Este documento describe diferentes técnicas de tinción y observación de bacterias y otros microorganismos bajo el microscopio. Explica los principios básicos de la tinción simple, tinción de Gram, tinción de endoesporas y tinción de flagelos. También cubre los diferentes tipos de microscopios y técnicas para observar muestras, incluyendo campo claro, campo oscuro y contraste de fases.

1. Bacterias
Tinción

2. Las bacterias
 Son organismos procariotas unicelulares, que se encuentran en casi todas las partes de la Tierra. Son vitales para los
ecosistemas del planeta. Pueden observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo
contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo
para la observación de la movilidad bacteriana.

3. Tinción
 Es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la
imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el
contraste.

4. Tinción simple
 Se fundamenta en la afinidad que va a tener la pared bacteriana por un colorante. Técnica de decantación (procedimiento
para separar dos sustancias mezcladas) en la que se hace uso de los puentes de tinción, en los que se colocan los
portaobjetos con las preparaciones secas y fijadas. Se caracteriza por utilización de un solo colorante para el procedimiento.
Imagen tomada con el objetivo de 40X (Resolución de
400X)

5. Técnica
• Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se
china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
• Se usa un solo colorante para teñir la pared bacteriana y observar así su
visualizar estructuras puesto que rara vez se tiñen.
Escherichia coli Staphylococcus
aureus
Bacillus cereus

6. Tinción Gram
 También llamada tinción diferencial, se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en
función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. Función: permite la
agrupación de las bacterias de acuerdo a su diferente afinidad tintorial, en dos grandes bloques, bacterias grampositivas y
bacterias gramnegativas.
Proceso.-
La secuencia de la tinción es la siguiente:
• el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal
• Se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 min
• se lava de nuevo con agua.
• decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona.
• Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg.
• Lavar y secar.

7. Gram positivo:
 Poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa. Al contener
una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo de tinción.
Tinción de Gram de Bacillus cereus (bacilos gram positivos). Microscopía de campo claro (100x).
Observación:
En bacterias gram positivas la gruesa capa de peptidoglucano con abundantes
entrecruzamientos parece contribuir a la retención del colorante fundamental, cristal
violeta.

8. Gram negativo:
 La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana
celular externa.
Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos gram negativos). Microscopía de campo
claro (100x).
Observaciones:
En bacterias gram negativas la delgada capa de peptidoglucano junto con la
abundancia de lípidos en la membrana externa de la pared celular incrementan la
porosidad.

9. Tinción de endoesporas.-
 Metodología utilizada para colorear las estructuras de resistencias de algunas bacterias.
 Los principales géneros bacterianos son: Bacillus y Clostridium. Estos poseen especies patógenas para el ser
humano.
Fundamento.
• Las esporas no se tiñen con las coloraciones convencionales, ya que poseen una pared muy gruesa y su composición impide la
entrada a la mayoría de colorantes.
• Al observar la espora de afuera hacia adentro, podemos observar: el exosporium, la cutícula, la corteza compuesta por peptidoglicano
y finalmente la pared de la base que protege al protoplasto.
• La espora contiene un 15% de calcio y ácido dipicolínico, por lo que la mayoría de técnicas de coloración se basan en la aplicación
de calor.
• Cuando la espora queda teñida, no puede eliminar el colorante.

10. Técnicas de coloración.
 Actualmente, existen varios métodos de coloración que nos ayudan a atravesar la estructura gruesa de la espora para poder teñirla.
 Se debe tener un cultivo puro de la muestra que se desea estudiar.
 Se expone este cultivo a temperaturas extremas durante 24 horas. Si se expone durante mucho tiempo, las endosporas saldrán del bacilo y solo se podrán
observar las exosporas.
 Una vez acabado este tiempo, se colocan unas gotas de solución fisiológica estéril sobre un portaobjetos y se toma una pequeña porción del cultivo.
 Finalmente, se deja secar, se fija al calor y se tiñe siguiente los pasos de cualquier técnica que escojamos.

11. Técnica de Dorner.
 Preparar una suspensión del microorganismo esporulado en agua destilada y agregar la misma cantidad de
fucsina fenicada de Kinyoun filtrada.
 Colocar el tubo en un baño con agua en ebullición entre 5 y 10 minutos.
 Mezclar una gota de la suspensión con una gota de solución acuosa de nigrosina al 10%. Esta solución
debe estar hervida y filtrada y la mezcla se debe realizar sobre un portaobjetos limpio.
 Extender la mezcla y secar rápidamente con calor suave y examinarla con objetivo de 100X.
 Como resultado, las esporas se tiñen de un color rojo y las células bacterianas son casi incoloras en
contraste con su fondo gris oscuro.
Nigrosina.

12.  Hacer un extendido con una suspensión del microorganismo esporulado sobre un portaobjetos y fijar el
calor.
 Cubrir el portaobjetos son una solución acuosa de verde de malaquita al 5%.
 Con la ayuda del mechero Bencen, calentamos la mezcla hasta que se desprendan los vapores. Repetimos
esta acción entre 6 y 10 minutos.
 Cubrir el portaobjetos con safranina acuosa al 0.5% durante 30 segundos.
 Como resultado, las esporas presentan un color verde y los bacilos se tornan rojos.
 Si el cultivo es demasiado joven, existe el inconveniente de que las endosporas no se tiñan bien, por lo que
se presentas claras o incoloras. Por ello, es recomendable utilizar cultivos de 48 horas de incubación.
Verde de malaquita.
Técnica de Shaeffer–Fulton

13. Técnica de Möeller
 Cubrir el frotis con cloroformo durante 2 minutos.
 Pasado este tiempo, descartamos el cloroformo.
 Cubrir con ácido crómico al 5% durante 5 minutos. Lavar con agua destilada.
 Cubrir la lámina con carbol fucsina-fenicada y exponer a la llama del mechero de Bunsen hasta que se desprendan los vapores.
Repetir esta acción durante 10 minutos y lavar.
 Usar ácido clorhídrico para decolorar durante 20 o 30 segundos y lavar con agua destilada.
 Contra teñir cubriendo la lámina con azul de metileno por 5 minutos y lavar con agua destilada.
 Dejar secar y observar la muestra en el microscopio.
 Como resultado, las esporas presentan un color rojo mientras que los bacilos son azules.
Carbol fucsina y azul de metileno.

14. Usos. La coloración de esporas brinda
información útil que facilita la
identificación del patógeno y estos
datos pueden informar sobre la especie
involucrada dentro de un determinado
género bacteriano.
Ejemplo.La endospora de Clostridium tetani es terminal y
deforma al bacilo, dándole un aspecto de un
palillo de tambor.

15. Tinción de flagelos
 Dado que los flagelos son demasiado delgados, es muy complejo visualizarlos incluso con la ayuda de un microscopio. Por ello,
es necesario utilizar una técnica de montura húmeda para teñir flagelos bacterianos y es útil cuando el número y la disposición
de flagelos son necesarios para la identificación de especies de bacterias móviles.
 Los procesos de tinción de flagelos requiere el uso de un mordiente para que la mancha se adhiera a los flagelos, esto permite
su visualización.
Tipos de flagelos
• Monotricas. • Lofotricas. • Anfitricas. • Peritricas.

16. Método de tinción de kodaka
 Consisten en suspender las bacterias y colocar una gota de colorante en el borde del
portaobjetos y se deja en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente.
 El colorante entra en la preparación y tiñe los flagelos, que se podrán observar
fácilmente en la zona del colorante.
 Para realizar la tinción de flagelos, las bacterias deben cultivarse en medios que no
posean carbohidratos para evitar efectos negativos de la acidez y estos cultivos
deben ser jóvenes.
 Este método de tinción aumenta el diámetro de los flagelos gracias al colorante.

17. Método de tinción de Leifson
 Se preparan las laminillas previamente limpiadas con dicromato o
ácido nítrico, calentadas y enjuagadas con alcohol.
 Se prepara un frotis con bacterias en medio líquido. Inclinamos la
laminilla desde una esquina para obtener una película delgada.
 Cuando esté seca, colocamos una solución de fucsina básica
durante 10 minutos. Después lavamos y dejamos secar.
 Los flagelos se tiñen de rojo y presentan diferente disposición.
Fucsina.

18. Método de tinción de Gray
 Se utiliza un mordiente que cubre la superficie del flagelo, lo que, aparentemente, aumenta su grosor y
proporciona una capa de material teñible para que sea más fácil captar el colorante.
 Con ayuda de un mechero, pasamos el portaobjetos sobre la llama de 3 a 4 veces.
 Preparar una suspensión de la bacteria en agua estéril una vez que el portaobjetos se haya enfriado y
colocamos 5 gotas de la suspensión, distribuyéndolas 4 en las esquinas y 1 en el centro.
 Dejar secar al aire y cubrir con el mordiente durante 10 minutos. Lavar con agua con cuidado de no retirar la
solución y sobre esta, colocar solución carbol-fucsina durante 5 a 10 minutos. Lavar con agua y dejar secar al
aire.
 Al observar, se podrán distinguir los flagelos de color rojo.
Carbol-fucsina.

19. Observación en el microscopio
El microscopio es de gran
importancia para la observación
e identificación de estructuras y
características de los tejidos en
los microorganismos.
Las tinciones nos ofrecen una
ayuda adicional a la simple
observación la morfología.

20. Para observar bacterias de una muestra en el microscopio se utiliza el
objetivo de inmersión en máximo aumento.
Para con este objetivo, colocamos la preparación con el aceite en la platina
del microscopio.

21. Técnicas de Observación En
Microscopio
 OBSERVACIÓN A CAMPO OSCURO
 OBSERVACIÓN CON CONTRASTE DE FASES
 OBSERVACION CON FLUORECENCIA

22. Observación a Campo Claro
 Es la técnica de microscopia más simple. En esta técnica la luz pasa a través o es reflejada por la muestra, sin
alteraciones.
 Toda la luz desde el espécimen y alrededores es colectada por el objetivo para formar una imagen contra fondo
totalmente brillante.
 Utilizada en patología e histología vegetal y animal.

23. Observación a Campo Oscuro
 Técnica de contraste, sin luz directa.
 Muestras transparentes y sin tinción.
 Los rayos de luz forman la imagen
 Adecuado para la observación de células y organismos.

24. Observación con Contraste de Fases
 El resultado de la imagen será el fruto del paso de la luz a través de la muestra
 La luz sin desviar, difractada y colectada por el objetivo es separada por un plato de fases
 Esta técnica se usa en observación de células vivas o en estudio de materiales con láminas muy finas.

25. Observación con Fluorescencia
 Se iluminan por rayos de una determinada longitud de onda
 Determinamos esta técnica de observación como indirecta.
 Utilizada para detectar sustancias determinada (Vitamina A)
 Utilizada en el análisis biomolecular.

26. Colorantes catiónicos
 Son aquellos que en solución forman iones
 El grupo hidrófobo de la molécula, cargado positivamente
 Tonalidades vivas y fuertes
 Inestables a la luz por lo que no se emplean en artículos que requieran una gran fijeza del color
 No se fijan directamente a las fibras por lo que requieren el empleo de un mordiente
 Cargados negativamente, basofílicos
Cristales de
violeta
Azul de metileno Safranin
a

27. Colorantes aniónicos
 Atraídos por componentes celulares que son básicos.
 Argados positivamente; acidófilos.
 Afinidad por las estructuras alcalinas .
 Son derivados sulfónicos en forma de sales sódicas de compuestos azoicos, de baja masa molecular.
 Poca afinidad por la fibra.
 Constituidos por una cadena alquílica lineal o ramificada que va de 10 a 14 átomos de carbono.
 El Verde Rápido FCF, que preferentemente tiñe componentes tales como la celulosa y el citoplasma.
Eosin
a
Fucsina
ácida
Rojo Congo

28. Tipos de microscopios
 Microscopios según el sistema de iluminación
 Microscopio electrónico
 Microscopio de luz ultravioleta
 Microscopio de luz polarizada
 Microscopio de fluorescencia
 Microscopios según el número de lentes
 Microscopios según la transmisión de la luz
 Microscopios según el número de oculares
 Microscopios digitales
 Microscopio estereoscópico

29. Microscopios según el sistema de
iluminaciónMicroscopio óptico
En el microscopio óptico la muestra es iluminada mediante luz
visible. Esto significa que existe un foco de luz apuntando hacia la
muestra.
Microscopio electrónico
En el microscopio electrónico la muestra no es iluminada
con luz sino que se utilizan electrones. Los electrones
impactan contra la muestra dentro de una cámara de
vacío.

30. Microscopio de luz ultravioleta
 Este tipo de luz tiene una longitud de onda más corta que la luz visible utilizada en los microscopios
ópticos. La ventaja principal de utilizar esta técnica es que puede alcanzarse una resolución
mejor que con luz visible.

31. Microscopio de luz polarizada
 Este microscopio es en realidad un tipo de microscopio óptico al que se la han añadido dos polarizadores. Esto
significa que la onda de luz utilizada para observar la muestra tiene una dirección de oscilación concreta. Este
tipo de microscopio es muy útil para observar estructuras cristalinas de rocas y minerales.

32. Microscopio de fluorescencia
 Este microscopio permite observar sustancias que emiten luz propia cuando son iluminadas con una longitud de
onda determinada. Para ello la muestra es habitualmente iluminada con una lámpara xenón o con una lámpara de
vapor de mercurio. Estos microscopios incorporan además filtros de luz para aislar la luz correspondiente a la
muestra.

33. Microscopios según el número de
lentes Microscopio simple  Microscopio compuesto
Este tipo de microscopio dispone de una única lente y es más
habitualmente conocido como lupa. Aún así, con un
microscopio simple pueden conseguirse grandes aumentos.
Este tipo de microscopio es aquél que dispone de por lo
menos dos lentes. Este es el caso más habitual en todos los
microscopios modernos.

34. Microscopios según la transmisión de
la luz
Microscopio de luz transmitida Microscopio de luz reflejada
En este tipo de microscopio la luz atraviesa la muestra.
Para esta clase de microscopios es necesario preparar
la muestra cortándola en láminas muy finas.
En este caso la luz ilumina la muestra y parte de esta es reflejada y
dirigida al objetivo. De este modo es necesario iluminar la muestra
desde la parte superior de la platina. Este tipo de microscopía es
utilizada para examinar materiales opacos como pueden ser
estructuras metálicas, materiales cerámicos, etc.

35. Microscopios según el número de
ocularesMicroscopio monocular
Este tipo de microscopio dispone de un
solo ocular a través del cual se puede
observar la muestra. Es el tipo más sencillo
y es ideal para aficionados a la
microscopía o para alguien que se
introduce en este campo
Microscopio binocular
Disponen, como indica su nombre, de dos oculares.
Esto permite observar la muestra simultáneamente con
los dos ojos resultando en una mayor comodidad para
el usuario. Este es el tipo de microscopio más utilizado
en los laboratorios de investigación
Microscopio trinocular
El microscopio trinocular está equipado con
dos oculares para observar la muestra
además de un tercer ocular para conectar
una cámara.

36. Microscopios
digitales
Los microscopios digitales son aquellos que capturan
una imagen digital de la muestra. Esto se consigue
conectando una cámara digital en lugar del ocular
Microscopio
estereoscópico
El microscopio estereoscópico es un tipo de microscopio que
permite observar la muestra de forma tridimensional. Estos
microscopios están equipados siempre con dos oculares.