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1. “AÑO DE LAS CUMBRES MUNDIALES EN EL PERU”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL
ESCUELA PROFESIONAL DE
AGROINDUSTRIAS
TEMA: Enzimas Inmovilizadas
CURSO: Biotecnologia.
PROFESOR: Cesar Torres Diaz

2. Introducción
Enzimas en disolución
Excelentes métodos (selectivos y sensibles) para la determinación
de sustratos, activadores, inhibidores.
 Las enzimas son solubles en medio acuoso y no pueden reutilizarse
 Estabilidad limitada. Preparación de disoluciones con frecuencia
Costes elevados
Inmovilización de enzimas
Proceso por el que se confina la enzima en un soporte adecuado para
obtener una forma insoluble de la misma que retiene su actividad catalítica
 Posibilidad de reutilizar la enzima
 Aumento de la estabilidad del preparado

3. Introducción
Aplicaciones Analíticas:
Diseño de biosensores
Reactores enzimáticos
Enzimas inmovilizados
Aplicaciones Médicas Aplicaciones
Tratamiento con
enzimas inmovilizados Industriales
Industria farmacéutica
Industria alimentaria
Industria química

4. Métodos de Inmovilización
Retención física Inmovilización química
Sin formación de enlaces covalentes Con formación de enlaces covalentes
Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión

5. Métodos de Inmovilización
Inmovilización por Adsorción
Interacción física, no específica (puentes de hidrógeno
interacciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones
de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.
 El método más sencillo
 De aplicación general
 Coste moderado
Uniones
Reversibles  Estabilidad limitada, se requiere un control
No covalentes
riguroso de las condiciones de trabajo para
evitar pérdidas de enzima por desorción.
Alumina, carbón activo, vidrio
Resinas cambiadoras

6. Métodos de Inmovilización
Retención física Inmovilización química
Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión

7. Métodos de Inmovilización
Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa
Formación de un polímero altamente entrecruzado
en presencia de la enzima. Esta queda atrapada en
los poros de la matriz polimérica formada.
 Se requiere controlar las condiciones de
polimerización para que no se produzcan
alteraciones en la molécula enzimática
 Se puede perder proteína lentamente
 Se pueden obtener membranas con
enzimas inmovilizadas
Gel de poliacrilamida
 De aplicación general Polímeros conductores

8. Métodos de Inmovilización
Atrapamiento por microencapsulación
Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-100 µm diámetro) dentro de
membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de
sustratos y productos pero no de la proteína.
 Se requieren elevadas
concentraciones de proteína
en disolución acuosa (10 mg/L)
Membrana polimérica obtenida
en un proceso de polimerización
en la interfase disolución orgánica-
acuosa

9. Métodos de Inmovilización
Retención física Inmovilización química
Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión

10. Métodos de Inmovilización
Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente
Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soporte
pero no entre las moléculas de enzima.
El tipo de soporte determina la química de la inmovilización
Soporte Enzima
Activación para obtener grupos funcionales reactivos
Grupo funcional Soporte Unión a través de las cadenas laterales
-CONH2 Poliacrilamida de los aminoácidos de la secuencia
polipeptidica de la proteína
-COOH Carboxymetilcelulosa
-NH2 Lisina -SH Cisteina
-NH2 Poliestireno, nylon
-OH-Ph Tirosina -OH Serina
-OH Celulosa, agarosa, sephadex -COOH Aspartato -Nimidazol Histidina
-Si(OH)3 Vidrio poroso Glutamato
Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivos
empleados en el proceso de inmovilización.
Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidor
competitivo durante el proceso de inmovilización.

11. Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
1. Método de la acyl-azida para unión a soporte con grupos ácido
Activación de soporte para obtener un grupo acil-azida
CH3OH NH2NH2
OCH2COOH OCH2COOCH3 OCH2CONHNH2
HCl
NaNO2
OCH2CONHNH2 OCH2CON3
HCl
Ataque nucleófilo a la acil-azida para dar lugar a un enlace amida
OCH2CON3 + NH2-ENZIMA OCH2CONH-ENZIMA
Son más reactivas las aminas primarias (lisina), aunque también
reaccionan residuos de cisteina, serina y tirosina.

12. Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
2. Método de la carbodiimida para unión a soporte con grupos ácido
R´ R
N NH
Activación del soporte para dar
COOH + C COOC un derivado acilisourea por reacción
N NH con carbodiimida
R R
Reacción con la enzima
R
NH NHR
COOC + NH2-ENZIMA CONH-ENZIMA + O C + H
NH NHR
R
Reaccionan lisina, tirosina, cisteina, serina y metionina
La selectividad de la reacción mejora si se añade un derivado de
N-hidroxisuccinimida durante la etapa de activación del soporte.
Se forma un ester de N-hidroxisuccinimida que forma selectivamente
enlace amida con residuos de Lisina

13. Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
3. Unión a través de enlace azo
Activación del soporte para obtener una sal de diazonio
NaNO2
R NH2 R N2 Cl
HCl
Unión a la enzima a través de un residuo de tirosina
HO
R N2 Cl + HO Enzima R N N
Enzima
 Inmovilización covalente selectiva a través de residuos de tirosina
 Evita entrecruzamiento enzima-enzima

14. Métodos de Inmovilización
Retención física Inmovilización química
Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión

15. Métodos de Inmovilización
Entrecruzamiento
Formación de enlaces covalentes intermoleculares
(entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte
 Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones
extremas de pH y temperatura
 Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el
acceso del sustrato al centro activo  Pérdidas de actividad tras
la inmovilización altas
Reactivos bifuncionales más utilizados
CHO O O
H H
(CH2)3 N2 N2 ICH2 C N (CH2)6 N C CH2I
CHO
Glutaraldehido Diazobenzidina Hexametileno-bis(iodoacetamida)
O O O
O
N O C (CH2)2 S S (CH2)2 C O N
O O
Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato

16. Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento
Ejemplo- Entrecruzamiento con glutaraldehido
N- Enzima
NH2-ENZIMA CHO CH
+ (CH2)3 (CH2)3
NH2-ENZIMA
CHO CH
N-Enzima
 Método simple y sencillo
 Se verifica en condiciones de pH neutro
 Para minimizar las pérdidas de actividad enzimática
se puede optar por un método de co-reticulado:
entrecruzamiento de la enzima con una proteína sin actividad
enzimática y rica en lisina, ej. albúmina bovina.

17. Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas difieren
de las de las enzimas en disolución debido a efectos del
material soporte y a cambios conformacionales de la enzima
Inmovilización Efectos sobre la estabilidad
Efectos en las propiedades cinéticas
1. Efectos en la Estabilidad
 Estabilización conformacional de la enzima
por uniones multipuntuales enzima-soporte
Mayor resistencia a
desactivación térmica o química
 Alteración del microentorno de la enzima
Por ejemplo mayor estabilidad en medios
orgánicos sobre soportes hidrofílicos

18. Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
2. Efectos de la inmovilización sobre las propiedades cinéticas
[S]superficie < [S]disolución
v′max [ S]
1
v=
K′M + [ S]
[S2]
[S]
[S1]
[S]dis. Los valores de KM y vmax para las enzimas
inmovilizadas son aparentes (K’M y v’max)
Capa de difusión Disolución
K´M suele ser mayor que KM
0 Distancia a la
Superficie del soporte

19. Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
Efectos de microentorno  Cambio del pH óptimo de la enzima
Quimotripsina/
portador catiónico Quimotripsina en disolución
100
% Quimotripsina/
Actividad portador aniónico
relativa
4 6 8 10
pH
Sobre soportes catiónicos: Sobre soportes aniónicos:
[OH-]superficie>[OH-]disolución [H+]superficie>[H+]disolución
pHsuperficie> pHdisolución pHsuperficie< pHdisolución

20. Aplicaciones Analíticas
SENSORES QUÍMICOS
Esquema general de un sensor químico
ELEMENTO DE
TRANSDUCTOR ELECTRÓNICA
RECONOCIMIENTO
Un sensor es un dispositivo que responde de forma directa, continua, rápida,
selectiva y reversible a los cambios de concentración de una especie química en
una muestra compleja, idealmente sin tratamiento previo de la misma.
Consta de un elemento de reconocimiento molecular (que produce una interacción
selectiva (específica) con el analito), en contacto físico con un transductor.

21. Elementos de reconocimiento molecular empleados en el desarrollo de sensores
Componentes de
reconocimiento molecular
Bióticos Abióticos
Bioafinidad Biocatalíticos
Cambiadores Ligandos Polímeros
Reactivos Nucleótidos Células líquidos neutros
Enzimas Molecularmente
inmunológicos ADN/ARN Tejidos
impresos
Membranas
sólidas

22. Transductores empleados en el desarrollo de sensores
analito
Proceso de reconocimiento selectivo
Transducción Energía
Piezoeléctricos
Electroquímicos Ópticos Térmicos
(de masa)
Amperométrico Potenciométrico Conductimétrico
Respuesta-Procesamiento de datos
Secuencia de procesos en la operación de un sensor químico.
Se resumen los distintos tipos de transductor que pueden ser utilizados

23. BIOSENSORES POTENCIOMÉTRICOS ENZIMÁTICOS: Sensor de Urea
Ureasa
(NH2)2CO 2 NH3 + CO2
Transductor Interferencias Tiempo de Rango de
(Electrodo selectivo) respuesta linealidad
Control pH
pH 1 min 5×10-5-10-3 M
(tampón dil.)
NH4+ K+ (Na+) 35 s 5×10-5-10-1 M
Capa de enzima
inmovilizada
Métodos de inmovilización Estabilidad
del enzima del sensor
Encapsulación en membranas
10 d.
de diálisis
Inclusión en gel de poliacrilamida 21 d.
Inclusión + enlace covalente
>30 d.
en ácido poliacrílico
Entrecruzamiento con albúmina
>60 d.
(glutaraldehido)

24. SENSORES ENZIMÁTICOS AMPEROMÉTRICOS.
Sensor de oxígeno de Clark (no enzimático)
Proceso catódico:
-600 3.25 O2 + 2 H+ + 2 e- H2O2
Eap./ mV i./ µA
Proceso anódico:
Electrolito interno (KCl)
2 Ag(s) + 2 Cl-(aq) 2AgCl(s) + 2 e-
Ánodo de Ag/AgCl
Cátodo de Pt Características de respuesta
Membrana de
Corriente de difusión estacionaria:
Polímero (PTFE)
ε D δ= espesor de la membrana
i = nFA C o* ε= porosidad de la memb.
δ q q = factor de tortuosidad
Tiempo de respuesta:
δ2 test ≈ 20 – 50 s
test. =2
(D/q)

25. SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS
1. Basados en el empleo de enzimas oxidasas
Señal (i/ µA) E
Eapl = cte SH2 + O2 S + H2O2
1. Medida del peróxido de hidrógeno generado
SH2 + E(FAD) E(FADH2) + S
transductor
E(FADH2) + O2 E(FAD) + H2O2
H2O2 O 2 + 2 H+ + 2 e- Reacción electródica
2. Empleo de un mediador de transferencia electrónica (Med)
Enzima (el O2 se sustituye por un aceptor de electrones no fisiológico)
inmovilizada
Medred E ox SH2 SH2
E(FAD)
e-
E(FADH2)
Medox Ered S S
Sensor Enzima y mediador Disolución
inmovilizados

26. SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS
2. Basados en el empleo de enzimas deshidrogenasas
E DIFICULTADES
SH2 + NAD
+
S + NADH + H+
Cinética lenta Selectividad
Mecanismo Estabilidad
electrodo
NADH NAD+ + 2e- + H+ complejo
Reproducibilidad
EMPLEO DE MEDIADORES DE TRANSFERENCIA ELECTRÓNICA
Medred NAD+ SH2 SH2
E
Medox NADH S S
Electrodo Disolución