4 conferencia ig y tecnologia adriana vivas unrc 27102015.compressed

Dra. Adriana B. Vivas
Departamento de Anatomía Animal
Facultad de Agronomía y Veterinaria
Universidad Nacional de Río Cuarto
ARGENTINA.
54-358-4676210. avivas@ayv.unrc.edu.ar

Institut für
Pharmakologie
und Toxikologie
IgY – Tecnología
Dra. Adriana Vivas
IgY – Tecnología

IgY-Technology
Huevos
Huevos
Huevos
avivas@ayv.unrc.edu.ar
¿Qué
es
IgY?

IgY-Technology avivas@ayv.unrc.edu.ar
Hieronymus Bosch

IgY-Tecnología
Bases Biológicas
IgY-Technology
Historia
Mantenimiento de gallinas
Inmunización
Título de Anticuerpo
Comparación de IgG e IgY
Distancias filogenéticas
Experimentos en UNRC

Historia

PrimeraPrimera
publicaciónpublicación
18931893

IgY-Technology
Experimento de Klemperer (1893)
Inmunizacines repetidas con Tetanus bouillon en cultivo
DespuésDespués de 4de 4 semanassemanas preparaciónpreparación de unde un extractoextracto dede yemayema dede huevohuevo
1 ml1 ml 0,5 ml0,5 ml 0,25 ml0,25 ml 0,0 ml0,0 ml
Administración al día siguiente de dosis letal de Tetanus bouillon en cultivo
vivosvivos muertosmuertos

IgY-Technology
Experimento de LeClaire et al. (2002)
Staphylococcal Enterotoxin B
IgY 10 mg/kg,
toxin 5 LD50 as
aerosol
InmunizacinesInmunizacines
repetidasrepetidas concon
Después de 8 semanas preparación de extracto de yema de huevo
IgY 20 min antes desafío con toxina
(5 LD50)
IgY 4 h después desafío de toxina
(5 LD50)
buffer 4 hs
después toxina
buffer 20 min antes
desafio toxina
vivos vivos muertos muertos
aerosol

Mantenimiento de los animalesMantenimiento de los animales

IgY-Technology
Batería comercial
Comparación de áreas disponibles para las gallinas
Equipo de mantenimiento

IgY-Technology
Colores de los huevos

W. Russell and R. Burch
“The Principles of Humane Experimental Techniqueˮ (1959)
ReemplazarReemplazarReemplazarReemplazar ReducirReducirReducirReducir RefinarRefinarRefinarRefinar

Base Biológica

Mamíferos
Circulación sanguínea
Leche materna
Inmunización
pasiva
IgY-Technology
Transferencia de anticuerpos
Aves
Circulación sanguínea
Inmunización
pasiva
Solo IgYSolo IgY

Transferencia de IgY desde
sangre a yema
V
C1
C2
C3
Conclusión – un Fc intacto y la región HEAL son
requeridas para el transporte de la Ig hacia la yema
Morrison et al. (2001) Mol. Immunol. 38:619-625
429-436
HEAL – His-Glu-Ala-Leu
HEAL es importante para
transporte hacia la yema
Amarillla zona expuestaAmarillla zona expuesta
sobre la superficie de Csobre la superficie de CHH22 ––
importante comoimportante como
reconocimiento del receptorreconocimiento del receptor
Fc-part
C3
C4

IgY-Technology
Transferencia de anticuerpos desde
sangre a yema
¿Por qué esperar 10 días
después de la 2da inmunización?

Tecnología Aviar
Viragen has signed a collaborative agreement with the Roslin Institute,
the renowned Scottish birthplace of the world’s most famous sheep,
Dolly. Viragen has obtained a worldwide exclusive license by the
Roslin Institute to their
Avian (bird) technology
to enable Viragen,...., to produce drugs, including monoclonal
antibodies to fight cancer and other life-threatening diseases, inside
the eggs of specially created transgenic chickens.
The development of avian technology promises a much faster, cost-
effective and virtually unlimited production process marked by the
chicken’s prolific egg laying capabilities.

Immunización

IgY-Technology
Recomendaciones para
la immunización de Gallinas
Antigen 0,10 – 1,00 mg sometimes 10 µg sufficient
Adjuvant FIA 0,10 – 0,25 ml usually i.m. or s.c.
Specol 0,5 ml s.c.
PCLS 250 µg preferably s.c.
FCA 0,10 – 0,25 ml only with weak immunogens
Injections
-volume 0,5 ml (-1 ml)
-intervals 4 – 8 weeks
-number 2 (or more if necessary)
-route i.m. or s.c.

IgY-Technology
Cantidad de antígeno y la producción de
anticuerpo
Development of Ab-titre of chickens after immunisation with
human albumin
200
250
300
5 mg
2.5 mg
1 mg
0.5 mg
i.v.
Antibodytitre
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
50
100
150
i.m.
i.m.
Time after immunisation (days)
Antibodytitre

Preparación del antígenoPreparación del antígeno

IgY-Technology
Inmunización
Clásica
Clásica

IgY-Technology
Vista Microscópica
Vista
Macroscópica
Daño tisular por el uso de adyuvante de
Freund‘s completo
Vista Microscópica
Después del tratamiento con y sin FCA

IgY-Technology
The use of gene-specific IgY antibodies for
drug target discovery
Gene gun
immunisation
W.-W. Zhang (2003) Drug Discovery Today 8,
364-371

IgY-Technology
Inmunización de
Genes
Genes

Desarrollo
de título de
de título de
Anticuerpos

IgY-Technology
Resultados de inmunizaciones sucesivas

Conventional keeping (Mouse
IgG1)
0.1
1
10
100
1000
Antibody-Titre(x1,000)
SPF-keeping (Mouse IgG1)
0.1
1
10
100
1000
Antibody-Titre(x1,000)
Desarrollo de título de anticuerpo y de concentración proteica deDesarrollo de título de anticuerpo y de concentración proteica de
yema de huevo bajo condiciones convencionales y SPFyema de huevo bajo condiciones convencionales y SPF
Chicken 1, Chicken 2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0.1
Time (d)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0.1
Time (d)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0
2
4
6
8
10
12
14
Time (d)
mgProtein/mlYolk
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0
2
4
6
8
10
12
14
Time (d)
mgProtein/mlYolk

IgY-Titre Development
2.0
2.5
3.0
Ch80
Ch81
Extinction
Ritmo septadiano
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0.0
0.5
1.0
1.5
Days after first immunisation
Extinction

Titulo de anticuerpo,
Avidez en aves y conejos

IgY-Technology
Tres modos diferentes
de reacción de Ac

IgY-Technology
Inmunización finalInmunización final

Comparación
de IgG e IgY
de IgG e IgY
Ac

IgY-Technology
Muestreo invasivo no-invasivo
Cantidad de Ac 200 mg/40 ml
sangre
50-100 mg/huevo
5-7 huevos/semana
Características del IgG versus IgY
IgG Mamífera IgY Aviar
Cantidad de Ac
/mes
200 mg appr. 1.000 – 2.800
mg
Interferencia con
IgG (Factores
reumatoideos
sí no
Interferencia con
Complemento
sí no
Protein A/G sí no
Hetero-Aglutininas sí no

IgY-Technology
Ensayo para proteína C reactiva (CRP)
Ensayo
Oveja
Ensayo Ave Factor reumatoideo
Ensayo
Oveja
Falso
positivo
Ensayo Ave
No falso positivo
Ensayo Oveja: Combinación de
dos Ac mamíferos
Ensayo ave: Combinación de un
nAc mamífero con uno de ave

SheepAssay
concentration False positive response
IgY-Technology
Ensayo de detección para Proteina C reactiva (CRP)
Chicken Assay
CRP-concentration
SheepAssay
CRP-concentration

Distancia filogenética

IgY-Technology
Phylogenetic Tree of Vertebrates
Placodermi
Chondrichthyes Osteichthyes
Amphibia Reptilia
Phylogenetic
difference
Amphibia Reptilia
Aves Mammalia
Chicken Human Rabbit

IgY-Technology
Diferencia Filogenética
Secuencia de la proteína Prion (AA 151-190)
RENMHRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITVKEHTVT
Bovina
Ovina
RENMYRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITVKQHTVT
RENMHRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITIKEHTVT
Mus
SENSARYPNR VYYRDYSSPV PQDVFVADCF NITVTEYSIG
Aves

Experimentos
IgY-Technology
Experimentos
UNRC

Doctorado en Ciencias Biológicas
“TECNOLOGÍA DE IGY ANTI-ESCHERICHIA COLI
APLICADA MEDIANTE COMPUESTOS HIDROGEL-
NANOTUBOS SOBRE CULTIVOS DE
ENTEROCITOS PORCINOS”
Doctoranda: Lic. Romina Bellingeri
Directora: Dra. Adriana Vivas
Co-Directora: Dra. Nora Gorla

Las inmunoglobulinas de yema de huevo (IgY) anti-Escherichia coli administradas
mediante nanocompuestos hidrogel-nanotubos afectan la actividad patógena de la
Escherichia coli en cultivos primarios de enterocitos porcinos.
Evaluar la capacidad protectora de la IgY anti-Escherichia coli administrada
mediante nanocompuestos en cultivo primario de enterocitos porcinos desafiados
con E. coli.

MATERIALES Y MÉTODOS
Muestra de IgY Proteínas (mg/g) IgY total (mg/g) IgY específica (título)
IgY anti-ETEC 686,2 ± 58,6 195,3 ± 1,7 * 1:100000 *
IgY control 556,1 ± 42,4 114,2 ± 3,4 1:1000
Media ± desvío estándar (n=3). * indica diferencias significativas (p < 0,05).
Concentración y título de la IgY por ELISA
RESULTADOS
Bellingeri et al. (2012)

MATERIALES Y
MÉTODOS
relación de los
monómeros
(AAm:AAc)
molaridad
acrilamida
(AAm)
molaridad
ac. acrílico
(AAc)
molaridad
bisacrilamida
(BAAm)
porcentaje
bisacrilamida
(%)
A (0,5:1 ) 0,7 1,4 0,008 0,38
B (1:1) 1,4 1,4 0,016 0,57
C (2:1) 2,8 1,4 0,032 0,76
Síntesis
Caracterización de los hidrogeles pH-sensibles
Caracterización
Espectroscopia infrarroja
transformada de Fourier

Porcentaje de hinchamiento a pH 2Porcentaje de hinchamiento a pH 2Liberación de la IgY desde los
hidrogeles
Liberación de la IgY desde los
hidrogeles
FGS: 1,13 % (0,03 mg IgY/ml.h)
FIS: 7,27 % (0,19 mg IgY/ml.h)
Incorporación de la IgY
en los hidrogeles
Composición
(AAm:AAc)
mg IgY/pastilla
de gel
A (0,5:1) 9,0 ± 0,1
B (1:1) 8,4 ± 1,1
C (2:1) 8,2 ± 0,3
Los datos son presentados como media ±
desvío estándar (n=3).Test de Kruskal-Wallis,
Infostat, 2009.

Funcionalización de nanotubos con
quitosano
Producto MWNT
Pureza >90%
Residuos <5%
Diámetro 10-30nm
Síntesis
Deposición química en fase
vapor
Caracterización de nanocompuestos
Síntesis
vapor
Sun Nanotech Co Ltd
Espectroscopia infrarroja
transformada de Fourier (FT-IR)

Porcentaje de
hinchamiento (%)
Contenido de agua
(%)
Hidrogel 96,69 ± 0,32a 2944,09 ± 299,81a
Hidrogel-NTC1% 96,76 ± 0,51ab 3035,70 ± 456,08ab
Hidrogel-NTC5% 97,21 ± 0,10b 3484,12 ± 135,24b
Los datos son presentados como media ± desvío estándar (n=3). Letras diferentes indican diferencias
significativas (p < 0,05). Hidrogeles incubados por 8 h. Test de Kruskal-Wallis, Infostat, 2009.
RESULTADOS

Estabilidad de la IgY encapsulada en nanocompuestos en fluidos gástricos simulados
Estabilidad en FGS y
FIS
Estabilidad en FGS y
FIS

Efecto de la IgY administrada mediante nanocompuestos
en la adhesión de ETEC

0 h 2 h 4 h 6 h
E. coli 7,56 ± 0,02 a 8,17 ± 0,05 a 8,89 ± 0,05 c 9,41 ± 0,04 c
E. coli + IgY 7,56 ± 0,04 a 8,13 ± 0,08 a 8,56 ± 0,04 a 8,65 ± 0,03 a
E. coli + IgY-hidrogel FGS 7,53 ± 0,02 a 8,12 ± 0,03 a 8,71 ± 0,04 ab 8,90 ± 0,03 ab
E. coli + IgYFGS 7,57 ± 0,06 a 8,18 ± 0,03 a 8,86 ± 0,03 c 9,28 ± 0,09 c
Los datos son presentados como media Log UFC/ml ± desvío estándar (n = 3). Letras diferentes indican diferencias significativas
(p < 0,05). Test de Kruskal-Wallis, Infostat, 2009.

Doctorado en Ciencia Animal
“Tecnología de anticuerpos aviarios administrados en
nanoestructuras aplicados a la sanidad porcina”
Mic. Fabrisio E. Alustiza
Laboratorio de Radioisótopos y de Biotecnología Animal
Facultad de Agronomía y Veterinaria U.N.R.C.

Datos ensayo in vivo en lechones en confinamiento.
GRUPOS DIARREA GANANCIA
PESO (g)
T° RECTAL (°C)
SI/NO Score Desh. Inicial Final
CONTROL – NO 0A 0A 222,5 a±115,6 37,8 a 38 b
CONTROL VEHICULO NO 0A 0A 244,8 a±87,5 37,7 a 38 b
UFC/ml)
CONTROL +
Solo desafío
SI 3 B 2 B -262,5 b±75,3 37,9 a 39a
RESULTADOSINOCULADAS
5ml(1010UFC/ml)
Solo desafío
TRATAMIENTO 1
IgY sin encapsular
6c
NO 0A 0A 250 a±167 37,8 a 38,3 b
SI 3B 2B -70c±60,5 37,9a 38,5b
TRATAMIENTO 2
IgY encapsulada
NO 0A 0A 387,5 a±111,5 37,7 a 38,4 b
Letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas (p<0.05) A, B Kruscal Wallis.
a, b , c ANOVA
Li,et al. 2009. Vet. Immunol. Immunopathol. 129:132-136.

Doctorado en Ciencias Biológicas
Tesis Doctoral
“TECNOLOGÍA DE ANTICUERPOS AVIARIOS Y
NANOTECNOLOGÍA APLICADA A LA SANIDAD BOVINA”
Doctoranda: Mic. Natalia Picco

Grupos (n=4)
Diarrea Grado de
deshidratación
Ganancia/pérdida de peso
(gramos)(SI/NO) Duración Consistencia Deposic/día
Inoculados
IgYanti-
ECET
Encapsul
1
No - - 1 Ninguno
+600
675,00 ± 35,36 b,c
2 +700
3
Si 2 días Líq/Semi-líq 2 Ninguno
-300
-525,00 ± 318,20 a,b
4 -1100
IgYcontrol
Encapsulad
1
No - - 1 Ninguno
+700
162,50 ± 573,55 a,b,c
2 +650
3 -200
4 -750
IgYanti-
ECETLibre
1
No - - 1 Ninguno
+300
50,00 ± 479,58 a,b,c
2 +600
3 -300
4 -400
ECET
4 -400
sinIgY
1
Si 3 días Líq/Semi-líq 3-5 Leve
-300
-612,50 ± 317,21 a
2 -500
3 -600
4 -1700
Control
1
No - - 1 Ninguno
+2000
1016,67 ± 275,38 c2 - 200
3 +1000
4 Si 2 días Líq/Semi-líq 2 Ninguno -1600 -1600,00 ± 0,00 a
• Vega et al., 2011.
• Ozpinar et al., 1996.
•Li et al., 2009.
Los datos se expresan como la media ± el desvío estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas (p= 0,0185).

En conjunto, los resultados de esta tesis indican que la
administración de IgY anti-ECET, mediante hidrogeles pH-sensibles,administración de IgY anti-ECET, mediante hidrogeles pH-sensibles,
resulta eficaz para controlar la diarrea por ECET y por K88.
La tecnología de IgY representa una solución alternativa
especialmente en aquellos establecimientos donde la diarrea
neonatal de los terneros causa importantes problemas económicos
y para lechones destetados.

Tecnología de IgY: sistema inmune asociado a mucosas
(MALT) y a intestino (GALT) en gallinas inmunizadas contra
Escherichia coli K8”.
Doctorando: Magister Lic. María Fernanda PERALTA
Directora: Dra. Adriana Beatriz VIVAS.
Codirectora: Dra María Das Gracia MIRANDA DANELLI.
CoDirector: Dr. Raúl D. MIAZZO.

POBLACIONES DE LI B
Sangre periférica BazoControl

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