La presentazione di Porto Conte Ricerche relativa al progetto Bi.Ar. (Sviluppo Sostenibile della birra artigianale in Sardegna) in occasione dell'incontro riservato alle imprese che si è svolto il 29 giugno 2021 su Zoom.

1. Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
Ricerca dei markers chimici responsabili dell’ossidazione nella birra e packaging attivo
Porto Conte Ricerche

2. Obbiettivo
Fasi critiche del processo produttivo
Post-bollitura / pre-fermentazione Post-fermentazione / Imbottigliamento
Valutare l’impatto dell’ossigeno durante i processi di birrificazione.
Rifermentazione in bottiglia
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

3. *
1
3 2
Bio-reattore (V = 5 L)
Funzione valvole:
1. Inlet CO2 / O2
2. Inlet mosto / Outlet campionamento
3. Sfiato / Inlet N2
Bassa fermentazione: 8°C
Alta fermentazione: 20 °C
1. Realizzazione di protocolli per la riduzione dei fenomeni ossidativi in fase di post bollitura e di
controllo del diacetile
Bassa fermentazione:
Vienna Lager, lievito W 34/70
Alta fermentazione: AIPA,
lievito US-05
Monitoraggio:
• Livelli O2
• Analisi standard
(estratto, CO2, alcol
etilico, pH, …)
• Analisi GC-MS
*Nutrienti: Wyeast Laboratories - USA
a) Ossigenazione del mosto
b) Apporto di nutrienti in fase di post-bollitura, pre-fermentazione
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

4. Analisi chimico-fisiche e quantificazione del diacetile durante fermentazione:
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
days
1
days
5
days
8
days
11
days
13
days
15
days
18
days
19
days
20
days
Estratto
Apparente
(%w/w)
Bassa fermentazione
Giorni
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
days
1
days
5
days
8
days
11
days
13
days
15
days
18
days
19
days
20
days
Diacetile
(ppm)
Bassa fermentazione
Giorni
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 days 1 days 4 days 6 days 8 days 11
days
12
days
13
days
Diacetile
(ppm)
Alta fermentazione
0 ppm
0 ppm N
8 ppm
Giorni
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
2
4
6
8
10
12
14
16
0 1 4 5 8 11 12 13
Estratto
Apparente
(%w/w)
Alta fermentazione
0 ppm
0 ppm N
8 ppm
Giorni
• L’aggiunta di nutrienti migliora
le performance fermentative .
• L’ossigenazione iniziale del
mosto crea un ambiente
altrettanto favorevole per i
lieviti.

5. Analisi chimico-fisiche e quantificazione del diacetile durante fermentazione:
• Sono necessari due giorni in
più per il campione di controllo.
• La fase di ossigenazione del
mosto può essere sostituita
dall’aggiunta di nutrienti.
3
4
5
6
7
0
days
1
days
5
days
8
days
11
days
13
days
15
days
18
days
19
days
20
days
Estratto
Apparente
(%w/w)
Bassa fermentazione
Giorni
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
days
1
days
5
days
8
days
11
days
13
days
15
days
18
days
19
days
20
days
Diacetile
(ppm)
Bassa fermentazione
Giorni
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 days 1 days 4 days 6 days 8 days 11
days
12
days
13
days
Diacetile
(ppm)
Alta fermentazione
0 ppm
0 ppm N
8 ppm
Giorni
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
2
3
4
5
6
7
8
0 1 4 5 8 11 12 13
Estratto
Apparente
(%w/w)
Alta fermentazione
0 ppm
0 ppm N
8 ppm
Giorni

6. 2
3
4
5
6
7
8
0 1 4 5 8 11 12 13
Estratto
Apparente
(%w/w)
Alta fermentazione
0 ppm
0 ppm N
8 ppm
Analisi chimico-fisiche e quantificazione del diacetile durante fermentazione:
3
4
5
6
7
0
days
1
days
5
days
8
days
11
days
13
days
15
days
18
days
19
days
20
days
Estratto
Apparente
(%w/w)
Bassa fermentazione
Giorni
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
days
1
days
5
days
8
days
11
days
13
days
15
days
18
days
19
days
20
days
Diacetile
(ppm)
Bassa fermentazione
Giorni
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 days 1 days 4 days 6 days 8 days 11
days
12
days
13
days
Diacetile
(ppm)
Alta fermentazione
0 ppm
0 ppm N
8 ppm
Giorni
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
Giorni
• Riassorbimento da parte
dei lieviti durante la
fermentazione
• Scarsa influenza della
concentrazione iniziale di
O2 disciolto

7. 0
50
100
150
200
250
300
2 fenil etanolo
ppm
T0
0ppm
8ppm
0ppm+N
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
Fenetil acetato
ppb
0
1
2
3
4
5
6
7
Benzaldeide
ppb
0
200
400
600
800
Ethyl Acetate
ppm
0
20
40
60
80
100
Furfurale
ppb
Bassa
fermentazione
Analisi della frazione volatile tramite HS-SPME-GCMS
Alta
fermentazione
0
20000
40000
60000
80000
100000
Fenetil acetato
ppb
0
100
200
300
400
500
600
Ethyl Acetate
ppm
0
50
100
150
200
250
300
350
400
2 fenil etanolo
ppm
T0
0 PPM
8PPM
0PPM N
Analita Tipo di marker Origine / Causa Andamento nel tempo Descrittore olfattivo
Etil acetato Variazione profilo olfattivo Lieviti Diminuzione / Aumento Mela / solvente
2-Fenil etanolo Variazione profilo olfattivo Lieviti Diminuzione Floreale
Fenetil acetato Variazione profilo olfattivo Lieviti Diminuzione Miele, rosa
Furfurale Tempo / temperatura Reazione di Maillard Aumento Mandorla
Benzaldeide Ossidazione Degradazione di Strecker Aumento Caramello, Mandorle
Vanderhaegen, B et al.(2006). The chemistry of beer aging - A critical review. Food Chemistry, 95(3), 357–381.
Etil acetato
Etil acetato 2-Fenil etanolo
2-Fenil etanolo
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
0
2
4
6
8
10
12
14
Benzaldeide
ppb
0
100
200
300
400
500
600
Furfurale
ppb

8. 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Conc.
diacetile
(ppm)
No Lievito F2
US 05 soglia
Giorni
1,9
2,4
2,9
3,4
3,9
4,4
T0 T2 T4 T8 T10 T14
CO
2
(g/L)
Tempo (giorni)
No Lievito US 05 F2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
T0 T2 T4 T8 T10 T14
O
2
ppm
Tempo (giorni)
No Lievito US 05 F2
Mosto
Birra matura
Lievito
Zucchero
Tesi 2
US-05
Tesi 3
Nessun lievito aggiunto
Tesi 1
F-2
F2: 0,05 g/L di lievito F-2 (Fermentis, Marcq-en-BaroeulCedex, France)
US 05: 0,15 g/L di lievito US-05 (Fermentis, Marcq-en-BaroeulCedex, France)
Nessun lievito aggiunto
• Carbonazione completa al 7° giorno in tutte le condizioni sperimentali.
• Ossigeno consumato dopo il primo giorno di rifermentazione.
• Maggior aumento iniziale del diacetile con US-05, ma comunque
riassorbito dai lieviti successivamente.
• Riassorbimento del diacetile più rapido senza aggiunta di lievito
o utilizzando F-2.
2. Monitoraggio dell’ossigeno e del diacetile durante rifermentazione in bottiglia
Stile birrario:
Golden Ale
Palamand, S. R., & Hardwick, W. A. (1969). Studies on the relative flavor importance of some beer constituents. Technical Quarterly, 6(2), 117–127
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

9. 3. Studio del processo di “ageing” con packaging attivo
Settimana di campionamento
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13*
Temperatura di
stoccaggio
Packaging
6 °C
Standard (SAO)
Active (CAO)
22 °C
Standard (SAO)
Active (CAO)
45 °C
Standard (SAO)
Active (CAO)
Tappo con
assorbitore di O2
Tappo normale
Cella frigo 6 °C
Cella 22 °C
Termostato 45 °C
Stile birrario: Pilsner
Monitoraggio nel tempo (13 settimane):
• Parametri chimico-fisici
• Ritenzione schiuma
• Colore
• Iso-α-acidi (IBU)
• Volatile ageing markers (HS-SPME-GCMS)
• Analisi sensoriale (al tempo finale)
Pavel Čejka et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013 61 (51), 12670-12675
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
*13 settimane a 45 °C → 1,7 anni a 30 °C / 7,5 anni a 20 °C

10. 0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
O
2
(ppm)
Settimana
Parametri chimico-fisici
4,9
5,1
5,3
5,5
5,7
5,9
6,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Etanolo
(%
v/v)
Settimana
2,8
3
3,2
3,4
3,6
3,8
4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Estratto
apparente
(%
w/w)
Settimana
SAO - 45 °C CAO - 45 °C
SAO - 22 °C CAO - 22 °C
SAO - 6 °C CAO - 6 °C
SAO t0 CAO t0
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
CO
2
(g/L)
Settimana
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

11. • Tempo zero (t0): tenuta di schiuma pari a ca. 260 – 280 secondi.
• Leggero aumento iniziale fino a 300 secondi per i campioni
conservati a 6 °C e 22 °C.
• Maggiore variabilità nel tempo per i campioni stoccati a 45 °C.
• Differenze contenute fra campioni con / senza assorbitore di
ossigeno.
Stabilità della schiuma
240
260
280
300
320
340
360
380
400
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Foam
Stability
-
s/(3
cm)
Settimana
SAO t0
CAO t0
SAO - 45 °C
CAO - 45 °C
SAO - 22 °C
CAO - 22 °C
SAO - 6 °C
CAO - 6 °C
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

12. 4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Colore
(EBC-Units)
Settimana
SAO - 45 °C
CAO - 45 °C
SAO - 22 °C
CAO - 22 °C
SAO - 6 °C
CAO - 6 °C
SAO t0
CAO t0
• Tempo zero (t0): ca. 5.5 EBC; nessuna differenza
statisticamente rilevante con / senza assorbitore di
ossigeno.
• Aumento in unità di colore nelle prime 4 settimane.
• Rapido aumento (fino a 10 EBC-U.) per i campioni
conservati a 45 °C con assorbitore di ossigeno.
• Aumento contenuto (fino a 6 – 7 EBC-U.) per i
campioni conservati a 22 °C e 6 °C
• Minime differenze con / senza assorbitore di O2
Variazione del colore
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

13. • Diminuzione graduale per tutte le serie.
• Diminuzione più rapida per i campioni
conservati ad alta temperatura.
• Valori di IBU leggermente maggiori per i
campioni con assorbitore di ossigeno
conservati a 45 °C.
• Differenze poco rilevanti a 22 °C e 6 °C.
Variazione IBU (International Bitterness Units)
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
IBU
(EBC)
Settimana
SAO - 45 °C
CAO - 45 °C
SAO - 22 °C
CAO - 22 °C
SAO - 6 °C
CAO - 6 °C
SAO t0
CAO t0
Dalgliesh, C. E. (1977). Flavour stability. Proceedings of
the European Brewery Convention Congress, 623–659.
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

14. Studio del processo di “ageing” con packaging attivo
Analita Tipo di marker Origine / Causa Andamento nel tempo Descrittore olfattivo
Etil acetato Variazione profilo olfattivo Lieviti Diminuzione / Aumento Mela / solvente
Furfurale Tempo / temperatura Reazione di Maillard Aumento Mandorla
Isoamil acetato Variazione profilo olfattivo Lieviti Diminuzione Banana, fruttato
Furfuril etil etere Tempo / temperatura Reazione di Maillard Aumento Solvente
Acetil furano Tempo / temperatura Reazione di Maillard Aumento Mandorla, dolce
Benzaldeide Ossidazione Degradazione di Strecker Aumento Caramello, Mandorle
Fenilacetaldeide Ossidazione Degradazione di Strecker Aumento Dolce, miele
2-Fenil etanolo Variazione profilo olfattivo Lieviti Diminuzione Floreale
Fenetil acetato Variazione profilo olfattivo Lieviti Diminuzione Miele, rosa
γ-Nonalattone Temperatura Formazione di esteri ciclici Aumento Fruttato, pesca, cocco
Damascenone Stress termico Degradazione della neoxantina Aumento Mela cotta, frutti rossi
Analisi gascromatografiche: HS-SPME-GCMS
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

15. 0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Fenetil acetato
SAO45C CAO45C SAO22C CAO22C SAO6C CAO6C SAO t0 CAO t0
Variazione del profilo olfattivo
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Feniletil alcol
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Etil acetato
0
1
2
3
4
5
6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Isoamil acetato

16. Effetto dello stress termico
Concentrazioni più elevate nei
campioni conservati a 45 °C
Concentrazioni simili nei campioni
conservati a 6 °C e 22 °C
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppb
Settimane
γ-Nonalattone
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppb
Settimane
Damascenone
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0

17. Effetto del tempo / temperatura di conservazione
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Furfuril etil etere
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Furfurale
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0

18. Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Furfuril etil etere
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Furfurale
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0
Effetto del tempo / temperatura di conservazione

19. Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Furfuril etil etere
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Furfurale
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Furfurale
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppm
Settimane
Furfuril etil etere
Effetto del tempo / temperatura di conservazione

20. Effetto dell’ossigeno
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppb
Settimane
Benzaldeide
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppb
Settimane
Fenilacetaldeide
SAO45C
CAO45C
SAO22C
CAO22C
SAO6C
CAO6C
SAO t0
CAO t0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ppb
Settimane
Benzaldeide
• Markers sensibili all’ossigeno
• Maggiori concentrazioni a T maggiori
• Differenze poco rilevanti fra campioni con / senza
assorbitore di ossigeno

21. • Panel esperto (4 giudici, sequenza randomizzata,
analisi in doppio)
• Analisi statistica: Tukey’s HSD test (Honestly
Significant Difference)
• Parametri discriminanti: freschezza, frutta matura,
solvente, caramello, dolce
• Markers derivanti dalla reazione di Maillard: a
note di vino, dolci, caramellose
• Furfuril-etil etere: solvente
0
1
2
3
4
5
6
7
8
frutta matura
freschezza
viscoso
astringente
alcolico
amaro
dolce
banana
caramello
cartone
solvente
cocco
mandorla
SAO45C CAO45C
SAO22C CAO22C
SAO6C CAO6C
Analisi sensoriale
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

22. Conclusioni e attività in programma
Analisi chimiche Analisi sensoriali
Differenze fra campioni con e senza assorbitore di O2:
• IBU e colore: minime differenze
• Markers di ossidazione: differenze non significative
• Analisi sensoriale: conferma risultati analisi chimiche
• Singolo studio (diversi tappi potrebbero avere performance
diverse).
• Alta variabilità dei parametri associata allo specifico processo di
birrificazione con rifermentazione in bottiglia.
• Processi ossidativi a monte
• Studio analogo in programma su campioni prodotti in birrificio
artigianale (Mezzavia) utilizzando imbottigliatrice isobarica.
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Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

23. Ringraziamenti
Porto Conte Ricerche
Panel analisi sensoriale (AIS)
Birrificio Mezzavia
Gruppo di lavoro
Dr. Luca Pretti
Dr. Antonio Santoru
Dr. Antonio Valentoni
Dr.ssa Manuela Sanna
Dr. Roberto Cappuccinelli
Work Package N°6 e 7
Studio delle fermentazioni e bench scale test; scale-up e studio dell’alta qualità.

24. Bibliografia
• Caballero, I., Blanco, C. A., & Porras, M. (2012). Iso-α-acids, bitterness and loss of beer quality during storage.
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• Kuchel, L., Brody, A. L., & Wicker, L. (2006). Oxygen and its reactions in beer. Packaging Technology and Science,
19(1), 25–32. https://doi.org/10.1002/pts.705
• Vanderhaegen, B., Neven, H., Verachtert, H., & Derdelinckx, G. (2006). The chemistry of beer aging - A critical
review. Food Chemistry, 95(3), 357–381. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.01.006
• Palamand, S. R., & Hardwick, W. A. (1969). Studies on the relative flavor importance of some beer constituents.
Technical Quarterly, 6(2), 117–127
• Pavel Čejka et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013 61 (51), 12670-12675
• Bamforth C.W. (2002). Standards of brewing – A practical approach to consistency and excellence. Brewers
publication
• Dalgliesh, C. E. (1977). Flavour stability. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, 623–659
• Saison, D., De Schutter, D. P., Uyttenhove, B., Delvaux, F., & Delvaux, F. R. (2009). Contribution of staling
compounds to the aged flavour of lager beer by studying their flavour thresholds. Food Chemistry, 114(4), 1206–
1215. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.10.078
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