadır

65
65
Diğer blotlama sistemlerinde olduğu gibi jel elektroforez ile
boyutsal ayrışımı tamamlanmış RNA’ların özel bir blotlama yüzeyine
transfer edilir ve gözlenmek istenilen RNA dizisi bu yüzeyde
işaretlenir. Farklı işaretleme sistemleri mevcut olmak ile beraber
genel olarak işaretlemeler RNA dizilerinin büyüklüklerini
göstermektedir. Blotlama yüzeyinde belli bölgelerdeki yoğun yapı
ilgilenen RNA dizisinin örnekte hangi yoğunlukta olduğunu gösterir.
İlgilenilen RNA dizisinin bulunduğu bandın koyuluğu örneğinizden
ne yoğunlukla o bölgenin ifade edildiğini de gösterir. Bu işlem genel
olarak farklı RNA örneklerin ne miktarda ortamda ifade edildiğine
bakılarak gen ekspresyonları hakkında bilgi elde edilebilmesi için
kullanılır. Canlı organizmalarda hangi koşullarda ve zamanda gen
ekspresyonlarının olduğunu belirlemek için kullanılan temel
tekniklerden biridir.

66
66
Western Blotting (Western Blot):
Antikorlar çok az miktarda proteinin fare, tavşan, koyun (polyklonal
antikorlar) veya hücre kültürlerine (monoklonal antikorlar) enjekte
edilmesi sonucu hücreler tarafından üretilen biyolojik moleküllerdir.

67
67
Antikorlar moleküler biyolojide birçok teknik ve analizde etkili bir şekilde
kullanılmaktadır.
Western Blotta, proteinler öncelikli olarak SDS (sodiumdodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis) jelinde büyüklüklerine göre ayrılırlar. Bu
proteinler daha sonra PVDF, nitrocellulose, naylon veya diğer destekleyici
yüzeylere transfer edilir ve antikor propları ile bu yüzeyler yıkanır. Antikorlar
ilgilenilen proteinler ile bağlantı kurar. Bu bağlantıyı gözlemlemek için renk
üretici olarak kullanılan “chemiluminescence” veya “autoradiography” gibi
çeşitli yöntemler kullanılır. Zaman zaman da bu bağlantının doğal olarak
ifade edilmiş protein yoğunluğunu tespit etmek için antikorlar ile ikinci bir
bağlantı kuracak enzimlerde kullanılmaktadır. “Western Blotting” sadece
proteinlerin tespitleri için değil aynı zamanda onların niceliksel bilgilerini de
araştırmacılara sağlarlar.
Analog olarak “Western Blotting” canlı hücre dokularındaki özellikli
proteinlerin boyanması içinde kullanılır. Ama yaygın olarak bu işlem için
hücre biyolojisinde FISH olarak adlandırılan “immunostaning” teknikleri
kullanılmaktadır.

68
68 Eastern Blotting (Eastern Blot):
Bu teknik proteinlerin post-translasyonel değişikliklerini tespit
etmek için kullanılır. Özel malzeme kullanılarak proteinlerdeki
değişimleri gözlemlemek için proplanmış PVDF veya nitrocellulose
yüzeylerine proteinler gömülür. Sonrasında diğer blotlama
tekniklerinde olduğu gibi işaretlemeler yaptırılarak gözlemler elde
edilmeye çalışılır.

69
69
DNA Arrays (DNA dizileme) Tekniği:
DNA dizileme tekniği; tek iplikli DNA oligonükleotid parçacıklarını
içeren, mikroskop slâydı üzerinde katı bir yüzeye tutulmuş noktalar
kümesinden oluşmaktadır. Bu sayede büyük parçalı DNA dizilerini
bile 100 mikron gibi çok küçük noktalar üzerinde gözlemlenebilinir
hale getiriliyor. Her noktada ise “Southern Blotting” tekniğinde de
olduğu gibi incelenen DNA örneğinin tamamlayıcı zinciri
bulunmaktadır. Bu teknik ile bir organizmanın gen ekspresyonu
hakkında detaylı bilgi sahibi olunabilinmekte. Bu teknikte, doku
içinde RNA izole edilerek işaretlenmiş kopya DNA’lara (c DNA)
dönüştürülür. Bu cDNA daha sonra dizi üzerindeki parçalar ile görsel
bir hibridizasyon gerçekleştirir.

70
70
Çoklu dizileme tekniklerinin bulunması ile sağlıklı hücrelerin DNA dizilimleri
ile kanserli hücrelerin DNA dizilimleri karşılaştırılabilinmektedir. Ayrıca
herhangi bir organizmada ortam şartlarına göre gen ekspresyonun ne
şekilde değişeceği de belirlenebilinir. Örneğin 7.000 gene sahip bir maya
olan ''Saccharomyces cerevisiae'' gen ekspresyonlarının sıcaklığa bağlı
olarak nasıl değişim gösterdiği de bu teknik ile tespit edilebilinir.
Mikro-dizilim teknikleri birden farklı yöntemle üretilebilinir. Genel olarak,
100 mikro çapında kuyucukların oluşturulduğu silikon çipler kullanılır. Bu
çiplerin üzerinde 100 den 10.000 ne kadar kuyu olabilmektedir. Dizileme
teknikleri sadece DNA’lar için değil aynı zamanda antikorlar içinde dizayn
edilip protein ekspresyonları hakkında moleküler biyologların bilgiler elde
etmesini sağlarlar.

71
71
Allele Specific Oligonucleotide (ASO):
ASO DNA’nın bir ipliğinde meydana gelen mutasyonların tespitinde
kullanılır. Bu teknik PCR ve Jel elektroforez’e ihtiyaç duyulmadan
kullanılmaktadır. 20-25 nükleotitli problar ile parçalanmamış DNA
işaretlenir. Bu problarda işlem sürecinde hibridizasyonlarmeydana
gelir. Hatta baz değişikleri gizli hibridizasyonlar ile değişir. Sonra
hedef DNA yıkanır ve hibridize olmamış problar ortamdan bu
sayede temizlenir. Problar ile hibridize olmuş hedef DNA bu
probların yaydığı radyoaktif veya floresans ışımalar ile analiz edilir.
Tüm moleküler biyoloji tekniklerinde olduğu gibi bu teknikte yapılan
değişikliklerin başarılı sonuçlandığı göstermek için önemlidir. Bir baz
çiftindeki dizilim farklılıklarını tanımlamak için “IlluminaMethylation
Assay” tekniği ASO’ya göre daha avantaj sağlamaktadır.

72
72
Eski Teknolojiler:
Moleküler Biyolojide teknolojiler geliştikçe eski teknolojiler artık
tarih sayfalarında yerini almaktadır. Örneğin, jel elektroforez
geliştirilmeden önce DNA parçacıklarının ayrılması “sükroz
gradienti” üzerinde çok uzun süreler sonucu yapılıyordu. Ama buna
rağmen yeni teknolojilerin çözüm bulamadığı bazı problemlerin
çözümünde eski teknolojiler kullanılabilinmektedir.

73
BÖLÜM-5
The
Polymerase
Chain
Reaction

74
74
Polimeraz Zincir Reaksiyonu, DNA’nın belirli bir bölgesinin tüp
içinde çoğaltılması işlemidir.
Bu teknik ile DNA molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca
kopyasını yapmak mümkündür.
PCR,1985 yılında Cetus adlı biyoteknoloji firmasında çalışan
KaryMullis adlı araştırmacı tarafından bulunmuştur.Bu
buluşu,KaryMullis ‘in 1993 yılında Nobel Kimya ödülünü
almasını sağlamıştır.

75
75
• PCR,
DNA dizi analizinde ve DNA haritalanmasında,
Genetik hastalıkların teşhisinde,
DNA parmakizi analizinde,
İnsan Genom Projesi ve diğer Genom Projelerindeki
araştırmalarda,
Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde,
Tarımda,
Sistematik ve evrim çalışmalarında kullanılmaktadır.

76
76
PCR tekrarlanan 3 basamak şeklinde gerçekleşir.Bu
basamaklar;
1.Amplifiye edilecek DNA ‘nın yüksek sıcaklıkta denatürasyonu
(94ºC ),
2.Primerlerin DNA üzerindeki hedef bölgelerle özgül
hibridizasyonuna olanak verecek sıcaklıktaki annealing-birleşme
reaksiyonu,
3.Taq DNA polimeraz enziminin yüksek aktivite gösterdiği sıcaklık
olan 72 ºC ‘ de primerlerin uzaması-tamamlayıcı zincir sentezi
olarak tanımlanabilir.

77
77
Polimeraz zincir reaksiyonu için,
Kalıp DNA molekülüne,
20-25 baz uzunluğunda ve kalıp zincirin 5’ ve 3’
uçlarındaki DNA dizilerine komplementer olan sentetik
oligonükleotitlere,
Serbest dNTP ‘lere ( dATP , dCTP , dGTP , dTTP )
Taq DNA polimeraz enzimine
Enzimin çalışacağı uygun koşulları sağlayan tampon
sistemine ihtiyaç vardır.

78
78

79
79

80
80

81
81
Tek örnek için PCR karışımının hazırlanması ( 100 μl toplam
hacim ) :
DNA 100 ng
10 X Tampon 10 μl
dNTP 2 μl ( 200 μmol olacak şekilde)
25 mM MgCl2 6 μl
F primer 100 pmol
R primer 100 pmol
sdH2O 80 μl
Taq polimeraz 2.5 ünite
Dört tür dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)

82
82
PCR Koşulları :
94 ºC denatürasyon
55-60 ºC annealing
72 ºC polimerizasyon
Annealing derecesi primerin baz içeriğine ve uzunluğuna bağlı olarak
değişken bir değerdir.Her primer için annealing değerleri hesaplanır.
2( A + T ) + 4 ( G + C )
Örnek Dizi :
5’CCTTAAGCTGGTGTCCAAAT 3’
2 ( 11 AT) + 4 (9GC) = 58 0C
5’ GCTAGCAATATTTGTAAGCAT 3’
2 (14 AT) + 4 ( 7 GC ) = 56 0C

83
PCR CİHAZI
THERMAL CYCLER

84
PCR CİHAZI
THERMAL CYCLER

85
PCR CİHAZI
THERMAL CYCLER

86
PCR CİHAZI
THERMAL CYCLER

87
PCR CİHAZI
THERMAL CYCLER

88
88
MEHMET KARCİ ‘NIN TEZ ÇALIŞMASI
UYGULAMALI GEN AMPLİFİKASYONU: PCR TEKNOLOJİSİ
PCR (POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU)
Standart PCR Reaksiyon Karışımı: Çalışılan standart PCR karışımı (25 μl)
aşağıdaki şekilde hazırlanır. Reaksiyonların tamamı 30 döngü uygulanır.
Tablo 1. PCR Reaksiyon Bileşenleri
Bileşen Hacim Final Konsantrasyonu
Otoklavlanmış-filtre edilmiş su 20.7 μl –(pH 7.0)
2- 10 X PCR Tampon* 2.5 μl 1 X

89
89
3. dNTP karışımı (herbiri 0.2 μl 200 μM herbir nükleotitden 25 μM)
4. Primer karışımı (herbiri 0.4 μl 0.4 μM herbir primerden 25 pmol/μl)
5. Taq DNA polimeraz 0.2 μl 1 ünit/25 μl
(native enzim=doğal yapıda enzim)
6. Genomik DNA kalıbı 1.0 μl 100 ng/μl
(100 ng/μl)
*PCR tamponu satıcının (Perkin Elmer Cetus) tavsiyesi üzerine kullanılmıştır.
10 X Tampon : 500 mMKCl, 100 mMTris-HCl (pH 8.3),
15 mMMgCl2 (PCR karışımında bu maddelerin final konsantrasyonları şöyledir :
50 mMKCl, 10 mMTris-HCl, 1.5 mMMgCl2)
Yukarıda miktarı belirtilen tampon daha fazla hazırlanabilir (10-15 ml) ve bu tampon
tüplerde –20 oC’de uzun süre saklanabilir

90
90
Pipetleme ve DNA Kalıbı
Pipetlemeye su ile (ilk olarak) başlanmak daha iyi olur. Daha sonra sırasıyla diğer
bileşenler pipetlenir. PCR reaksiyon bileşenleri farklı bir sırada pipetlenirse sonuçlarda
pek farklılık görülmez.
DNA kalıbına primer bağlanma ihtimalini azaltmak ve ilk denatürasyon basamağından
önce polimerazın çalışmasını engellemek amacıyla; reaksiyon bileşenlerinin
pipetlenmesi buz üzerinde yapılır ve tüpler de buz içinde tutulur.
Plazmidler laboratuvarda kullanılıyorsa; pipetleme steril hava akımının olduğu
yerlerde; genomik DNA ya da fazla miktarda DNA kalıp olarak kullanılıyorsa pipetleme
bençlerde de yapılabilir.
PCR’da kalıp olarak kozmidler, fajlar ya da plazmidler kullanılıyorsa, aerosol rezistant
pipet tipinin kullanması gereklidir. Aksi takdirde, çoğu kez yanlış pozitif sonuçlara karar
verilir (kalıp DNA miktarının amplifikasyon için yeterli olmasına rağmen).

91
91
Genomik DNA benzeri kompleks DNA kalıplar kullanılıyorsa (bu durumda 10-100 ng
miktarında örnek reaksiyona girer) bu tedbir gerekli olmayabilir. Yine de, her PCR
reaksiyonu için aerosol rezistan pipet tiplerinin kullanılması güvenirlik açısından
önemlidir.
Düşük miktarlarda(1-2 μl) kompleks DNA (genomik DNA) örneklerinin
pipetlenmesi sırasında karşılaşılan diğer bir problem ise, herbir PCR tüpüne
gerçekte konulan DNA miktarında meydana gelebilecek farklılıktır.
Fig. 5 ------

92
92
Fig. 5. Pipetleme hatasına örnek çoklu (multiplex) PCR test reaksiyonu. İki farklı
genomik DNA örneği (herbiri 100 ng/μl) Mix J’li çoklu PCR karışımında kullanıldı. 11
farklı gen bölgesi (165 ve 85 bp uzunluğunda) aynı zamanda amplifiye edildi.
İşaretleme radyoaktif dCTP ile, ürünlerin ayırımı da PAA jel ile yapılmıştır. A örneğinin
herbirinden (1-4 nolu tüpler) 1 μl ve B örneğinin (5-8 nolu tüpler) herbirinden de 1 μl
kuyucuklara yüklendi. Sol tarafta, DNA her tüpe ayrı ayrı pipetlendi. Sağ tarafta, DNA
diğer PCR bileşenleri ile karıştırıldı ve bu karışım tüplere eşit miktarlarda bölündü. Sol
taraf amplifikasyonlar, genomik DNA’nın 1 μl’sinin değişik miktarlarda DNA
içerebildiğini işaret etmektedir. Bu durum, özellikle PCR reaksiyonlarının ve PCR
niceliğinin yorumlanmasına negatif etki yapabilir. Sağ taraf amplifikasyonları
birbirleriyle daha uyumludur (1-4 ve 5-8 karşılaştırılınca). Küçük değişiklikler,
termaldöndürücünün metal bloklarındaki değişik alanlarda sıcaklık farklılıklarından
kaynaklanabilir

93
93
İlk PCR Programı: Spesifik olmayan ürünler oluşturmadan, spesifik bir gen bölgesini
amplifiye etmek optimal bir PCR reaksiyonu için gereklidir. Annealing sıcaklığı
yeterince yüksek olmak zorundadır; bu olay reaksiyon sırasında hatasız DNA-DNA
birleşimine olanak sağlar. Verilen herhangi bir primer çifti için PCR programı, primerin
kompozisyonu (GC içeriği) ve beklenilen PCR ürününün uzunluğu temel alınarak
seçilebilir. Bu gibi durumların çoğunda, amplifiye olması beklenen ürünler kısmen
küçüktür (0.1-2 ya da 3 kb). Uzun aralıklı (long-range) PCR için (amplifiye ürünler 10-20
ya da 30 kb) ticari kitler kullanışlıdır. Taq polimerazın aktivitesi optimal sıcaklıkta (72-78
oC ) yaklaşık 2000 nükleotit/dakikadır ve reaksiyonda uzatma zamanı (extention time)
uygun şekilde hesaplanabilir.

94
94
Enzim aktivitesi reaksiyon sırasında her zaman optimal olmayabilir. Amplifiye olan
ürünlerin kb sayısına eşit olacak şekilde uzatma zamanı yazar tarafından uygulanır
(1 kb için 1 dakika, 2 kb için 2 dakika gibi). Daha sonraları, ürünler bilindiğinde
uzatma zamanı düşürülebilir.
Birçok araştırmacı, aktüel döngü başlamadan önce ilk denatürasyon basamağını
2-5 dakika uygulamaktadır. Bu olayın, hedef DNA’nın denatürasyonunu
kolaylaştırdığı farzedilmektedir. Ayrıca, birçok makalede 5-10 dakikalık en son bir
uzatma zamanı tanımlanmıştır (böylece son döngü sırasında başlatılan birçok PCR
ürününün uzamasının devamı sağlanmış olur).
30-60 saniyelik bir annealing zamanı şimdiye kadar test edilen bütün primer
çiftleri için yeterlidir. Annealin sıcaklığı primerlerin erime (melting) sıcaklığı temel
alınarak seçilebilir. Bu yüzden, birçok kez kullanılan basit bir prosedürde, başlangıç
annealing sıcaklığı yazar tarafından 54 oC olarak kullanılmıştır (uzunluğu 20 bp ya
da daha uzun olan birçok primer için bu durum iyidir.)

95
95
Spesifik olmayan ürünler oluşursa bu sıcaklık artırılmalıdır. Eğer reaksiyon istenileni
veriyorsa (sadece istenilen ürün sentezlenmiş ise) bu sıcaklıkta devam edilir. İki
primerin birbirine yakın erime sıcaklığı ya da Tm derecesine sahip olması arzu
edilir (5 oC ya da daha düşük). İki primer arasındaki Tm farklılığı yüksek ise, 5’ ya da
3’ uçta yeralan primerin uzunluğunun artırılması ile düşük Tm derecesi artırılır.
Bu çalışmada 70 ya da daha fazla primer kullanılmıştır. 94 oC lik 30-60 saniyelik
denatürasyon zamanında iyi PCR ürünleri alınmıştır. Daha uzun bir denatürasyon
basamağında, yüksek sıcaklıkta Taq polimerazın zamanı uzayacak ve polimeraz
moleküllerinin % aktivite kaybı artacaktır.
Döngü Sayısı: Genelde, 30 döngü alışılmış PCR için yeterli olur. Döngü sayısındaki
artış ürün miktarında keskin değişmeler yapmayacaktır.

96
96
Spesifik olmayan ürünler oluşursa bu sıcaklık artırılmalıdır. Eğer reaksiyon
istenileni veriyorsa (sadece istenilen ürün sentezlenmiş ise) bu sıcaklıkta
devam edilir. İki primerin birbirine yakın erime sıcaklığı ya da Tm derecesine
sahip olması arzu edilir (5 oC ya da daha düşük). İki primer arasındaki Tm
farklılığı yüksek ise, 5’ ya da 3’ uçta yeralan primerin uzunluğunun
artırılması ile düşük Tm derecesi artırılır.
Bu çalışmada 70 ya da daha fazla primer kullanılmıştır. 94 oC lik 30-60
saniyelik denatürasyon Tablo. 2. İlk PCR Programının Dizaynı
İsim Sıcaklık Zaman
İlk denatürasyon 94 oC İsteğe bağlı
Denatürasyon 94 oC 30-60 sn
Annealing (bağlanma) 54 oC 30-60 sn
Extension (uzatma) 72 oC 30-90 sn
Son uzatma 72 oC İsteğe bağlı

97
97
Termal döndürücü ve PCR Tüpleri: PCR tüplerinin ve termaldöndürücünün
farklı tipleri mevcuttur. Bazı potansiyel yararlı gözlemler aşağıda belirtilmeye
çalışılmıştır :
Aynı PCR programı değişik termaldöndürücülerde önemli bir farklılık
olmadan çalışacaktır (sıcaklık ve zaman profilleri farklı olabilir), böylece aynı
primerin kullanıldığı PCR sonuçları değişik olabilir. Bununla birlikte,
döngünün uygun şekilde ayarlanması ile aynı sonuçlar birçok
termaldöndürücüde gözlenebilir.
iyi PCR ürünleri alınmıştır. Daha uzun bir denatürasyon basamağında,
yüksek sıcaklıkta Taq polimerazın zamanı uzayacak ve polimeraz
moleküllerinin % aktivite kaybı artacaktır.
Döngü Sayısı: Genelde, 30 döngü alışılmış PCR için yeterli olur. Döngü
sayısındaki artış ürün miktarında keskin değişmeler yapmayacaktır.

98
98
Yeni birçok PCR makinesi 0.2 ml ince-duvarlı PCR tüplerine uygun hale
getirilmiştir. Tüplerin bu tipleri için tüpten tüpe sonuçlardaki farklılıklar
çoğunlukla ihmal edilir (plastik ve metal arasındaki ilişki iyidir, ısıtma olayıda
buna yardımcı olur). Eski makine tipleri 0.5 ml ya da 1.5 ml tüplere
uygundur. Şirketler arasında duvar kalınlığı ve şekilde önemsiz farklılıklar
olmamasına rağmen, termaldöndürücülerin metal blokları ve tüpler
arasındaki ilişki her zaman iyi olmayabilir. Çoğunlukla bu tür durumlarda
amplifikasyonlar olmaz ya da çok az olur. Böyle bir duruma örnek aşağıda
verilmiştir. Bazı firmalar, reaksiyon sırasında PCR tüplerinin içine yerleştiği
küçük su banyolarının sıcaklığını kontrol eden makineler sunmaktadır. Bu
durumda su ve plastik arasındaki termal değişim iyi olmakta, PCR
sonuçlarındaki varyasyonlar en aza düşmektedir.

99
99
Fig. 6. Metal blok ve bazı tüpler arasında uygun ilişkinin kaybolmasından
kaynaklanan amplifikasyon varyasyonları. PCR karışımı 9 farklı tüpte aynı
bileşenleri eşit şekilde içermektedir ve tüpler termaldöndürücününmetal
bloklarının farklı kuyularına yerleştirilmiştir. 2,4,5 ve 9 reaksiyonlar negative
sonuç vermiştir

100
100
PCR PRİMERLERİNİN SEÇİMİ VE DİZAYNI
PCR için primerlerin dizaynında aşağıdaki basamaklar/yollar test edilmiştir
ve yararlı oldukları kanıtlanmıştır.
Primerlerin boyutları 18-24 bp arasındadır. Büyük primerler (30-35 bp) kısa
primerler ile karşılaştırıldığında bunların daha benzer döngü şartlarında
çalıştıkları görülür ve bu durum PCR’ı daha da kolaylaştırır.
Tm derecesi ya da erime sıcaklığı yakın olan iki primerin kullanılması
faydalıdır. İki primer arasındaki Tm farklılığı yüksek ise; düşük Tm derecesi 5’
ya da 3’ uçta yeralan primerin uzunluğunun artırılması yoluyla
yükseltilebilir.Pürin : pirimidin içeriği 1 : 1 civarında olmalıdır (%40-60
olabilir).Primer sekansı 1-2 pürin bazıyla başlamalı ve bitirilmelidir.
Her primer çifti primer-primer etkileşimi bakımından test edilmelidir. Bu
amaçla kullanılabilecek yararlı Macintosh programı “CPrimer” dir. Bu
program sekansa giriş için erime sıcaklığını da verir. Bu şekilde PCR
programlarının dizaynına yardımcı olur. Bazı web sitelerinin direkt olarak
kullanılabilen programları aynı fonksiyonu yapabilir (erime sıcaklığının,
uygun primerlerin seçilmesi gibi).

101
101
Primer sekansları; istenilen DNA sekanslarıyla ve genomda başka yerdeki
gen bölgeleri ile ya da sıralı sekanslar ile benzerlikleri bakımından
kontrol edilmelidir. Eğer iki gen bölgesi çok benziyor ise ( örneğin across
türler); amplifiye olan gen bölgesinin 3’ ucuna spesifik olan primer en az
1-2 baz fazla olacak şekilde dizayn edilir.
Döngü şartları ve tampon konsantrasyonları her primer çifti için
ayarlanabilir. Sekonder ürün oluşturulmadan istenilen gen bölgesinin
amplifikasyonu spesifikleştirilmiş olur. Bu durum mümkün değil ise,
primerlerin sekansları (her ikiside) 4-5 baz uzatılır ya da primer çifti
tamamen değiştirilir.

102
102

103
103
Soru: PCR reaksiyon hacmi sonuca olumsuz etki eder mi?
Yanıt : Hayır. Özellikle de küçük hacimli, ince duvarlı, 0.2 ml plastik tüpler
termal döndürücünün 96 kuyucuklu metal bloklarına uygundur.
Gözlemlerin birkaçı şu şekilde sıralanabilir :
Eğer eski model termal döndürücü kullanılıyorsa (ısıtma kapağı olmayan)
PCR reaksiyonları küçük hacimlerde yapılır ve mineral yağı reaksiyon
karışımlarını örtmek için gereklidir. Yağın kullanılması tüpteki sıvının hacmini
artırır ve az da olsa sonucu etkiler. Ayrıca, eski termal döndürücülerde
büyük, kalın duvarlı plastik tüplerin kullanılması gerekiyorsa metal bloklara
yerleştirme olayında düzensizlikler oluşur ve PCR sonuçlarında değişkenlik
ihtimali artabilir.
96 kuyucuklu metal bloklar için dizayn edilen küçük, ince duvarlı tüpler
küçük hacimli PCR reaksiyonları için idealdir. Termald öndürücülerin ısıtma
kapağı varsa mineral yağına gereksinim yoktur. 100, 25, 5 ml. karışımlar
kullanılarak reaksiyonların benzer sonuçlar verip-vermediği test edilir.

104
104
Önemli bir noktayı da belirtmek gerekirse; DNA kalıbı az miktarda
kullanılıyorsa az hacimli PCR’ lar çok yararlı olabilir. Kalıp DNA miktarı sabit
olduğunda, genelde, reaksiyon karışımı olan 5 m l 100 m l ile
karşılaştırıldığında reaksiyonun her mikrolitresindeki PCR ürün miktarı daha
yüksek bulunacaktır. Böyle bir durum PCR ürünlerinin görünmesine imkan
verir, bazen hacmin fazla olduğu reaksiyonlarda bantlar görünmeyebilir.

105
105
ÇOKLU PRİMER ÇİFTLERİ
Tek Gen Bölgesi Amplifikasyonu : Çoklu (multiplex) bir PCR dizaynındaki ilk
basamak primer çiftlerinin seçimidir. Verilen bütün gen bölgelerinin optimal
amplifikasyonunu sağlayan bir PCR programını bulmak oldukça önemlidir
(Fig. 9). Böyle bir durum annealing, uzatma zamanı ve sıcaklığın ayarlanması
yoluyla başarılabilir.

106
106
Çoklu Eşmolar Primer Karışımları: Sonraki basamak; her primerin eşmolar
oranda kullanılmasıyla istenilen primer çiftlerinden oluşan çoklu
karışımlardır. Çoklu karışımlar PCR amplifikasyonu yapabilir, önce tek primer
çiftinde olduğu gibi tamamen aynı PCR programı kullanılır. Çoğu kez, bu olay
bazı gen bölgelerinin tercihen amplifikasyonu ile sonuçlanacaktır. Böyle bir
durumda, primer konsantrasyonunda ve döngü şartlarında ek düzenlemeler
yapmak gerekli olacaktır. Gerçi, bazen spesifik olmayan ürünler tek gen
PCR’ın da görülebilir (sarı ok, PCR ürün # 2), bu spesifik olmayan ürünler
çoğunlukla çoklu PCR yapıldığında görülmez olur. Bu durum muhtemelen
spesifik olmayan ürünleri örten birçok spesifik gen bölgesinin aynı zamanda
amplifikasyonu yoluyla olur.

107
107

108
108
Döngü şartlarının Ayarlanması :
Annealing zamanı ve sıcaklık
Uzatma zamanı ve sıcaklık
Örneğin Fig.11’de uzatma sıcaklığının etkisi gösterilmektedir. Eşmolar
karışımlar iki farklı PCR programı kullanılarak amplifiye edildi. Birinci
programda 65 oC (sarı hat) ve diğerinde 72 oC (yeşil hat) uzatma sıcaklığı
kullanılmıştır. Program A kullanıldığında genelde A, B ve D için PCR
ürünlerinin miktarı daha fazladır. Bu olayda şunu göstermektedir, 72 oC
uzatma sıcaklığı bazı gen bölgelerinin (pembe oklar) amplifikasyonunu
negatif etkilerken, görülebilen bazı spesifik olmayan ürünler de (sarı ok)
oluşturmaktadır. Aynı örneklerde kısa PCR ürünleri için daha yüksek
annealing sıcaklığının kullanılması, annealing sonrası polimerazca
kopyalanma şansı bulunan DNA zincirinde azalma meydana getirir.
Muhtemelen bu sıcaklık DNA heliksinin stabilitesine zarar verir.

109
109

110
110
Primer Miktarı ve Tampon Konsantrasyonu: Fig. 11’de bulunan DNA
ürünlerinin bazılarının amplifikasyonunu düzeltmek için primerlerin
miktarları bu gen bölgelerinde 2-5 X artırıldı. Aynı zamanda, PCR tampon
konsantrasyonu 2 X artırıldı. Bu modifikasyonlar çok daha etkili olmakta ve
amplifikasyonu (spesifik olmayan ürünlersiz) gerçekleştirmektedir.

111
111
PCR PRİMERLERİNİN MİKTARI
Çoklu PCR Primer Konsantrasyon Değerleri: PCR reaksiyonu sırasında
mevcut DNA primerlerinin miktarları sonuçları etkiler. Bir PCR
reaksiyonunda primer konsantrasyonu (örneğin tek gen bölgesi amplifiye
edilcekse) herbir primerden 100-500nM olacak şekilde kullanılır
(primerlerin herbiri 10-25 m Marasındaki konsantrasyonlarda değişik
kaynaklardan alınabilir. Çoğunlukla, 0.5-1 m l primer solusyonu 25-100 m l
bir PCR reaksiyonu için yeterlidir). Eşmolar primer karışımlarının kullanıldığı
çoklu bir PCR test tüpünde, tek tek primerlerin miktarı 500-15 nM arasında
değişir. 14 adet primerin (7gen bölgesi için) kullanıldığı karışım A’da ve
karışım B’de final konsantrasyonu, karışım A için 7000-200 nM arasında,
karışım B için 5000-150 nM arasında değişmektedir. Gerçi eşmolar primer
karışımları çoğu kez bütün gen bölgelerinin optimal amplifikasyonu için
kullanılmaz. Bu test tüpü kaçınılması gerekli olan oldukça düşük ve oldukça
yüksek primer miktarlarının gözlenmesine imkan vermektedir.

112
112

113
113
Primer ve Kalıp Konsantrasyonu : Sınırlar dahilinde, primer
konsantrasyonunda artış PCR reaksiyonlarının sonuçlarını düzeltebilir ve
PCR reaksiyonlarını optimize etmede gözönünde bulundurulmalıdır. Bu
suretle aşağıda Fig. 14’de kalıp DNA ve primer konsantrasyonlarındaki artış
PCR sonuçlarını düzeltmiştir.

114
114
PCR TAMPONLARI
Yaygın şekilde çok kullanılan PCR tamponu sadece Tris, MgCl2 ve KCl
içermektedir (örneğin Perkin Elmer Cetus). Biraz daha kompleks bir tampon
önceleri DMD gen ekzonlarının çoklu reaksiyonları için öneriliyordu. Bu
tamponların çoklu PCR reaksiyonunda Taq polimerazın aktivitesindeki
etkileri karşılaştırıldı. Fig.15’de görüldüğü gibi, dört farklı genomik DNA kalıbı
üzerinde yapılan PCR reaksiyonları, 1 X DMD tamponuna göre 1.6 X
tamponunda daha etkin (daha fazla PCR ürünü ) oluşturmaktadır. Kalıp DNA
ve primer bütün reaksiyonlarda aynı tutulup, aynı zamanda aynı şartlarda
yapıldı. Jel üzerindeki herbir hatta ürünler eşit miktarlarda yüklendi.

115
115
Tablo. 3. PCR tamponlarının kullanılması.
10 X PCR Tamponu 5 X DMD Tamponu
500 mMKCl 83 mM(NH4)2SO4
100 mMTris-HCl 335 mMTris-HCl (pH 8.3)
15 mMMgCl2 33.5 mMMgCl2
Reaksiyondaki optimal 50 mMb -merkaptoetanol dNTP
konsantrasyonu 34 mMEDTA
200 m M Reaksiyondaki optimal dNTP
konsantrasyonu = 6000 m M

116
116

117
117
TUZ (KCL) KONSANTRASYONU
Birden fazla gen bölgesinin çoklu PCR amplifikasyonu için ya da başarılı PCR
için (özellikle 100-1000 bp arasındaki ürünler için) tampon
konsantrasyonunun 1.4 X-2 X yükseltilmesi (ya da sadece KCl
konsantrasyonunun 70-100 mMcivarına yükseltilmesi) reaksiyonun
etkinliğini artırmaktadır.

118
118
Gerçektende KCl konsantrasyonunun etkisi test edilen herhangi bir
düzenleyiciye göre (DMSO, gliserol, BSA) daha önemli bulunmuştur. Genel
olarak, uzun amplifikasyon ürünleri oluşturan çoğu primer çifti düşük tuz
konsantrasyonlarında daha iyi çalışırken, kısa amplifikasyon ürünü oluşturan
çoğu primer çifti yüksek tuz konsantrasyonunda daha iyi çalışır. Aşağıdaki 3
figürde iyonik kuvvet artışına bağlı olarak kısadan uzuna doğru ürünlerin
yoğunlukları verilmiştir. Tuz konsantrasyonundaki bir artış kısa DNA’ya göre
uzun DNA’yı daha yavaş denatüre eder. Bu nedenle tercihen kısa moleküller
amplifiye edilecektir. Bununla birlikte bazı primerler tampon/tuz
konsantrasyonlarının geniş aralığında iyi çalışır. Farklı tampon
konsantrasyonlarında çoklu reaksiyon örnekleri Fig. 16, 17 ve 18’de
gösterilmektedir.
Fig 16’da gen bölgesi 6 için iki primerin erime sıcaklığı 58 oC iken, gen
bölgesi 5 için erime sıcaklığı 52 oC civarındadır. Aynı iyonik kuvvette (1 X
tampon) ve annealing sıcaklığında (54 oC) gen bölgesi 6 amplifikasyonunun
gen bölgesi 5’in daha ilerisinden yapılması önerilir.

119
119
Annealing sıcaklığını aynı tutulması sırasında, gen bölgesi 5’e primerlerin
bağlanmasını artırmak için PCR tamponunun konsantrasyonunun
(stringency) düşürülmesi gerekmektedir. Bu olay, KCl konsantrasyonunun
(ya da tampon) artırılması ile sağlanabilir. Gen bölgesi 7 farklı bir örnektir,
her iki primer gen bölgesi 6 için kullanılan (58 oC) primerler ile aynı erime
sıcaklığına sahiptir. Bunlar (6 ve 7 gen bölgeleri) 1 X tamponda iyi amplifiye
olmamıştır, buna karşılık tuz konsantrasyonundaki artışa cevap iyi olmuştur.
Bu durum; 7. ürünün tümünün 6. ürüne göre daha düşük GC içeriğine sahip
olması şeklinde açıklanabilir.
Uzatma sıcaklığına maruz bırakıldığında ürün 7’nin DNA heliks stabilitesinde
azalma yapar. Yeni zincirlerin bazısı, polimeraz onları tam amplifiye
etmeden önce kalıptan ayrılabilir. Tamponun (1.6 X-2 X) konsantrasyonunun
azalması, yeni sentez edilen zincirlerin kalıba daha iyi bağlanmasını
(yapışmasını) sağlayabilir ve polimerazın görevini sonlandırmasın imkan
sağlar. Sadece KCl ya da Tris-HCl konsantrasyonunda değişkenlik olan PCR
reaksiyonlarının, KCl konsantrasyonlarından etkilendikleri gösterildi.

120
120
Tris-HCl konsantrasyonu, konsantrasyonun geniş aralığında reaksiyonun
sonuca etki etmezken, MgCl2 konsantrasyonu az da olsa farklı etkiye
sahiptir.

121
121
PCR PROGRAM DİZAYNI
Temel Prensipler : Spesifik olmayan ürünlerin oluşturmadan, spesifik bir
gen bölgesinin çoğaltılması, optimal bir PCR reaksiyonu için gereklidir. Bu
yüzden, reaksiyon sırasında DNA-DNA eşleşmesinin çok iyi olması için
annealing sıcaklığının yüksek olması gerekir. Verilen herhangi bir primer çifti
için PCR programı; primerin baz kompozisyonu (GC içeriği) ve beklenilen
PCR ürününün uzunluğu temel alınarak seçilebilir. Bu durumlarda genelde
amplifiye olması beklenilen ürünler kısmen küçüktür (0.1-2 ya da 3 kb).
Uzun aralıklı PCR için (amplifikasyon ürünleri 10-20 ya da 30 kb) ticarı kitler
avantajladır. Taq polimerazın aktivitesi, optimal sıcaklıkta (72-78 oC) yaklaşık
2000 nükleotit/dakikadır ve reaksiyonun uzatma zamanı uygun şekilde daha
sonra ayarlanabilir.
Reaksiyon sırasında, enzim her zaman optimal aktivite göstermeyebilir.
Uygulayıcı tarafından, uzatma zamanını (dakikada) amplifiye olan ürünün kb
sayısına eşit olarak ayarlamak çoğu kez uygulanan bir yöntemdir (1 kb için 1
dakika, 2 kb için 2 dakika gibi). Sonra ürünler tanımlanınca, uzatma zamanı
daha da indirilebilir.

122
122
Birçok araştırmacı aktüel döngü başlangıcı öncesinde ilk denatürasyon
basamağını 2-5 dakika olarak kullanır. Bu durumunun, hedef DNA’nın
denatürasyonuna daha da yardımcı olduğu ifade edilmektedir. Ayrıca, 5-
10 dakikalık bir enson uzatma zamanı birçok yayında belirtilmiştir (son
döngü esnasında başlayan birçok PCR ürününün ya da büyük bir
kısmının uzamasının sonlanmasına yardımcı olduğu ifade edilir). Bu iki
basamak farklı gen bölgeleri için test edilmiştir, ne ilk denatürasyon ne
de son uzatma zamanı PCR reaksiyonunun sonucunda değişme
yapmamıştır. Bundan dolayı, uygulayıcının düşüncesine göre bu
basamaklar artık kullanılmayanilir.
Annealing zamanı, primerlerin erime sıcaklığı temel alınarak seçilebilir.
Bazen sonuçlar beklenildiği gibi olmayabilir. Bundan dolayı, 54 oC yazar
tarafından başlangıç annealing sıcaklığı olarak kullanılmıştır (20 bp
civarında ya da daha fazlasında birçok primer için çoğunlukla iyi sonuç
verdi). Eğer spesifik olamayan ürünler oluşursa, bu sıcaklık artırılmalıdır.
Eğer reaksiyon özgül ise (sadece beklenen ürünler sentez ediliyorsa)
sıcaklık olduğu gibi kullanılmalıdır.

123
123
Bu çalışma esnasında 70 ya da daha fazla primer kullanılmıştır. 30-60
saniyelik bir denatürasyon zamanı etkili ve başarılı bir PCR için yeterli
görülmüştür. Denatürasyon zamanındaki bir uzama, yüksek sıcaklık
altında Taq polimerazın zamanını artıracak ve polimerazmoleküllerde
aktivite kayıp yüzdesini çoğaltacaktır.
Döngü sayısı. Genelde, 30 döngü PCR reaksiyonları için yeterli olacaktır.
Döngü sayısındaki bir artış ürünlerin miktarında keskin bir değişim
yapmayacaktır.
Annealing Sıcaklığının ve Amplifiye Olan Gen Bölgesi Sayısının Etkisi :
Diğer PCR’lardan farklı olarak çoklu reaksiyonlar yeterli bir sıcaklıkta
(stringent) tamamlanmalıdır. Birçok bireysel gen bölgesi 56 oC –60 oC’lik
bir annealing sıcaklığında spesifik olarak amplifiye edilebilir. Deneylerin
gösterdiğine göre, annealing sıcaklığının 4-6 oC düşürülmesi çoklu
karışımlarda aynı gen bölgesinin birlikte amplifikasyonu için gereklidir.
Bu durum aşağıda fig 19’da gösterilmektedir. Aşağıdaki ifade, tek
parametrenin değiştirildiği (annealing sıcaklığı) şartlarda yapılan aynı
PCR reaksiyonlarını göstermektedir. Karışım C ve C*’nün çoklu PCR
amplifikasyonu için annealing sıcaklığı yaklaşık 54 oC görülmektedir.

124
124
Bireysel gen bölgeleri (örneğin Y) 60 oC’ de amplifiye olabilir. 54 oC’de çoklu
karışımda bazı spesifik olmayan amplifikasyonlar hala görünür. Bu durum
(non-spesifik bantların görüntüsü), spesifik gen bölgelerinin sayısını artıran
aynı zamanlı amplifikasyonlar aşılır ve bu yüzden artıklar görülmez. PCR’da
baz kompozisyonundaki farklılıklardan dolayı (ürünlerinin uzunluğu ya da
sekonder yapısı), bazı gen bölgeleri diğerlerine göre daha etkin amplifiye
olur. Birçok gen bölgesi aynı zamanda amplifiye olursa (çoklu
amplifikasyon), etkin şekilde amplifiye olan gen bölgesi etkisiz amplifiye
olan gen bölgelerinin ürün miktarını negativ etkileyecektir. Bu fenomen PCR
reaksiyonunda enzimlerin ve nükleotitlerin kısmen sınırlı kullanımından
dolayıdır. Bunun için çoklu prosedürde daha etkin amplifiye olan gen bölgesi
rekabeti kazanır ve amplifiye olan ürünlerin etkinliğini azaltır. Böylece
ürünlerde zayıf görüntü ya da görünmezlik oluşturur. (aşağıda Fig 19’da
annealing sıcaklığında kompleks durumlar belirtilmiştir. Aynı anda amplifiye
olan gen bölgelerinin sayısı ve tampon konsantrasyonu paralel
reaksiyonlarda değiştirilmişti)

125
125
Fig.19. Karışım C*, karışım C ve primer Y’nin çoklu amplifikasyonları.
Annealing sıcaklığı farklı olan (48 oC, 54 oC ya da 59 oC) üç PCR programında
üç farklı DNA kalıbı kullanılmıştır. Mix C* (her jeldeki ilk üç bant) ve Mix C (1
X ya da 2 X PCR tamponunda 7-12 hatlar) ve primer Y (4-6 hat, mavi ok) .
Her jeldeki 1-9. hatlar 1 X PCR tamponundaki reaksiyonları gösteriyor.

126
126
Her jeldeki 10-12. hatlar 2 X PCR tamponundaki reaksiyonlar gösteriyor. Her
jeldeki 7-12. hatlar (1 X ve 2 X altındaki ) primer karışım C’lidir. İlk jelin sol
bölgesindeki 5 ok karışım C*’nin beklenilen ürünlerini işaret etmektedir. Her
jeldeki en uzun spesifik ürün kırmızı okla işaret edilmektedir. Sarı oklar,
karışım C* ile karşılaştırılan karışım C’deki beklenilen 2 ekstra ürünü (toplam
7 ürün) işaret etmektedir. Mavi oklar, son iki jelde bazı reaksiyonlarda Y
ürünlerinin kaybını ya da ilk jelde Y ürünlerinin pozisyonunu işaret
etmektedir. Çoklu karışım 48 oC’de birçok non-spesifik bant göstermektedir.
1 X PCR tamponunda, karışım C* de karışım C’ye göre Y ürünleri daha
belirgindir. PCR tampon konsantrasyonu 1 X- 2 X aralığında bütün spesifik
ürünlerin amplifikasyonuna olanak verir ve çoğu non-spesifik uzun
ürünlerin yoğunluğunun azalmasına yardım eder (7-9, 10-12 hatlar
karşılaştırılınca). 2 X tamponunda görülen belirgin 470-480 bp nonspesifik
bant (mor ok) farklı primerlerin değiştirilmiş oranları sayesinde elemine
edildi. 59 oC’de sadece Y ürünü görülebilir. Bunun olabilmesi için, 2 X
tamponu kullanılmalısa ya da gen bölgesi tekbaşına amplifiye olmalıdır.

127
127
Döngü Sayısı : Primer mix C* iki farklı genomik DNA kalıbını amplifiye etmek
için kullanıldı. Aynı DNA kalıbı için sonuçlara bakıldığında, bütün tüpler
arasında iki genomik DNA’nın birinde daha iyi olduğunu ortaya çıkardı. Bu
durum muhtemelen DNA miktarından ya da kalitesinden dolayıdır.
Ürünlerin miktarları arasındaki en belirgin varyasyon 24. döngü civarındadır
(etidyumbromid ile boyanan jeller için). 28-30 döngü genel olarak
reaksiyonda yeterlidir. Döngü sayısının 45 üzerine çıkmasıyla çok küçük
değişimler gözlenmiştir ya da hiç değişim gözlenmemiştir.Döngü sayısı 60
üzerine çıktığında küçük kantitatif faydalardan bahsedilebilir (Fig.20)

128
128
Her jeldeki 10-12. hatlar 2 X PCR tamponundaki reaksiyonlar gösteriyor. Her
jeldeki 7-12. hatlar (1 X ve 2 X altındaki ) primer karışım C’lidir. İlk jelin sol
bölgesindeki 5 ok karışım C*’nin beklenilen ürünlerini işaret etmektedir. Her
jeldeki en uzun spesifik ürün kırmızı okla işaret edilmektedir. Sarı oklar,
karışım C* ile karşılaştırılan karışım C’deki beklenilen 2 ekstra ürünü (toplam
7 ürün) işaret etmektedir. Mavi oklar, son iki jelde bazı reaksiyonlarda Y
ürünlerinin kaybını ya da ilk jelde Y ürünlerinin pozisyonunu işaret
etmektedir. Çoklu karışım 48 oC’de birçok non-spesifik bant göstermektedir.
1 X PCR tamponunda, karışım C* de karışım C’ye göre Y ürünleri daha
belirgindir. PCR tampon konsantrasyonu 1 X- 2 X aralığında bütün spesifik
ürünlerin amplifikasyonuna olanak verir ve çoğu non-spesifik uzun
ürünlerin yoğunluğunun azalmasına yardım eder (7-9, 10-12 hatlar
karşılaştırılınca). 2 X tamponunda görülen belirgin 470-480 bp nonspesifik
bant (mor ok) farklı primerlerin değiştirilmiş oranları sayesinde elemine
edildi. 59 oC’de sadece Y ürünü görülebilir. Bunun olabilmesi için, 2 X
tamponu kullanılmalısa ya da gen bölgesi tekbaşına amplifiye olmalıdır.

129
İNSAN VÜCUDUNDA YAKLAŞIK OLARAK YÜZ TRİLYON
HÜCRE,ALTI MİLYAR KİLOMETRE UZUNLUĞUNDA DNA
BULUNMAKTADIR.
GENLERİN SAYISI,ÇALIŞMASI VE DİZİLİMİ GÖZÖNÜNE
ALINDIĞINDA «İNSAN» «BENZERSİZ BİR VARLIKTIR».
TÜM BU EĞİTİM BOYUNCA GÖSTERMİŞ OLDUĞUNUZ
SABIR VE İLGİ İÇİN TEŞEKKÜR EDERİM…

130
GÖZDEN GEÇİRME VE ÖZET

131
SORULARINIZI YANITLAYALIM ?

132
İletişim
KariyerBenim Eğitim & Danışmanlık & Bilişim Ltd.Şti.
Adres : Aksaray Üniversitesi Kampüs Çarşı
68100 Aksaray / Merkez
Facebook : www.facebok.com/kariyerbenim
Twitter : www.twitter.com/kariyerbenim
Mail : info@kariyerbenim.com
Kurumsal Danışma Hattı : +90 543 61 00 714
Web : www.kariyerbenim.com
GB-Lab. KariyerBenim Eğitim & Danışmanlık &
Bilişim Ltd.Şti.’nin Ürünüdür.

PCR

Recomendados

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Mais procurados

Mais procurados (18)

Semelhante a PCR

Semelhante a PCR (20)

PCR