1. 76
Terapia génica
J. M. Arán
I. EL GEN COMO FÁRMACO los tipos celulares, excepto esperma, óvulos y sus precur-
sores. La alteración genética de células somáticas afecta
sólo al paciente que se está tratando. Por el contrario, la
A. CONCEPTOS GENERALES modificación de las células germinales afectaría a todos
los descendientes del paciente en tratamiento, con todas
Durante las dos últimas décadas se han producido enor- las consecuencias éticas y morales que ello conlleva. Se
mes avances en el área de la biología molecular. Es muy han explorado diferentes tejidos somáticos para ensa-
probable que al final de esta década se haya secuenciado yos de terapia génica, como médula ósea, fibroblastos,
la mayor parte del genoma humano, generando una nueva músculo, piel, hígado, cerebro, etc. (fig. 76-1). La elección
base de datos sobre la cual se apoyará la medicina del fu- del tejido depende fundamentalmente de la enfermedad
turo. Paralelamente, se están descubriendo y analizando que debe corregirse.
con detalle los mecanismos moleculares y celulares de ac- Asimismo hay que diferenciar entre terapia génica ex
tuación de multitud de productos génicos cuya alteración vivo, en la que las células que deben modificarse son ex-
produce diferentes enfermedades. Ello, junto con avances traídas del paciente, manipuladas genéticamente y de-
técnicos, como la obtención de modelos animales transgé- vueltas a su propio organismo, y terapia génica in vivo,
nicos y knockout1 para determinadas enfermedades, está en la que las células son corregidas in situ, mediante téc-
revolucionando no sólo el área del diagnóstico sino tam- nicas esencialmente no invasivas. La terapia génica ex
bién el desarrollo de diversas formas de tratamiento. Como vivo es un procedimiento complicado de aplicación limi-
consecuencia, se está dando prioridad a la puesta a punto tada a un pequeño número de pacientes y sólo podrá
de nuevas modalidades terapéuticas encaminadas a com- realizarse si la reimplantación del tejido somático modi-
plementar los métodos farmacológicos tradicionales para ficado es factible. Aunque todavía se encuentra en sus fa-
lograr tratamientos más efectivos. ses iniciales de desarrollo, la terapia génica in vivo, se-
La terapia génica es una nueva forma de medicina mo- mejante a los tratamientos farmacológicos actuales, es la
lecular que tendrá un enorme impacto en el área de la sa- que alberga mayores posibilidades para el futuro.
lud humana durante el próximo siglo. De forma genérica,
la terapia génica se puede definir como la introducción
de un gen en determinadas células o tejidos con el fin de B. BIOMOLÉCULAS TERAPÉUTICAS
que su expresión pueda corregir la deficiencia causada
por la pérdida o alteración de un producto génico esen- El principal requisito para el desarrollo de terapias gé-
cial. En este sentido, la terapia génica se puede incluir nicas es la identificación y caracterización de secuencias
dentro de un concepto más general: la transferencia gé- nucleotídicas que podrían estar directa o indirectamente
nica, en la cual es posible que el propósito del gen trans- implicadas en procesos patológicos. Ello incluye tanto ge-
ferido no sea el beneficio terapéutico, sino el estudio o nes para el tratamiento de enfermedades genéticas espe-
análisis biológico de las células a las que se transfiere. cíficas, como secuencias utilizadas para conferir nuevas
Actualmente, los ensayos de terapia génica se realizan propiedades a células, para el tratamiento de enferme-
solamente en células somáticas, que comprenden todos dades adquiridas y del cáncer.
1
1. Secuencias codificadoras de proteínas
Se denominan animales «transgénicos» a aquellos generados por introduc-
ción al azar de secuencias de ADN recombinante en su línea germinal. Dichas se- Las biomoléculas más utilizadas para terapia génica
cuencias se transmiten y expresan en los descendientes del animal manipulado
obedeciendo las leyes mendelianas. Los animales knockout se producen al intro- son copias de ADN complementario obtenidas a partir
ducir mutaciones en regiones definidas del ADN de su línea germinal mediante
recombinación homóloga. Dicho procedimiento anula o altera la expresión de los
de ARN mensajeros. Éstos, a su vez, provienen de genes
productos génicos provenientes de genes localizados en las regiones mutadas. que codifican proteínas de interés terapéutico. Las copias
1273

2. 1274 Farmacología humana
Tejidos diana, enfermedades y vectores utilizados Rutas potenciales
de administración
Sistema nervioso central
Cáncer
Vectores retrovíricos
Intracerebral
Vías respiratorias
Fibrosis quística, enfisema familiar
y cáncer de pulmón
Intranasal
Vectores adenovíricos,
retrovíricos, basados en el
adenovirus asociado y
liposomas
Otros órganos
Cáncer y enfermedades
genéticas como
hipercolesterolemia
Vectores retrovíricos
Intrapulmonar
y adenovíricos
Subcutánea
Células
hemopoyéticas
Cáncer, sida y
enfermedades
genéticas
Intrahepática
Vectores retrovíricos
Intravenosa
Intraperitoneal
Músculo
Intratumoral
Inmunización
ADN purificado
Sistema vascular Intramuscular
Reestenosis y aterosclerosis
Vectores adenovíricos,
retrovíricos y liposomas
Fig. 76-1. El cuerpo humano como diana para tratamientos de terapia génica. La amplia definición de terapia génica comprende
el tratamiento potencial de cualquier tipo de enfermedad humana (enfermedades genéticas, cáncer, enfermedades cardiovascula-
res y enfermedades infecciosas) mediante modificación genética de células del organismo con el fin de prevenir o eliminar la en-
fermedad.
de ADN complementario se insertan dentro de vectores, promotor, como la señal de terminación de la transcrip-
que son elementos genéticos que facilitan la transferen- ción y otros elementos controladores de la actividad gé-
cia y la expresión de secuencias eucariotas a las células nica. Ocasionalmente se pueden utilizar incluso largas
diana. También se usan los llamados minigenes, genes secuencias de ADN genómico que contienen un gen com-
normales a los que se les ha eliminado todos sus intrones pleto, incluyendo zonas reguladoras, exones (secuencias
(secuencias no codificadoras), pero conservan tanto el codificadoras) e intrones.

3. 76. Terapia génica 1275
2. Sondas antisentido virales, todo ello con el fin de prevenir los procesos de in-
fección o de replicación vírica. Estudios in vitro con lí-
La tecnología de las sondas antisentido se basa en la uti- neas celulares de linfocitos T han posibilitado el inicio de
lización de oligodesoxinucleótidos (ODN) de pequeño ta- ensayos clínicos que utilizan sondas antisentido dirigidas
maño para inhibir la expresión génica. La inhibición de la contra diferentes secuencias reguladoras, estructurales y
expresión tiene lugar por hibridación de los ODN anti- funcionales del virus del sida.
sentido a la cadena complementaria codificadora de ARN Finalmente, se están iniciando ensayos preclínicos que
en el interior de la célula. A la interacción entre la sonda emplean ODN antisentido para el tratamiento de neuro-
antisentido y el ARN se aplican las reglas de apareamiento patías, como la gliosis astrocítica, para la que se han di-
de bases de Watson-Crick, lo cual permite diseñar ODN señado sondas antisentido dirigidas contra secuencias co-
dirigidos a cualquier gen de interés. En teoría, una sonda dificadoras de la proteína glial fibrilar ácida (GFAP), que
antisentido de 15 nucleótidos de longitud tiene suficiente se encuentra sobreexpresada.
especificidad para interaccionar con un determinado gen
dentro del genoma humano completo. Debido principal-
3. ADN triplex
mente a su reducido tamaño, las sondas antisentido suelen
sintetizarse químicamente y se administran como un fár- Se denomina ADN triplex a la asociación colineal de
maco convencional, aunque también se ha examinado su tres cadenas de ODN. Ello se produce cuando una ca-
expresión in vivo mediante vectores víricos o plásmidos. dena de ODN se une a la hendidura o canal ancho de una
De forma análoga a lo que sucede con los fármacos, doble hélice de ADN.
los ODN antisentido tienen que superar una serie de obs- La tecnología del ADN triplex, paralelamente a la de
táculos para alcanzar su diana sin perder potencia. Ini- las sondas antisentido, tiene un gran potencial terapéu-
cialmente tienen que atravesar membranas celulares para tico como modulador génico. La unión de un ODN for-
alcanzar el citoplasma o el núcleo. Una vez dentro de la mador de ADN triplex a un gen diana puede bloquear la
célula, han de mostrarse resistentes a la degradación por transcripción del ARN, lo cual anularía su expresión. La
nucleasas. Finalmente, tienen que ser capaces de unirse diferencia de dicha técnica con las sondas antisentido ra-
específicamente y con gran afinidad al ARN diana para dica en que en el primer caso el ODN se une directamente
inhibir su expresión. Para superar estas barreras, se están al gen en lugar de unirse a su ARN mensajero. Como el
estudiando modificaciones químicas en la estructura de ADN triplex actúa a nivel transcripcional, en teoría sólo
los ODN con el fin de aumentar su actividad biológica. son necesarias unas pocas moléculas de ODN para pro-
La primera generación de modificaciones en la cadena de ducir un efecto inhibidor.
ODN con resultados positivos fue el cambio de los enla- El ODN formador de ADN triplex puede componerse
ces fosfodiéster de la cadena por enlaces fosforotioato o de polipurinas o polipirimidinas y se une a la cadena rica
metilfosfonato. Ello representó un incremento en esta- en purinas de la doble hélice mediante puentes de hidró-
bilidad, pero no en afinidad. Sin embargo, avances re- geno. La especificidad de unión resulta de la comple-
cientes en la química de los desoxinucleótidos modifica- mentariedad de secuencia entre la región polipurínica de
dos están produciendo nuevos análogos con las deseadas una de las hélices de ADN y el ODN formador de triplex.
propiedades de estabilidad, afinidad y permeación para Se han de superar varias limitaciones antes que se
su uso terapéutico. pueda aplicar dicha tecnología para terapia génica. Ac-
Actualmente se está evaluando el potencial de la tec- tualmente, las regiones idóneas para la formación de
nología antisentido para el tratamiento del cáncer o para ADN triplex tienen que ser homopurínicas en una de las
la supresión de determinados elementos endógenos: re- cadenas. Al igual que para las sondas antisentido, la afi-
ceptores de mediadores celulares (p. ej., de neurotrans- nidad de unión y estabilidad de los ODN formadores de
misores), enzimas, etc. Resultados satisfactorios obteni- triplex son factores importantes para determinar su efi-
dos en modelos animales han permitido iniciar ensayos cacia. Además, la unión de los ODN a sus regiones diana
clínicos con ODN antisentido dirigidos contra el oncogén es transitoria, por lo cual la inhibición del gen diana es
c-myb para eliminar las células tumorales presentes en la temporal. Sin embargo, se han realizado con éxito estu-
médula ósea de pacientes con leucemia mieloide crónica. dios experimentales preliminares, como la inhibición de
Asimismo, existen ensayos clínicos que utilizan sondas la expresión del oncogén HER-2/neu por formación de
antisentido para inhibir la expresión de importantes on- un triplex dentro de una región polipurínica situada en su
cogenes, como K-ras, c-fos y c-myc, en varias neoplasias promotor. Se ha propuesto también a los ODN forma-
como el melanoma, el carcinoma de pulmón, el cáncer de dores de triplex como candidatos para la inhibición de la
mama, etc. expresión del virus del sida.
Los ODN antisentido se han explorado también como
agentes antivirales. Los retrovirus, como el virus del sida,
4. Ribozimas
son susceptibles a dicho tratamiento, que pretende evitar
la transcripción inversa de su ARN genómico, o la tra- Los ribozimas son moléculas de ARN con capacidad
ducción de ARN mensajeros codificadores de proteínas de catalizar la escisión específica de otras moléculas de

4. 1276 Farmacología humana
ARN. La especificidad de secuencia del ribozima se de- producir el efecto inhibidor deseado. Asimismo, los ri-
termina por su capacidad para aparearse o hibridarse con bozimas deben elegirse de manera que hibriden una re-
nucleótidos complementarios de la molécula de ARN gión accesible de ARN mensajero y el ribozima expre-
diana cerca del sitio de escisión. Dicha escisión produce sado debe mantener capacidad catalítica suficiente para
un ARN mensajero incompleto e inestable, lo cual inhibe escindir el ARN mensajero antes que éste sea traducido.
la expresión proteica. Muy recientemente se ha indicado una nueva aplicación
En teoría, los ribozimas se pueden sintetizar o mani- para introducir nuevas funciones o corregir defectos en
pular para actuar sobre cualquier molécula de ARN com- un gen determinado a partir de la capacidad de corte y
prendida en el conjunto del ARN celular. Por lo tanto, empalme o splicing de los ribozimas.
cualquier ARN mensajero que codifique una proteína
asociada a una determinada enfermedad puede escin-
dirse selectivamente mediante ribozimas expresados a C. ESTRATEGIAS Y MÉTODOS
partir de un vector de transferencia génica adecuado. De- DE TRANSFERENCIA GÉNICA
bido a su flexibilidad de diseño y su extraordinaria espe-
cificidad de secuencia, los ribozimas llamados hammer- Cuando se ha aislado y caracterizado un gen asociado
head y hairpin podrían resultar muy útiles como agentes a una enfermedad concreta, se puede iniciar el estudio y
terapéuticos. desarrollo de métodos terapéuticos que permitan la ad-
Los ribozimas tienen varias ventajas respecto a las pro- ministración segura y eficaz de su secuencia nucleotídica
teínas cuando se considera su uso en aplicaciones de te- a las células afectadas. Para lograr introducir y expresar
rapia génica: a) el ARN es menos susceptible a provocar los genes en las células o tejidos diana se ha desarrollado
una respuesta inmunitaria que la expresión de una pro- una gran variedad de vehículos de transferencia o vecto-
teína exógena o modificada; b) los ribozimas son molé- res. Actualmente, no existe ningún vector de terapia gé-
culas de pequeño tamaño, lo que facilita su inclusión en nica que resulte idóneo para todas las enfermedades. Ca-
los vectores utilizados para terapia génica, y c) en un único da vector tiene sus ventajas e inconvenientes, por lo que
vector se pueden insertar incluso varios ribozimas dirigi- la elección de un determinado vector dependerá de las
dos contra diferentes regiones de una molécula de ARN características propias del tejido y de la enfermedad que
mensajero, o contra diferentes moléculas de ARN men- deba tratarse, de si la terapia génica es ex vivo o in vivo,
sajero, lo cual puede ser útil para actuar sobre los distin- y de que la expresión del producto génico pueda ser tran-
tos dominios de un genoma viral (con el fin de contra- sitoria o haya de ser permanente. Los vectores víricos son
rrestar mutaciones en dicho genoma, que supriman el muy útiles para alcanzar niveles terapéuticos del pro-
efecto terapéutico de un solo ribozima), o sobre múlti- ducto génico deseado. Asimismo, métodos físicos y quí-
ples mediadores de un determinado estado patológico. micos de transferencia génica muy diversos, como la in-
Sin embargo, existen también varios obstáculos en di- yección directa de ADN, complejos lípido-ADN, etc.,
cha tecnología que hay que resolver antes que pueda apli- pueden resultar adecuados si la expresión del gen tera-
carse con garantías de éxito. Para suministrar los ribozi- péutico es suficiente durante un período transitorio (ta-
mas a partir de vehículos de expresión hay que diseñar bla 76-1).
las unidades de transcripción con el fin de que se sinteti- Aunque el ADN puede ser transferido eficientemente
cen las moléculas de ribozima en cantidad suficiente para de forma transitoria, la proporción de células capaces de
Tabla 76-1. Propiedades de los sistemas actuales de transferencia génica
Vectores víricos Vectores no víricos
Herpes Conjugados ADN
Características Retrovíricos Adenovíricos simple Adenoasociados moleculares purificado Liposomas
Capacidad máxima (kb) 8 kb 7-8 kb 25-30 kb 4,5 kb No restrin- No restrin- No restrin-
gido gido gido
Título (log10 [células 6-7 8-11 6-8 8-10 — — —
transducidas/ml])
Integración Sí No No Sí, pero con baja Rara Rara Rara
frecuencia
Transmisión a células No Sí Sí Sí Sí Sí Sí
quiescentes
Expresión estable Sí Transitoria Transitoria ? Transitoria Transitoria Transitoria
Expresión de proteínas No Sí Sí Sí No No No
víricas
Administración in vivo Rara Sí Sí Sí ? Sí Sí

5. 76. Terapia génica 1277
retener las secuencias transferidas de manera estable y Retrovirus (9,8 kb)
(Virus de la leucemia murina)
permanente es extremadamente baja (0,1-0,01 %), con
independencia del sistema de transferencia génica em- LTR y LTR
pleado, excepto en la transferencia mediada por vectores
retrovíricos que puede ser extraordinariamente eficiente gag pol env
(100 %) para algunos tipos celulares. Por lo tanto, es ne- Adenovirus (36 kb)
cesario emplear métodos para identificar, aislar y hacer
E1A E1B L1 E3
crecer las pocas células que se han transferido satisfacto-
riamente dentro de la población celular tratada. Si el gen
y
transferido expresa un fenotipo dominante (proteína de E2B E2A E4
membrana, oncogén, etc.), es posible aislar las células Virus del herpes simple (152 kb)
transferidas directamente. Sin embargo, la mayoría de los a b b' a' c' c a
genes presenta un fenotipo no dominante y se completa
con genes que tienen las características anteriormente
mencionadas, llamados marcadores selectivos dominan- y y y
tes, que codifican proteínas cuya expresión permite a las Adenovirus asociado (4,7 kb)
células favorecer un proceso de selección. Dichos mar-
cadores se introducen de manera que estén físicamente ITR ITR
ligados a la secuencia del ADN, de interés al diseñar el
vector. Ejemplos comunes de marcadores selectivos do- y REP CAP
minantes son el gen bacteriano neo, que codifica la en-
zima neomicina-fosfotransferasa y, por lo tanto, confiere Fig. 76-2. Estructura genómica de los principales virus utili-
resistencia al antibiótico neomicina y sus análogos, y el zados para la construcción de vectores víricos de transferencia
génica. En cada caso se muestra la secuencia de ADN del ge-
gen MDR1, que produce un fenotipo de resistencia cru-
noma vírico, que para retrovirus y adenovirus asociados es la
zada a múltiples fármacos citotóxicos empleados para
forma provírica integrada. Se indican también las característi-
quimioterapia antineoplásica (v. cap. 62). cas relevantes de cada sistema, como la secuencia y, necesaria
para la encapsidación de los genomas víricos. Asimismo se in-
1. Vectores víricos dica el tamaño de cada genoma y las principales regiones codi-
ficadoras de proteínas víricas (excepto para el virus del herpes
La capacidad de algunos virus de ADN y ARN de pro- simple). Retrovirus: las regiones LTR se denominan repeticio-
ducir transformaciones tumorales mediante la introduc- nes terminales largas y contienen secuencias promotoras, se-
ción de su material genético a células hospedadoras fue cuencias de poliadenilación y secuencias necesarias para la in-
la que condujo a su utilización como vectores para trans- tegración. Adenovirus: las regiones E1A, E1B y E3 se pueden
eliminar o sustituir por un gen recombinante de interés para for-
ferencia génica. La lista de virus que se han estudiado
mar los vectores adenovíricos. Virus del herpes simple: las re-
como vectores es considerable e incluye papovirus, ade-
giones a, b y c son repeticiones que se encuentran invertidas en
novirus, virus de la vacuna, adenovirus asociados, virus a', b' y c'. Adenovirus asociados: las regiones ITR, llamadas re-
del herpes, retrovirus, etc. peticiones terminales invertidas, flanquean al gen de interés en
vectores ba-
1.1. Vectores retrovíricos
brana celular. Seguidamente, el complejo interiorizado de proteína-
Los vectores víricos más estudiados provienen de los
ARN atraviesa el citoplasma y entra en el núcleo celular. Durante su
retrovirus. Los retrovirus más estudiados son los oncovi- migración se inicia la compleja reacción intermolecular de la transcrip-
rus sencillos, como el virus del sarcoma de Rous (VSR) tasa inversa que acaba en el interior del núcleo con la generación de
y el virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV). una copia de ADN de doble cadena a partir del ARN original. Final-
Cada partícula retrovírica (virión) contiene dos copias de mente, el ADN producido se inserta inespecíficamente en un cromo-
soma de la célula huésped por acción de la enzima integrasa. La se-
ARN genómico vírico empaquetadas dentro de un com- cuencia integrada de ADN proviniente del ARN vírico se denomina
plejo proteico que, a su vez, está rodeado por una en- provirus (fig. 76-2).
vuelta proteolipídica. La propiedad más interesante de La producción de retrovirus defectuosos se lleva a cabo mediante un
los retrovirus es la producción de transcriptasa inversa, sistema de dos componentes: la línea celular de empaquetamiento y el
propio vector retrovírico (fig. 76-3). Los vectores retrovíricos se han
una polimerasa de ADN dependiente de ARN. La ma-
diseñado a partir de la secuencia de ADN del provirus, en la cual se
yoría de ensayos clínicos de terapia génica utilizan ac- conservan solamente elementos reguladores llamados repeticiones ter-
tualmente retrovirus murinos defectuosos, incapaces de minales largas (LTR), que incluyen la región promotora y la señal de
replicación. poliadenilación, mediadoras del inicio y el final de la transcripción res-
pectivamente, la señal de empaquetamiento (y) y señales necesarias para
El ciclo vital del retrovirus empieza por su unión a un receptor es- el inicio de la transcripción inversa. Dichos elementos comprenden so-
pecífico de la célula huésped o diana, mediada por la proteína de su en- lamente el 20 % del genoma retrovírico. Los genes víricos gag (codifica
vuelta (v. fig. 71-4). Dependiendo del tipo de retrovirus, el virión entra las proteínas estructurales), pol (codifica la transcriptasa inversa, la in-
en la célula por endocitosis o mediante fusión directa del virus y la mem- tegrasa y la proteasa vírica) y env (codifica la glucoproteína de la en-

6. 1278 Farmacología humana
LTR y LTR
gag pol env
LTR y LTR
gag pol env
Inserción génica Transfección
LTR y LTR
gen
terapéutico
Línea celular empaquetadora
Línea celular productora
de retrovirus recombinantes
Fig. 76-3. Generación de retrovirus recombinantes para transferencia génica. Los vectores retrovíricos se obtienen al sustituir to-
das las secuencias codificadoras del genoma de un retrovirus, por secuencias recombinantes de interés terapéutico. Dichos vecto-
res se introducen en líneas celulares empaquetadoras, manipuladas para expresar constitutivamente los genes gag, pol y env. Las
células resultantes, llamadas productoras, son capaces de encapsidar el ARN derivado de los vectores retrovíricos produciendo vi-
riones recombinantes sin capacidad de replicación. Éstos se recogen en el sobrenadante celular y servirán como vehículos eficien-
tes de transferencia y expresión de los genes de interés.
vuelta vírica) se pueden eliminar sin perjudicar la producción de retro- diferenciadas o fibras musculares. La eficiencia de trans-
virus recombinantes. En lugar de la secuencia de gag, pol y env se inserta ducción puede mejorarse significativamente en algunos
la secuencia del gen o genes que se desea expresar y se obtiene un pro-
virus defectuoso que contiene el gen recombinante de interés. tejidos, como la médula ósea o el hígado, cuando se provo-
Las líneas celulares de empaquetamiento (habitualmente, fibro- ca la división celular mediante cultivos ex vivo o mediante
blastos murinos) se han manipulado para sintetizar constitutivamente tratamiento con fármacos (5-fluorouracilo en médula
(de manera permanente y no regulada) las proteínas víricas proceden- ósea y tetracloruro de carbono en hígado). La concen-
tes de los genes gag, pol y env, y producen viriones vacíos. Asimismo,
en dichas secuencias víricas se han eliminado o modificado elementos
tración de partículas víricas recombinantes en los sobre-
como la señal de empaquetamiento con el fin de disminuir en lo posi- nadantes de las líneas celulares productoras es también
ble las zonas de homología con el vector retrovírico, que podrían re- un factor limitante. Los retrovirus recombinantes son re-
combinarse para dar lugar a virus capaces de replicación. Las partícu- lativamente lábiles en comparación con otros virus. Se ha
las víricas recombinantes ensambladas por la línea celular productora intentado purificar o concentrar las partículas, aunque
(definida como la línea celular de empaquetamiento a la que se ha trans-
fectado el vector retrovírico) ya pueden utilizarse para transferir las ello ha dado como resultado una pérdida considerable de
secuencias que componen el vector a otras células diana. Debido a la capacidad de transducción. Los títulos habituales de 105
naturaleza defectuosa del vector retrovírico, dicho procedimiento de a 106 partículas víricas/ml de sobrenadante a veces resul-
transferencia génica se denomina transducción. Análogamente, el tér- tan insuficientes, en especial para la terapia génica in vivo,
mino «infección» se reserva para virus capaces de replicación. Los
viriones recombinantes se acumulan en el medio de cultivo de la línea
ya que los viriones recombinantes son inactivados rápi-
celular productora a concentraciones que pueden superar las 106 partí- damente por el sistema del complemento. Otra limitación
culas/ml. Dichos viriones pueden emplearse directamente para trans- de los vectores retrovíricos está relacionada con el ta-
ducir otras líneas celulares o cultivos primarios. maño de la secuencia que debe insertarse, que no debe
superar las 8 kb para que pueda ser empaquetada eficaz-
Las principales ventajas de los vectores retrovíricos mente y no influya negativamente en el título obtenido.
como vehículos de transferencia son su extraordinaria efi- Ello implica que algunas secuencias de ADN comple-
ciencia, que les permite transducir cerca del 100 % de las mentario como la del gen de la distrofina, de 14 kb, no
células diana, y su capacidad para integrar de manera es- puedan incluirse en vectores retrovíricos.
table en los cromosomas celulares el material genético Finalmente hay que considerar también cuestiones de
que contienen. Sin embargo, existen varias limitaciones seguridad en torno al uso clínico de los vectores retro-
que dificultan el uso de los vectores retrovíricos como ve- víricos. Existe la posibilidad de que se generen virus
hículos generales de transferencia génica. Para que tenga «silvestres» con capacidad de replicación mediante re-
lugar la integración del provirus recombinante es nece- combinación homóloga de secuencias retrovíricas, prin-
sario que la célula diana se replique. Por lo tanto, no es cipalmente en las líneas celulares productoras. Además,
posible transducir a células posmitóticas, como neuronas la integración aleatoria del provirus recombinante en el

7. 76. Terapia génica 1279
genoma celular podría provocar la activación de oncoge- y b) producen inducción de una respuesta inmunitaria
nes o la inactivación de genes supresores de tumores. Sin fuerte en las células hospedadoras, contra pequeñas can-
embargo, estudios de toxicidad en modelos animales fi- tidades de proteínas víricas sintetizadas por el vector. Re-
nalizados recientemente han indicado que no hay riesgo cientemente se ha obtenido la última generación de vec-
significativo en el uso de los sistemas retrovíricos actua- tores adenovíricos, con una mutación termosensible en la
les para terapia génica. región E2A, lo cual los hace menos inmunogénicos.
1.2. Vectores adenovíricos 1.3. Vectores basados en el virus del herpes
Los adenovirus son patógenos débiles que afectan La compleja capacidad codificadora del genoma del
principalmente las vías respiratorias y no se han asociado herpes incluye, además de proteínas reguladoras y es-
a enfermedades malignas. Cada partícula vírica contiene tructurales, proteínas implicadas en el metabolismo de
una molécula de ADN de doble cadena de tamaño con- los ácidos nucleicos. Por ejemplo, el virus del herpes sim-
siderable (36 kb) y entra en las células mediante endoci- ple 1 (VHS-1) de 152 kb es el más utilizado para la cons-
tosis mediada por receptores, seguido de la rotura del trucción de vectores y codifica 72 proteínas diferentes.
correspondiente endosoma y migración del genoma ade- Después de la infección celular y la migración del genoma
novírico al núcleo donde permanece en forma extracro- vírico al núcleo de la célula hospedadora, los virus del
mosómica. El genoma adenovírico comprende una serie herpes pueden entrar en un período de latencia y man-
de genes que se expresan al principio de la infección y tenerse como episomas circulares, o comenzar un ciclo
codifican proteínas reguladoras, y una serie de genes tar- de replicación lítica con producción de viriones y lisis ce-
díos, que codifican proteínas estructurales (fig. 76-2). lular.
Cuando el genoma vírico entra en la célula, se activan los
genes que se expresan inicialmente (E1). Ellos a su vez Los virus del herpes simple 1 son virus neurotróficos, por lo que vec-
tores derivados de dichos virus pueden proporcionar una estrategia
activan otros genes reguladores importantes E2, E3 y E4. única para obtener la persistencia del ADN recombinante en células
En la segunda fase de replicación se expresan los genes del sistema nervioso central.
tardíos (L1-L5), produciendo más virus que finalmente Se han desarrollado dos estrategias para la construcción de vecto-
provocan la muerte de la célula. El actual conocimiento res basados en el virus del herpes simple 1, que pueden expresar genes
de la genética molecular del adenovirus posibilita su ma- exógenos en células huésped. En la primera estrategia, similar a la pro-
ducción de adenovirus, los vectores víricos se generan mediante re-
nipulación como vehículo para terapia génica. combinación entre un virus receptor y un plásmido donante que incluye
una secuencia homóloga a la del virus receptor. En la segunda estrate-
La construcción de vectores adenovíricos se realiza mediante re- gia, los minivirus recombinantes se producen por complementación de
combinación homóloga entre ADN genómico del adenovirus y un plás- un virus defectivo con capacidad de replicación, con un plásmido que
mido que contiene el gen de interés flanqueado por una región de se- contiene un origen de replicación y una señal de empaquetamiento ví-
cuencia idéntica a la del adenovirus. Los vectores adenovíricos actuales ricos más el transgén de interés. Sin embargo, es difícil generar stocks
derivan de los serotipos humanos 2 y 5, en los cuales se ha eliminado o de virus del herpes recombinantes completamente incapaces de repli-
alterado la región esencial E1 para evitar la replicación viral. Dicha re- carse, debido a la compleja regulación que presenta su replicación.
gión se sustituye por el conjunto promotor/gen de interés. La recombi- Las ventajas de los vectores basados en el virus del herpes simple
nación ocurre después de transfectar el plásmido junto con el ADN ví- comprenden la capacidad de transducir gran variedad de tipos celula-
rico a la línea celular humana 293, insertándose el gen de interés en res, la capacidad de transducir células quiescentes, la disponibilidad de
el genoma del adenovirus. Las células 293, que expresan constitutiva- stocks de título alto (105-109 partículas/ml) y la capacidad de incorpo-
mente la región E1, sirven como fuente de proteínas E1 en el ensam- rar secuencias transgénicas grandes (hasta 30 kb).
blaje de las partículas víricas recombinantes. La mayoría de vectores
adenovíricos actuales contiene también una deleción en la región no
esencial E3, lo cual permite acomodar fragmentos de ADN recombi- Algunos vectores derivados del virus del herpes sim-
nante mayores. ple 1 se han utilizado satisfactoriamente para expresar ge-
nes en cerebro de ratón mediante inyección estereotá-
Los vectores adenovíricos ofrecen varias ventajas sobre xica. Sin embargo, el número de células transducidas es
otros métodos de transferencia génica: a) pueden infectar generalmente bajo, las células transducidas se encuentran
la mayoría de tipos celulares de mamífero; b) pueden pro- localizadas en el lugar de la inyección y la expresión trans-
ducirse a títulos elevados (³ 1012 partículas/ml) mediante génica es transitoria. Además, otras limitaciones como la
su propagación en células 293 y su posterior purificación citotoxicidad y la moderada o completa eliminación de la
en gradientes de cloruro de cesio, por lo cual resultan ade- expresión transgénica, mediadas por el propio genoma
cuados para terapia génica in vivo; c) a diferencia de los del virus, han impedido que la expresión de los genes de
vectores retrovíricos, son capaces de transducir eficiente- interés a largo plazo sea elevada y estable. Por lo tanto,
mente células quiescentes como neuronas y hepatocitos, y dicho sistema está aún en vías de desarrollo.
d) el hecho de que los vectores adenovíricos generalmente
no se integran en el genoma de las células transducidas eli-
1.4. Vectores basados en el adenovirus asociado
mina el peligro potencial de mutagénesis por inserción.
Las principales desventajas de los vectores adenovíri- Los adenovirus asociados (AAV) son miembros de la
cos son: a) la expresión del gen terapéutico es transitoria familia de los parvovirus y no se han relacionado con nin-

8. 1280 Farmacología humana
guna enfermedad humana. Dichos virus son relativa- 1.5. Otros vectores víricos
mente pequeños (4,7 kb), estables y pueden infectar tam-
bién una gran variedad de células humanas. Pueden pro- Actualmente se está considerando gran variedad de ti-
pagarse como virus líticos o mantenerse como provirus, pos víricos para su caracterización como vectores en te-
que se integran en el ADN de la célula hospedadora. En rapia génica: virus de la vacuna, virus de la hepatitis d,
un proceso de infección, para una replicación eficiente, virus de la hepatitis B, virus de la polio, virus del sida,
el adenovirus asociado requiere coinfección con adeno- Sindbis/Semliki forest virus, etc. Sin embargo, los siste-
virus o virus del herpes simple; de ahí la clasificación del mas de empaquetamiento/complementación para produ-
AAV como un virus defectuoso. cir dichos vectores no están aún lo suficientemente desa-
rrollados.
El genoma vírico está compuesto por ADN monocatenario con dos
repeticiones terminales invertidas (ITR) de 145 bases. Las primeras 125
bases de estas repeticiones se repliegan para formar una doble cadena 2. Métodos físicos y químicos
en forma de «T» que se cree que actúa como cebador para la replica-
ción del ADN vírico. Durante el ciclo de infección, el virus se integra
Aunque la mayor parte de la investigación en terapia
en el genoma celular como ADN de doble cadena (fig. 76-2). Todas las génica se ha centrado en el uso de virus recombinantes
etapas de biosíntesis vírica tienen lugar en el núcleo de la célula hos- para transferir genes a células alteradas, se ha progresado
pedadora. El genoma vírico produce como mínimo seis tránscritos a también en el desarrollo de nuevas tecnologías que per-
partir de tres promotores internos y los dos principales marcos abier- mitirán formular a los genes como productos farmacéu-
tos de lectura, los genes rep y cap. Dichos genes codifican como mínimo
cuatro y tres polipéptidos, respectivamente. Cap codifica proteínas es- ticos convencionales y su administración directa a los pa-
tructurales, mientras rep codifica proteínas responsables de la replica- cientes. Estos sistemas de transferencia génica no víricos
ción vírica. se denominan a veces virus artificiales ya que imitan con
Los vectores AAV actuales incorporan simplemente las dos repeti- frecuencia funciones biológicas de los sistemas víricos.
ciones terminales de 145 bases que flanquean el transgén de interés, que
sustituye a los genes rep y cap. Dichos vectores requieren complemen-
Sin embargo, los sistemas de transferencia no víricos
tación con proteínas víricas para replicarse y encapsidarse. El vector se difieren de los sistemas de transferencia víricos en cuanto
recupera a partir de lisados celulares. Las partículas recombinantes pue- a su composición, elaboración, caracterización y perfil
den transducir eficientemente células diana y el gen de interés, flan- terapéutico, y entrañan también riesgos clínicos y comer-
queado por las ITR, puede integrarse en el genoma celular. El proce- ciales diferentes. Estudios en animales demuestran que
dimiento actual para producir partículas víricas recombinantes utiliza
una cotransfección de células (normalmente se emplean las líneas ce- los métodos actuales de transferencia génica no vírica son
lulares humanas KB o 293) infectadas con adenovirus, con el vector menos eficientes que los métodos víricos para introducir
AAV y con un plásmido de ayuda que expresa las proteínas rep y cap. genes a un gran número de células in vivo; sin embargo,
Estos dos plásmidos se construyen de manera que no contengan se- son relativamente más seguros y más flexibles en cuanto
cuencias homólogas, para evitar la síntesis de virus «silvestres» mediante
recombinación homóloga. Las células transfectadas se cultivan durante
al tamaño y composición de las secuencias que deben
48 horas y se lisan. Posteriormente, el lisado se trata a 56 °C para eli- transferirse. Actualmente se están realizando ensayos clí-
minar las partículas de adenovirus (AAV es resistente a dicho trata- nicos que incluyen métodos de transferencia no vírica
miento). Los rendimientos de partículas recombinantes varían entre 106 aprobados en Estados Unidos y Europa. Algunos méto-
y 107 partículas por cada placa de células de 100 mm, las cuales pueden dos de transferencia génica no víricos, como los liposo-
concentrarse hasta 1012 por centrifugación.
mas y los lípidos catiónicos fueron desarrollados inicial-
mente para la administración controlada de fármacos
La integración del genoma de los adenovirus asocia- convencionales y productos biológicos.
dos en el ADN del hospedador es menos eficiente y pre- La transferencia génica no vírica se está realizando ac-
cisa que la integración retrovírica, puesto que en dicho tualmente en tejidos accesibles por administración in-
proceso se producen frecuentemente pequeñas delecio- tersticial directa, como músculo, tumores sólidos, piel y
nes y/o reordenamientos. Sin embargo, los genomas in- epitelio pulmonar, así como en tejidos accesibles al com-
tegrados de AAV son estables. Una propiedad caracte- partimiento vascular, como el endotelio pulmonar y los
rística de los adenovirus asociados es que la integración hepatocitos, obteniéndose una expresión transitoria de
de su genoma vírico se produce dentro de una pequeña los productos génicos terapéuticos.
región del cromosoma 19. No obstante, no parece que El reto de la terapia génica no vírica consistirá en
ninguno de los adenovectores asociados, construidos has- desarrollar medicinas génicas que puedan distribuirse,
ta la fecha, conserve dicha propiedad. Otra limitación de prescribirse y administrarse como medicinas tradiciona-
los vectores AAV es la restricción en el tamaño de las les para enfermedades comunes, y que muestren perfiles
secuencias transgénicas que deben acomodarse, que no de seguridad y eficacia similares a los fármacos y pro-
puede superar las 4,5 kb. ductos biológicos convencionales.
Recientemente, experimentos in vivo han demostrado
que los vectores AAV pueden persistir y expresar el
2.1. ADN purificado
transgén en células de crecimiento lento o incluso quies-
centes, sin que se observen respuestas inflamatorias o in- Uno de los obstáculos más importantes de la transfe-
munológicas tóxicas. rencia de ADN purificado radica en que los mismos plás-

9. 76. Terapia génica 1281
midos son partículas con carga negativa neta y con un diá- Los lípidos catiónicos se han utilizado para transferir
metro hidrodinámico que supera los 100-200 nm. Debido genes a varios tejidos in vivo. Los pulmones al parecer
a estas características, es improbable que el ADN se di- son particularmente susceptibles a transferencia génica
funda lejos del lugar de inyección o que atraviese sin di- mediada por liposomas catiónicos administrados por vía
ficultad barreras, como el endotelio, el epitelio querati- intratraqueal o incluso intravenosa, aunque se desconoce
nizado o la barrera hematoencefálica. Por el contrario, el su mecanismo de actuación. Estudios de expresión de
ADN introducido en el espacio vascular será captado y a-antitripsina y del producto génico de la fibrosis quís-
eliminado fácilmente del organismo por células reticulo- tica (CFTR) en pulmones de animales han posibilitado el
endoteliales. comienzo de ensayos clínicos de terapia génica para la de-
A pesar de ello, se ha inyectado ADN recombinante ficiencia de dichas proteínas utilizando liposomas. Varios
en varios tejidos para evaluar su incorporación y expre- estudios han empleado complejos de lípido catiónico-
sión. Aunque la eficiencia de transferencia génica utili- ADN administrados directamente a tumores para au-
zando dicho procedimiento es baja, unos pocos tejidos, mentar su inmunogenicidad, en terapia antitumoral. Se
en especial músculo, tiroides y tejido sinovial, expresan han propuesto también ensayos clínicos usando lípidos
los genes recombinantes inyectados. Se desconoce el me- catiónicos para transferir el gen que codifica la interleu-
canismo por el que dichas células incorporan y expresan cina 2 (IL-2) a tumores con el fin de provocar una res-
el ADN purificado. Aunque la inyección directa de ADN puesta inflamatoria antitumoral.
en músculo puede ser útil para vacunación, dicho proce-
dimiento no es válido para el tratamiento de enfermeda-
des sistémicas como la distrofia muscular de Duchenne. D. APROXIMACIONES INNOVADORAS
Para intentar aumentar in vivo la incorporación celu- PARA TERAPIA GÉNICA
lar de ADN purificado se ha descrito otro método que
utiliza el bombardeo con micropartículas inertes de oro El vehículo o vector ideal para terapia génica tendría
recubiertas de ADN que se proyectan en los tejidos diana que transferir el gen terapéutico eficiente y específica-
mediante una «pistola génica». Con dicho procedimiento mente a los tejidos diana apropiados. Una vez en el inte-
se han transferido genes a varios órganos, como piel, hí- rior de la célula, el gen terapéutico tendría que ser trans-
gado y músculo, aunque la expresión se observa sola- portado al núcleo donde se mantendría en un plásmido
mente en las capas más superficiales del tejido tratado. funcional o se integraría de manera estable, y a ser posi-
Dicho método se ha usado también para expresar antí- ble específica, en un cromosoma celular. Finalmente, ten-
genos para vacunación y para la cicatrización de heridas dría que expresarse de forma predecible y controlada en
en un modelo experimental animal. niveles adecuados en función de la célula o tejido.
Sin embargo, la amplia gama de enfermedades sus-
ceptibles de ser tratadas mediante terapia génica implica
2.2. Liposomas
una gran dificultad a la hora de diseñar un único sistema
Recientemente se ha destacado el uso de los lípidos ca- de transferencia génica universalmente apropiado.
tiónicos que forman complejos con ADN, como reacti- Recientemente se ha progresado en la incorporación
vos importantes para transferencia génica, tanto ex vivo de características que aumentan la especificidad de ac-
como in vivo. Formulaciones de ADN con lípidos catió- ción en la mayoría de los sistemas actuales de terapia gé-
nicos, como DOTMA (bromuro de 1,2-dioleil-oxipropil- nica. Dichas características pueden ser: a) en cuanto a re-
3-trimetil-amonio) o análogos, y un fosfolípido neutro, conocimiento de la superficie celular diana, mediante
como DOPE (dioleil-fosfatidil-etanolamina), producen manipulación de los componentes de reconocimiento su-
complejos lípido-ADN capaces de introducirse en las cé- perficiales de virus y liposomas, y/o b) respecto a restric-
lulas con eficiencias que pueden sobrepasar el 90 % en ciones transcripcionales en las células huésped, mediante
algunas líneas celulares y cultivos primarios. Los com- la incorporación de elementos transcripcionales en el
plejos lípido-ADN en dichas formulaciones no son ver- plásmido o genoma vírico, de manera que el gen tera-
daderos liposomas, sino que el lípido catiónico forma una péutico se exprese sólo en ciertos tipos celulares y a ni-
partícula que condensa el ADN mediante interacciones veles deseados.
iónicas. Dichos complejos pueden incluir también varias
moléculas de plásmido por interacciones hidrófobas en-
1. Transferencia génica dirigida
tre los lípidos unidos.
El tamaño y la carga del complejo lípido-ADN y la efi-
1.1. Vectores retrovíricos
ciencia de transferencia génica se pueden optimizar alte-
rando la composición de lípidos y ADN del complejo. El principal determinante de la capacidad infectante
Aunque varias combinaciones de lípidos catiónicos y de los retrovirus es la interacción entre receptores espe-
otros lípidos muestran eficiencias de transferencia génica cíficos de la membrana de la célula hospedadora y glu-
diferentes en distintos tipos celulares, no se ha estable- coproteínas situadas en la envuelta lipídica de la partícula
cido un patrón lipídico ideal. retrovírica. Sin embargo, la mayoría de retrovirus tienen

10. 1282 Farmacología humana
capacidad para infectar diferentes tipos celulares dado 1.3. Liposomas
que los receptores celulares con los que interaccionan se
encuentran ampliamente distribuidos. Para la transferencia génica dirigida, los liposomas o
La mayor parte de los vectores retrovíricos y líneas em- complejos lípido-ADN convencionales tienen la desven-
paquetadoras producidas hasta el momento se basan en taja de ser eliminados fácilmente por células del sistema
virus de leucemia murina (MLV) que, dependiendo de su reticuloendotelial, particularmente macrófagos residen-
tropismo (capacidad de infección), pueden clasificarse a tes en hígado, bazo y médula ósea. Dicha interacción con
efectos de transferencia génica, en ecotrópicos (infectan el sistema reticuloendotelial se puede retrasar conside-
células murinas) y anfotrópicos (infectan prácticamente rablemente, aunque no eliminar, utilizando liposomas lla-
todas las células de mamíferos). Por lo tanto, para dise- mados stealth que incluyen sustancias cargadas negativa-
ñar vectores retrovíricos dirigidos se ha de restringir la mente, como gangliósido GM1 o polietilenglicol.
promiscuidad de tropismo de las partículas anfotrópicas Asimismo, se están estudiando diferentes sistemas
o conferir a las partículas ecotrópicas una afinidad res- para dirigir los liposomas hacia tipos celulares específi-
tringida para ciertas células humanas. Esto se está estu- cos. El acoplamiento de anticuerpos a los liposomas (in-
diando actualmente mediante métodos diversos. munoliposomas) puede determinar especificidades dife-
rentes dependiendo del anticuerpo incorporado. Por
a) Manipulación genética de la línea productora de forma que, en ejemplo, se ha observado que acoplando a liposomas un
las partículas víricas, la envuelta anfotrópica o la ecotrópica se sustituye
por una proteína diferente, vírica o no, que aporta la afinidad deseada
anticuerpo contra células de glioma, se puede incremen-
(seudotipación). Muy recientemente se ha demostrado la transducción tar hasta siete veces la eficiencia de transferencia génica
de neuronas que utilizan vectores basados en el virus de la inmunode- a dichas células en cultivo. Se pueden conjugar también
ficiencia humana (VIH), causante del sida, que se seudotiparon con la a liposomas otros ligandos, como factores de crecimiento
glucoproteína de la envuelta del virus de la leucemia murina de Molo- y hormonas. La inyección intravenosa de liposomas con-
ney, habitualmente utilizado para experimentos de terapia génica.
b) Dotación directa de una determinada afinidad a la glucopro- jugados con transferrina a un modelo animal de conejo
teína de la envuelta mediante ingeniería genética. Actualmente, la adi- dio como resultado una localización del transgén en eri-
ción de dominios proteicos es la mejor aproximación para el diseño de troblastos de médula ósea.
envueltas dotadas de diferentes especificidades, ya que éstas se suelen Sin embargo, no es suficiente dotar al vector de una
expresar eficientemente en las partículas víricas y son capaces de mo-
dificar la dirección de unión de los viriones. La dificultad reside en que
capacidad de unión específica; el liposoma debe contener
dichos dominios deben plegarse separadamente y no interferir con otros un ligando que posibilite su fusión con las membranas ce-
dominios esenciales de la envuelta retrovírica. Por ejemplo, se han ex- lulares, puesto que el ADN debe llegar intacto hasta el
presado factores de crecimiento y fragmentos de anticuerpos mono- núcleo. La incorporación de glucoproteínas víricas de
clonales como extensiones aminoterminales del dominio de superficie superficie a liposomas podría crear un sistema de trans-
de la envuelta del virus de la leucemia murina de Moloney. Sin embargo,
hasta el momento la eficiencia de transducción resultante de las partí- ferencia génica con las propiedades de unión e interiori-
culas víricas dirigidas obtenidas a partir de dicha aproximación ha sido zación eficientes propias de los virus, pero sin las des-
muy baja o nula. ventajas de éstos en cuanto a seguridad. Estudios en dicha
c) Estrategias que emplean conjugados moleculares, en las que se área están desarrollando un sistema para dirigir liposo-
acoplan ligandos a la superficie de la partícula retrovírica. Los hepato-
citos poseen un receptor que interioriza eficientemente las asialoglu-
mas al epitelio respiratorio mediante su conjugación a
coproteínas. Se ha conjugado lactosa a partículas retrovíricas ecotrópi- proteínas de superficie del virus respiratorio sincitial, res-
cas, lo cual les permitió ser reconocidas como asialoglucoproteínas, por ponsable de infecciones en las vías respiratorias.
lo que se amplió su tropismo para incluir células humanas de hepatoma.
1.4. Conjugados moleculares
1.2. Vectores adenovíricos
La conjugación de un plásmido a un determinado li-
Aunque las enfermedades provocadas por adenovirus gando con afinidad por un tejido o tipo celular puede pro-
asientan comúnmente en el epitelio respiratorio o el porcionar especificidad de unión. Ello se consigue me-
tracto gastrointestinal, parece que sus receptores celula- diante la unión covalente de un policatión como polilisina
res están ampliamente distribuidos. Por lo tanto, el pro- al ligando. Posteriormente, el policatión se une al ADN
blema, como en el caso de los retrovirus, es limitar su tro- y lo condensa mediante interacciones electrostáticas, ex-
pismo a un determinado tejido. poniendo el ligando en la superficie del conjugado. Sin
embargo, el sistema resultante es muy ineficiente ya que
A partir de las proteínas adenovíricas responsables de unión e inte-
la mayoría de procesos de endocitosis mediada por re-
riorización se están estudiando estrategias para manipular el tropismo
del adenovirus. Por un lado, se puede limitar la infección provocada por ceptores dirigen los conjugados a los lisosomas, donde la
adenovirus en la etapa de su unión a la célula sustituyendo la región mayor parte del ADN resulta degradado.
carboxiterminal de la fibra pentón, una de las subunidades que com- Recientemente se ha desarrollado una nueva genera-
ponen la cápsida, por un ligando que confiera un determinado tropismo; ción de conjugados moleculares. Mediante la unión de los
por ejemplo, un hapteno de anticuerpo. Por otro lado, también se puede
sustituir una determinada región de la base pentón (otra subunidad de
adenovirus al conjugado se puede crear un vector muy
la cápsida) por secuencias que tengan afinidad por un ligando diferente eficiente gracias a la capacidad de las proteínas adenoví-
a las integrinas, su ligando natural. ricas de romper el endosoma antes que el vector sea de-

11. 76. Terapia génica 1283
gradado. Sin embargo, este proceso elimina la especifici- mido, se observó la corrección de los síntomas distró-
dad de unión conferida por el ligando, ya que el complejo ficos.
puede penetrar las células tanto mediante interacción con
el receptor del ligando como con el receptor adenovírico,
2.2. Regulación intracelular
que se encuentra ampliamente distribuido. Para dotar de
especificidad a dichos complejos, será necesario utilizar Para controlar a voluntad la actividad de un gen tera-
cápsidas adenovíricas modificadas, que mantengan el me- péutico, no a nivel tisular sino a nivel intracelular, se ha
canismo de escape lisosómico, pero que no puedan inter- introducido la utilización de fármacos o ligandos peque-
accionar con el receptor adenovírico. Aun así, es poco ños cuya administración o eliminación pueda provocar la
probable que dichos complejos puedan aplicarse para te- expresión génica. Un ejemplo de este tipo de sistemas
rapia génica in vivo fundamentalmente debido al tamaño es el formado a partir de un activador transcripcional
del complejo (los conjugados transferrina-policatión tie- híbrido, que comprende el dominio de unión de ADN
nen aproximadamente un diámetro de 100 nm; en com- GAL4 de levadura fusionado al dominio activador VP16
plejos con adenovirus serían incluso mayores) que impide del virus del herpes simple y a un dominio de unión mu-
su penetración en los tejidos y a la potencial inmunoge- tante del receptor de progesterona. Dicho sistema mues-
nicidad de las proteínas del adenovirus. tra elevada afinidad por RU486, un antagonista de la
progesterona. Se ha demostrado que la capacidad de ac-
tivación transcripcional de la proteína híbrida GAL4-
2. Transferencia génica modulada
VP16 es reversible y depende de la presencia de RU486
a concentraciones inferiores a las necesarias para inhibir
2.1. Restricción a nivel transcripcional
la acción de la progesterona in vivo.
Otra forma de conseguir que los vectores actuales de
terapia génica adquieran especificidad es limitar, a nivel
3. Cromosomas mamíferos artificiales
transcripcional, la expresión del gen terapéutico a deter-
minados tejidos diana. La expresión génica estable a partir de elementos ex-
Una expresión génica regulada correctamente puede tracromosómicos se limita actualmente al uso de plásmi-
incluir, además de la secuencia promotora, elementos dis- dos incorporados a células quiescentes y los niveles de
tantes situados en posición 5' o 3' de la región codifica- expresión se establecen en dichos plásmidos por incor-
dora. Dichos elementos, que ya se han identificado para poración de elementos reguladores transcripcionales y
varios genes, actúan junto con el promotor y permiten la postranscripcionales. El desarrollo de elementos extra-
expresión específica en un determinado tejido a niveles cromosómicos estables y con capacidad de replicación es
adecuados, independientemente del sitio de integración un área de investigación con considerable potencial en el
del transgén. Sin embargo, la utilización de dichos mó- futuro. Los cromosomas mamíferos artificiales (MAC)
dulos transcripcionales para terapia génica in vivo resul- que contienen como elementos funcionales esenciales el
taría problemática debido a su considerable tamaño, por centrómero (secuencia central de los cromosomas, que
lo que actualmente su uso está restringido para estrate- forma una estructura para unirse a los microtúbulos en el
gias ex vivo. proceso de división celular), los telómeros (secuencias fi-
Cuando un déficit monogénico produce una enferme- nales de los cromosomas) y el origen de replicación pue-
dad que se manifiesta en más de un tejido, la estrategia den transformarse en vectores no víricos de interés. Sin
más utilizada para limitar adecuadamente la expresión embargo, hasta el momento solamente se han caracteri-
del ADN complementario terapéutico radica en el uso de zado con detalle los telómeros mamíferos y no se avan-
los propios elementos celulares de promotor/aumentador zará en este campo hasta que los centrómeros y los
que presenta el gen defectuoso. Dichos elementos se ac- orígenes de replicación se caractericen y puedan mani-
tivan solamente si existen factores de transcripción nu- pularse.
cleares específicos del tejido o tejidos diana. Además, el
uso de promotores celulares, al contrario que los víricos,
reduce la probabilidad de que se produzca una pérdida II. ESTUDIOS DE TRANSFERENCIA
de expresión del ADN complementario debido a inacti- GÉNICA. ENSAYOS PRECLÍNICOS
vación de las secuencias por metilación u otros mecanis- Y CLÍNICOS
mos. Por lo tanto, con los promotores celulares se puede
obtener expresión a largo plazo, restringida a determi-
1. Estudios de marcaje
nados tejidos. Por ejemplo, se ha utilizado el promotor
de la creatín-cinasa en un plásmido junto con el ADN El marcaje genético de células hemopoyéticas no pro-
complementario de la distrofina, para restringir la ex- duce un beneficio inmediato a los pacientes, pero la in-
presión de este gen a músculo esquelético y cardíaco. formación obtenida de dichos estudios ayuda a mejorar
Además, en ratones mdx (modelo murino para la distro- los resultados de terapias que emplean el trasplante de
fia muscular de Duchenne), transgénicos para dicho plás- precursores hemopoyéticos (HSC) con el fin de erradi-

12. 1284 Farmacología humana
car tumores. También ayuda a conocer con mayor pro- 2. Estudios terapéuticos
fundidad la biología de los HSC y a mejorar la eficiencia
de la transferencia y expresión génicas. 2.1. Enfermedades genéticas clásicas
De la multitud de enfermedades genéticas que se han
1.1. Marcaje de linfocitos infiltradores de tumores descrito para las cuales no existen actualmente tratamien-
tos satisfactorios, sólo unas pocas han sido seleccionadas
El marcaje de linfocitos aislados de tumores sólidos
para ensayos clínicos de terapia génica. Entre ellas se en-
(TIL) fue el primer experimento de transferencia génica
cuentran enfermedades que afectan a células hemopoyé-
a seres humanos aprobado en Estados Unidos en 1989.
ticas, como el déficit de adenosín-desaminasa y la enfer-
En dicho experimento se marcaron ex vivo TIL aislados
medad de Gaucher; enfermedades que afectan el hígado,
de pacientes con cáncer en estadios avanzados mediante
como la hipercolesterolemia familiar, y enfermedades que
transducción con un vector retrovírico que contenía el
afectan el pulmón, como la fibrosis quística (tabla 76-2).
gen de la resistencia a la neomicina (neo) como marca-
dor selectivo y se reinfundieron al paciente. Los resulta-
dos obtenidos demostraron que las células manipuladas a) Deficiencia de adenosín-desaminasa
podían ser devueltas al paciente sin ningún riesgo y pos-
La deficiencia de adenosín-desaminasa (ADA) es una
teriormente se podían detectar in vivo.
enfermedad genética poco frecuente en la que los niños
afectados carecen de esta enzima necesaria para la fun-
1.2. Marcaje de células hemopoyéticas ción normal de su sistema inmunitario.
En septiembre de 1990, una niña de 4 años que sufría
Para diferentes enfermedades malignas, la recupera- deficiencia de ADA recibió una infusión de sus propios
ción de precursores hemopoyéticos puede mejorar la es- linfocitos T que habían sido manipulados ex vivo para in-
peranza de vida de los pacientes sometidos a radiotera- troducirles una copia normal del gen de la ADA. Se es-
pia o quimioterapia. Sin embargo, la recidiva es la causa cogió esta deficiencia de ADA como la primera enfer-
principal por la cual dicho tratamiento suele ser ineficaz. medad susceptible para terapia génica por varias razones:
La posibilidad de que las células reinfundidas al paciente a) el gen había sido clonado y su correspondiente ADN
pudieran contribuir a la recidiva condujo a una evalua- complementario era del tamaño adecuado para insertarse
ción exhaustiva de las técnicas utilizadas para «limpiar» fácilmente en un vector retrovírico; b) estudios previos
la médula ósea con el fin de eliminar las células malignas. de trasplante de médula ósea sugerían que solamente era
Ello se realizó marcando la médula ósea recogida del pa- necesario corregir los linfocitos T para curar la enferme-
ciente y analizando posteriormente la presencia del gen dad; c) la cantidad de enzima necesaria para mantener la
marcador en células malignas cuando se producía la re- función del sistema inmunológico en determinados casos
cidiva. puede ser el 5-10 % del nivel normal, y d) las células T
corregidas tienen una ventaja selectiva sobre las células
Dichos estudios empezaron en 1991 e incluían pacientes con leu- deficientes en ADA.
cemia mieloide aguda y con neuroblastoma. La médula ósea de dichos
pacientes se transdujo ex vivo con vectores retrovíricos análogos a los
A partir de dicho protocolo se demostró que los linfo-
empleados en el estudio de marcaje de TIL. Los datos recogidos de- citos de un paciente con inmunodeficiencia se pueden ais-
mostraron que la médula ósea obtenida después de los tratamientos lar, pueden crecer en el laboratorio, manipularse genéti-
de «limpieza» puede contener aún células tumorales residuales que camente y ser devueltos al propio paciente sin mayor
contribuyen a la recidiva de la enfermedad. Así pues, será necesario
riesgo (fig. 76-4). Los dos primeros pacientes han res-
mejorar los métodos de «limpieza» para mayor eficiencia en el tras-
plante autólogo de médula ósea. Asimismo, otros estudios de marcaje pondido positivamente a la terapia. El número total de
para analizar la causa de la recidiva en la leucemia aguda, cáncer de linfocitos en su sangre ascendió a niveles normales y en
mama y mieloma no han mostrado hasta el momento recidivas en las el primer niño tratado la cantidad de enzima ADA en sus
que se encuentre células hemopoyéticas marcadas con el gen neo, pro- linfocitos T ascendió hasta el 25 % de los niveles norma-
bablemente porque las técnicas actuales de marcaje aún son inefi-
cientes.
les. Además, durante una pausa de 6 meses y medio en
Actualmente existe mayor interés en los estudios de marcaje con su tratamiento, tanto el número de linfocitos manipula-
retrovirus para analizar la eficiencia de transducción de las células dos genéticamente como los niveles de enzima ADA se
hemopoyéticas precursoras antes de utilizarlas para trasplante. Es- mantuvieron constantes. Ello sugería que la vida media
tudios en la población infantil han demostrado que el gen marcador
de los linfocitos corregidos era mayor de 6 meses y me-
neo se detecta en el 2-15 % de las células precursoras después del
trasplante autólogo de médula ósea y se expresa durante más de dio, y que dichos linfocitos proliferaban creando un nivel
3 años en la población hemopoyética descendiente. Dichos experi- terapéutico de células corregidas. Sin embargo, es posi-
mentos de marcaje permitirán valorar el efecto de la administración ble que las pocas células T corregidas no abarquen com-
de factores de crecimiento sobre la capacidad de colonización de las pletamente el repertorio de un sistema inmunitario nor-
células hemopoyéticas precursoras a corto y largo plazo, y sobre su
transducibilidad. Asimismo servirán para identificar fenotípicamente
mal, por lo cual se ha iniciado ya una modificación al
a dichas células con el fin de estudiar con mayor profundidad su bio- anterior protocolo en que células hemopoyéticas precur-
logía. soras de sangre periférica se modifican mediante trans-

13. 76. Terapia génica 1285
Tabla 76-2. Enfermedades con protocolos aprobados para ensayos clínicos de terapia génica
Enfermedad Gen o secuencia transferida Órgano o células diana Vectores
Enfermedades hereditarias
Enfisema familiar a1-Antitripsina Vías respiratorias Liposomas
Enfermedad granuloma- p47PHOX (oxidasa) Células mieloides Retrovíricos
tosa crónica
Fibrosis quística CFTR Vías respiratorias Basados en el adenovirus aso-
ciado, adenovíricos y lipo-
somas
Hipercolesterolemia fami- Receptor de lipoproteínas de Hepatocitos Retrovíricos
liar baja densidad
Anemia de Fanconi Gen de complementación del Células precursoras hemopo- Retrovíricos
grupo C yéticas
Enfermedad de Gaucher Glucocerebrosidasa Células precursoras hemopo- Retrovíricos
yéticas
Síndrome de Hunter Iduronato-2-sulfatasa Linfocitos Retrovíricos
Inmunodeficiencia combi- Adenosín-desaminasa Linfocitos Retrovíricos
nada grave
Enfermedades adquiridas
Virus del sida Ribozimas y sondas antisen- Linfocitos Retrovíricos
tido contra el virus del sida
Enfermedad de las arterias Factor de angiogénesis tu- Células endoteliales Plásmidos (ADN purificado)
periféricas moral
Artritis reumatoidea Antagonista del receptor de Células sinoviales Retrovíricos
IL-1
Cáncer Genes supresores de tumores Carcinomas de hígado, pul- Retrovíricos y adenovíricos
món, etc.
VHS-timidín-cinasa/ganci- Tumores cerebrales y de ova- Retrovíricos y adenovíricos
clovir rios
ARN antisentido contra Cáncer de mama Retrovíricos
c-fos- y c-myc
Gen MDR1 Células hemopoyéticas Retrovíricos
Factor de necrosis tumoral Linfocitos infiltradores de tu- Retrovíricos
mores
Cofactor B7 Melanoma Retrovíricos
HLA-B7 Melanoma (HLA-B7 nega- Liposomas
tivo)
Citocinas Tumores de pulmón, prós- Retrovíricos y liposomas
tata, colon, etc.
Interferón g Melanoma maligno Liposomas
CFTR: proteína reguladora transmembrana de conductancia de la fibrosis quística.
ducción con el mismo vector retrovírico empleado en el ciencia de ADA, conocer la secuencia de ADN comple-
primer protocolo, para proporcionar una protección ex- mentario del gen que codifica la glucocerebrosidasa y el
traordinaria al sistema inmunitario del paciente. hecho de que el principal tipo celular afectado derive del
sistema hemopoyético, ha llevado a proponer a la terapia
génica ex vivo utilizando vectores retrovíricos como tra-
b) Enfermedad de Gaucher
tamiento alternativo. En este caso, las células diana son
Está causada por una deficiencia de la enzima lisosó- también las células hemopoyéticas precursoras con capa-
mica glucocerebrosidasa, que hidroliza glucosilceramida cidad de producir macrófagos corregidos en el paciente.
en ceramida y glucosa. La acumulación de dicho glucolí-
pido se produce principalmente en los macrófagos del sis-
c) Hipercolesterolemia
tema reticuloendotelial, lo cual produce esplenomegalia,
lesiones dolorosas en los huesos y en determinados ca- En la hipercolesterolemia familiar hay un defecto en una
sos lesiones neurológicas. Esporádicamente se ha utili- de las proteínas principales implicadas en el metabolismo
zado con éxito el trasplante alogénico de médula ósea del colesterol, el receptor de lipoproteínas de baja densi-
como modalidad terapéutica. Al igual que para la defi- dad (LDL) (v. cap. 55). El principal órgano responsable de

14. 1286 Farmacología humana
Extracción sanguínea
Aféresis
(separación celular)
Linfocitos o células Retrovirus Transfusión de células que
hemopoyéticas precursoras recombinante expresan el gen terapéutico
del paciente
Fig. 76-4. Terapia génica ex vivo para el tratamiento de enfermedades que afectan células hemopoyéticas. Las células hemopo-
yéticas se extraen a partir de sangre o médula ósea del paciente. Después de ser sometidas a un proceso de purificación para enri-
quecer a la población de interés, las células resultantes se tratan con retrovirus recombinantes que contienen el gen terapéutico. Fi-
nalmente, las células corregidas se reintroducen al paciente mediante transfusión sanguínea.
la síntesis del receptor de LDL es el hígado. Los individuos d) Fibrosis quística
afectados por dicha enfermedad genética tienen niveles ex-
tremadamente elevados de colesterol, lo cual predispone Siendo la enfermedad genética más común entre la po-
a enfermedades cardiovasculares prematuras. blación de raza blanca, la fibrosis quística se caracteriza
Para tratar a individuos con esta deficiencia se ha ini- por un defecto en la estimulación de la secreción de clo-
ciado un programa de terapia génica ex vivo en que se rea- ruros en el epitelio pulmonar debido a la alteración de
liza una lobectomía hepática a los pacientes. El lóbulo una proteína reguladora transmembrana de conductan-
extraído se procesa con colagenasa para obtener los he- cia de la fibrosis quística (CFTR) (v. cap. 43). Ello pro-
patocitos deficientes, que se transducen mediante un vec- voca infecciones pulmonares frecuentes, que pueden lle-
tor retrovírico que contiene el gen del receptor de LDL. gar a ser letales.
Finalmente, los hepatocitos transducidos se devuelven al Para el tratamiento de esta enfermedad se ha consi-
paciente mediante inyección en el bazo y/o la vena porta. derado principalmente la terapia génica in vivo. Se ha de-
Los hepatocitos corregidos tienen la capacidad de elimi- mostrado la capacidad de los vectores adenovíricos para
nar el colesterol de la sangre, lo cual ayuda a prevenir la introducir genes en el epitelio pulmonar de modelos ani-
progresión de la enfermedad cardiovascular. Dicho pro- males y ello ha promovido el inicio de ensayos clínicos
cedimiento había sido realizado previamente con éxito para pacientes con fibrosis quística. Asimismo, se han ini-
en un modelo animal de la enfermedad, el conejo hiper- ciado ensayos clínicos utilizando transferencia génica por
lipidémico Watanabe. Estudios aún en fase experimen- liposomas. Dado que ambas técnicas tienen como limita-
tal están evaluando la eficiencia de otros sistemas de ción el hecho de que la expresión génica es solamente
transferencia, como la terapia génica in vivo mediante re- transitoria, será importante evaluar las consecuencias de
trovirus o adenovirus recombinantes. su uso repetido.

15. 76. Terapia génica 1287
2.2. Enfermedades de coagulación y otras Sin embargo, uno de los objetivos principales en el de-
enfermedades que implican sarrollo de terapias génicas para neuropatías es la admi-
la circulación sanguínea nistración directa, in vivo, del material genético a las cé-
lulas del sistema nervioso central. Existen dos obstáculos
En estudios preclínicos se ha estudiado el desarrollo propios del cerebro que dificultan la transferencia génica:
de métodos para aportar productos génicos a la circula- la barrera hematoencefálica y el hecho de que la mayo-
ción sanguínea. Se han realizado diversos estudios de ría de las células diana, por tratarse de neuronas posmi-
transducción de tejidos primarios, como queratinocitos, tóticas, no puedan ser transducidas por vectores retro-
mioblastos y fibroblastos. Algunos de estos experimen- víricos. Por lo tanto, se están analizando otros sistemas
tos han indicado que es posible la expresión génica a largo víricos que sean eficientes y capaces de infectar células
plazo in vivo después de trasplantar las células transdu- quiescentes, como los vectores basados en el virus del
cidas ex vivo. herpes, vectores adenovíricos y vectores basados en los
En el caso de los queratinocitos, se han utilizado sa- adenovirus asociados. Muy recientemente se ha produ-
tisfactoriamente vectores retrovíricos y métodos de tras- cido un vector retrovírico basado en el virus del sida, de
plante establecidos, aunque ningún producto génico ex- la familia de los lentivirus, capaz de transducir e integrar
presado por dichos vectores se secretó a la circulación el transgén de manera estable en neuronas del sistema
durante largo tiempo. nervioso central.
Experimentos con mioblastos y fibroblastos han de-
mostrado expresión génica prolongada después de su 2.4. Enfermedades infecciosas:
trasplante. Para el tratamiento de la hemofilia B, después el sida como modelo
de inyectar por vía intramuscular mioblastos primarios
transducidos con el gen que codifica al factor de coagu- Actualmente se están explorando dos estrategias dife-
lación IX humano, dicha proteína fue sintetizada efi- rentes para el tratamiento de enfermedades infecciosas,
cientemente y excretada a la circulación durante más de aunque ambas emplean células manipuladas genética-
6 meses. En cuanto a los fibroblastos, se ha conseguido mente. La primera, denominada inmunización intracelu-
la expresión de b-glucuronidasa durante más de 5 meses lar, está enfocada a conferir resistencia a la replicación
y la corrección del defecto de acumulación lisosómica en vírica y a limitar la propagación del virus en el individuo
ratones deficientes en dicha enzima. Sin embargo, en am- infectado. La segunda estrategia es inmunológica, enca-
bos estudios se tuvo que utilizar vectores que contenían minada a aumentar la inmunidad antivírica utilizando cé-
promotores no víricos, ya que las regiones promotoras ví- lulas modificadas genéticamente para expresar proteínas
ricas (LTR) resultaron inactivas. víricas con el fin de provocar una respuesta celular in-
munitaria, antivírica.
Un candidato obvio para tratamiento mediante inmu-
2.3. Neuropatías
nización intracelular es el sida. Puesto que el virus de la
Es muy probable que pronto se establezcan terapias inmunodeficiencia humana (VIH), el agente etiológico
génicas para varias enfermedades y lesiones del sistema causante del sida, infecta células hemopoyéticas, la in-
nervioso central. Entre los estudios actuales de terapia serción de genes de resistencia a dichas células podría re-
génica para corregir neuropatías destacan los trasplantes ducir o incluso eliminar la propagación del virus en el or-
de células manipuladas ex vivo. ganismo. Los genes de resistencia específicos para VIH
Es probable que los injertos de células modificadas tendrían que satisfacer tres criterios: a) tendrían que ser
genéticamente para sintetizar y secretar factores trófi- efectivos, b) tendrían que carecer de toxicidad y c) su fun-
cos o trópicos, o para producir componentes de vías neu- ción no debería afectarse por variaciones (p. ej., muta-
rotransmisoras, puedan mejorar disfunciones neurona- ciones) en el VIH.
les, incluso en caso de que se desconozcan las causas
genéticas. Las enfermedades neurodegenerativas foca- Se ha propuesto un gran número de estrategias para disminuir la re-
plicación del VIH utilizando inhibidores basados en ARN o inhibido-
les o los déficit neurológicos globales, como la enfer- res proteicos. Actualmente, dichos genes de resistencia se evalúan por
medad de Alzheimer o la de Parkinson, son claras can- su capacidad para inhibir la replicación del VIH cuando se transducen
didatas para este tipo de terapia génica. Por ejemplo, es de manera estable a líneas de linfocitos T humanos (CEM, Jurkat, etc.).
posible generar una rata modelo de la enfermedad de Los inhibidores basados en ARN son menos inmunogénicos, se pueden
expresar a niveles más elevados y suelen ser más específicos. Los más
Parkinson mediante inducción de una degeneración
utilizados son las sondas antisentido y los ribozimas. Otra aproxima-
de la vía dopaminérgica nigrostriatal mediante la neu- ción para inhibir la replicación del VIH implica la expresión de proteí-
rotoxina 6-hidroxidopamina. En dicho modelo se pue- nas VIH alteradas que tengan un fenotipo transdominante, como las
den reconstituir durante un tiempo prolongado algunas formas mutantes de gag, rev, tat y env. Varios estudios han demostrado
de las funciones normales de dicha vía y, por lo tanto, el la eficiencia de una forma mutante de env al proteger células T de la re-
plicación del VIH. Se ha descrito también la expresión intracelular de
comportamiento anormal de la rata, mediante injertos anticuerpos específicos para la envuelta del VIH.
de fibroblastos o mioblastos modificados para producir Para la transferencia de los genes de resistencia vírica a células he-
dopamina. mopoyéticas se emplean los vectores retrovíricos, aunque su eficiencia