Espero sea de gran ayuda para todos

1. INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA I
METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO
Rodriguez Avila María José ª
ª: Estudiante de Microbiología I, de la Universidad de Sucre, en el programa de Medicina.
RESUMEN
Al igual que los seres humanos, los microorganismos necesitan nutrientes de acuerdo a sus
necesidades para realizar su ciclo de vida, esto debe ser proporcionado por el ambiente en el
cual se encuentran, que puede ser denominado medio de cultivo. En la práctica microbiológica
se busca sembrar los microorganismos para estudiar de manera aislada las características que
posean, su desarrollo y capacidad de multiplicación para la formación de colonias, ya que el
aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. Para esto se han
desarrollado diversos medios de cultivos y técnicas de aislamiento, los cuales se analizaran en
el presente informe.
OBJETIVOS
1. Reconocer algunos de los medios de
cultivo empleados en el aislamiento e
identificación bacteriana.
2. Familiarizarse con el manejo de
microorganismos y con las técnicas de
aislamiento en placa de Petri.
3. Aprender a realizar una siembra
bacteriana mediante la técnica de
agotamiento.
4. Observar algunas de las reacciones que
producen los microorganismos cuando
se cultivan.
MARCO TEORICO
Muchos microorganismos no son
perjudiciales y juegan un papel muy
importante en la biosfera, dicho papel va
desde fijar el nitrógeno para poder ser
absorbido por las plantas hasta
descomponer materia orgánica y
transformarla para su reabsorción en la
naturaleza; algunos microorganismos son
patógenos, por esta y muchas razones más,
su estudio es de gran importancia.
La supervivencia y crecimiento continuo de
microorganismos depende de un
suministro adecuado de nutrientes y un
ambiente favorable para su crecimiento.
Un medio de cultivo es una solución que
contiene los nutrientes necesarios para
permitir el crecimiento de
microorganismos, en condiciones
favorables de pH y temperatura. (1)
Los principios básicos de cualquier medio
de cultivo son principalmente; mantener el
crecimiento y aislamiento de las bacterias
presentes en una muestra clínica, para
luego poder determinar que bacterias entre
las que se desarrollan tienen más
probabilidad de ser causantes de infección
y cuáles son sus posibles contaminantes o

2. colonizadores, además estos medios
permiten hacer la identificación y
caracterización del desarrollo de bacterias
con importancia clínica. (2)
El desarrollo adecuado de los
microorganismos en un medio de cultivo se
ve afectado por una serie de factores de
gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.
 Disponibilidad de nutrientes
adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la
investigación microbiológica ha de
contener, como mínimo, carbono,
nitrógeno, azufre, fósforo y sales
inorgánicas. En muchos casos serán
necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia
inductoras del crecimiento. Siempre han
de estar presentes las sustancias adecuadas
para ejercer de donantes o captadores de
electrones para las reacciones químicas que
tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban
originalmente en forma de infusiones de
carne, extractos de carne o extractos de
levadura.
Actualmente, la forma más extendida de
aportar estas sustancias a los medios es
utilizar peptona que, además, representa
una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los
microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen
capacidad de atacar los aminoácidos y otros
compuestos más simples de nitrógeno
presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades
nutritivas específicas por lo que se añade a
muchos medios sustancias como suero,
sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente
pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de
calcio, magnesio, manganeso, sodio o
potasio y sustancias promotoras del
crecimiento, generalmente de naturaleza
vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de
cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades
metabólicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos
microorganismos. (3)
 Presencia (o ausencia) de oxígeno y
otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer
en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el
oxígeno directamente de variados sustratos.
Pero los microorganismos anaerobios
estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin
oxígeno ambiental. En un punto
intermedio, los microorganismos
microaerófilos crecen mejor en
condiciones atmosféricas parcialmente
anaerobias (tensión de oxígeno muy
reducida), mientras los anaerobios
facultativos tienen un metabolismo capaz
de adaptarse a cualquiera de las citadas
condiciones. (3)
 Condiciones adecuadas de
humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el
medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de
las células vegetativas microbianas en los
cultivos. Hay que prever el mantenimiento
de estas condiciones mínimas en las estufas
de cultivo a 35-37ºC proporcionando una
fuente adecuada de agua que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de

3. los cultivos y evitar así que se deseque el
medio. (3)
 Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen
mucho mejor en la oscuridad que en
presencia de luz solar. Hay excepciones
evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos. (3)
 pH
La concentración de iones hidrógeno es
muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayoría de ellos se
desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren
medios más o menos ácidos. No se debe
olvidar que la presencia de ácidos o bases
en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin
embargo inhibirlo o incluso alterar sus
procesos metabólicos normales. (3)
 Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de
forma óptima a temperaturas entre 15 y
43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a
0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos).
En líneas generales, los patógenos
humanos crecen en rangos de temperatura
mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los
saprofítos tienen rangos más amplios. (3)
 Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar
perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan
alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de
los especimenes inoculados en dichos
medios. El sistema clásico para esterilizar
los medios de cultivo es el autoclave (que
utiliza vapor de agua a presión como agente
esterilizante). (3)
La clasificación de los medios de cultivos
resulta ser bastante amplia, ya que su
división atiende a diferentes criterios, los
más conocidos se indican a continuación:
Existen 3 tipos de medios de cultivo según
sus cualidades físicas: líquidos, semisólidos
y sólidos.
Pues la ventaja fundamental de usar un
medio de cultivo líquido, es que permite
que crezcan bacterias que se encuentran en
muy poca cantidad, es decir, cuya
concentración es muy baja en la muestra
que estemos analizando. (4)
Imagen 1. Medios de cultivo líquidos en
tubos de ensayo. Obtenido de:
https://es.scribd.com/doc/234131800/Man
ual-de-microbiologia
Para el caso del medio de cultivo sólido, la
ventaja radica en que permite detectar los
diferentes tipos de bacterias que puedan
encontrarse en una sola muestra. (4)
Entonces el usar uno u otro medio de
cultivo dependerá de lo que busquemos o
queramos: aislar una bacteria que se
encuentre en cantidades muy pequeñas
(medio líquido) o todas las bacterias que
puedan haber en una muestra (medio
sólido).

4. Imagen 2: Medios de cultivo sólidos.
Extraído de:
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.co
m.co/2014/09/tipos-y-funciones-de-los-
medios-de.html
De acuerdo a su utilización pueden ser:
 Medios comunes: Son aquellos que
poseen los componentes mínimos para que
pueda producirse el crecimiento de
bacterias que no necesiten requerimientos
especiales. El medio más conocido de este
grupo es el agar nutritivo o agar común, que
resulta de la adición de agar al caldo
nutritivo. (4)
 Medios de enriquecimiento: Son
aquellos que, además de las sustancias
nutritivas normales, incorporan una serie
de factores indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes.
Este enriquecimiento se hace por adición
de sangre u otros productos biológicos
(sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que
aportan dichos factores. (4)
 Medios selectivos: Son medios
utilizados para favorecer el crecimiento de
ciertas bacterias contenidas en una
población polimicrobiana. El fundamento
de estos medios consiste en facilitar
nutricionalmente el crecimiento de una
población microbiana específica. Un
ejemplo de medio selectivo es el caldo
selenito, que se utiliza para favorecer el
crecimiento de salmonellas y frenar el del
resto de enterobacterias. (4)
 Medios inhibidores: Cuando las
sustancias añadidas a un medio selectivo
impiden el crecimiento de una población
microbiana, se denomina inhibidor. Los
medios inhibidores podrían considerarse
como una variante más restrictiva de los
medios selectivos. Los medios inhibidores
se consiguen habitualmente por adición de
sustancias antimicrobianas o de cualquier
otra que inhiba completamente el
desarrollo de una población determinada.
Un medio inhibidor es el MacConkey que
permite el crecimiento de los gérmenes
Gram negativos e impide el crecimiento de
los Gram positivos. (4)
 Medios diferenciales: Se utilizan
para poner en evidencia características
bioquímicas que ayuden a diferenciar
géneros o especies. La adición de un azúcar
fermentable o un sustrato metabolizable se
utilizan para este fin. El medio MacConkey
es un medio diferencial porque permite
distinguir los gérmenes que fermentan la
lactosa de aquellos que no lo hacen.
También lo son el C.L.E.D. (lactosa
+/lactosa hemólisis), el SS (que es
doblemente diferencial). (4)
Al igual que los medios de cultivo, existen
diferentes técnicas para aislamiento de
microorganismos, dependiendo del
resultado que se busque, aquí se muestran
esencialmente las técnicas por estrías.
El método más usual es la siembra por
estría simple sobre un medio de cultivo
sólido adecuado dispuesta en una placa de
Petri.

5. Estría Múltiples mediante esta técnica se
obtiene colonias aisladas a partir de una
muestra que contenga un elevado número
de gérmenes. (5)
Imagen 3. Resultado de aislamiento
mediante técnica de estría múltiple.
Encontrado en:
http://www.academia.edu/11620994/T%C
3%A9cnicas_de_siembra
En la técnica de los Cuatro cuadrantes se
divide la placa en cuatro cuadrantes. Se
toma el inoculo y se siembra
consecutivamente en 1 – 2 – 3 – 4 .En el
cuarto cuadrante, al menos, obtendríamos
colonias aisladas. (5)
Imagen 4. Aislamiento de
microorganismos mediante la técnica de
los cuatro cuadrantes. A color en:
http://www.academia.edu/11620994/T%C
3%A9cnicas_de_siembra
Imagen 5. Aislamiento por agotamiento.
Disponible en:
http://www.academia.edu/11620994/T%C
3%A9cnicas_de_siembra
La técnica por agotamiento es una de las
más utilizadas en el área de la
microbiología, ya que permite ver el
desarrollo de colonias de forma aislada en
zonas específicas del medio de cultivo, en
este informe se describe la técnica y los
resultados obtenidos mediante esta.
MATERIALES
 Cultivos puros de microorganismos
 Cajas de Petri con medios de
cultivo sólidos
 Mecheros de gas
 Asas redondas y rectas
METODOLOGIA
Se realizar la siembra bacteriana en los
diferentes medios de cultivo (Agar nutritivo
y Agar EMB), mediante la técnica de
siembra por agotamiento, a partir de
cultivos de agua, de la siguiente manera:
1. Con un asa redonda, previamente
esterilizada por calentamiento del
alambre hasta el rojo vivo en el
mechero de gas, se tomó una
muestra del cultivo de
microorganismos.

6. Fig 1. Ilustración del paso 1 del
procedimiento. Disponible en:
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual
/demos/microbiologia/unidades/do
cumen/uni_02/56/cap309.htm
2. Luego se extendió sobre un área
pequeña de la superficie de la caja
con agar nutritivo, en forma de
estrías muy juntas, pero sin hacer
presión para no dañar el agar.
Fig 2. Ilustración del paso 2 del
procedimiento. A color en:
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual
/demos/microbiologia/unidades/do
cumen/uni_02/56/cap309.htm
3. Nuevamente se flamea el asa, se
enfría y después de rozar la siembra
realizada previamente, se extiende
de nuevo por otra zona de la placa
haciendo nuevas estrías. (Este
proceso se repite sucesivamente).
Fig 3. Esquema de los pasos a
seguir para la técnica de siembra
por agotamiento. Obtenido de:
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual
/demos/microbiologia/unidades/do
cumen/uni_02/56/cap309.htm
4. Se llevó a Incubar las cajas, en
posición invertidas, a 37°C durante
24 horas.
5. Tras la incubación, se observaron
las colonias aisladas en alguna
región de la caja inoculada.
RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
La muestra de cultivo que seleccionamos
fue de agua, de los muchos
microorganismos infecciosos que se
encuentran en el medio ambiente, en el
agua se pueden hallar bacterias (como
), virus (como el virus
) y protozoos (como
). (6)
Luego de incubar los microorganismos en
Agar nutritivo y Agar EMB se observaron
los siguientes resultados.

7. Imagen 6. Cultivo de muestra de agua en
agar nutritivo.
El Agar nutritivo es un medio de cultivo
usado normalmente como rutina para todo
tipo de bacteria. Es muy útil porque
permanece solido incluso a relativas altas
temperaturas. Además, el crecimiento
bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor
las colonias pequeñas. Es un medio de
cultivo utilizado para propósitos generales,
para el aislamiento de microorganismos
poco exigentes en lo que se refiere a
requerimientos nutritivos. (4)
Su uso está descripto en muchos
procedimientos para el análisis de
alimentos, aguas y otros materiales de
importancia sanitaria. (7)
Mediante la técnica de agotamiento en agar
nutritivo fue posible estudiar la morfología
de las colonias de forma aislada, ya que
cada colonia bacteriana tiene unas
características determinadas en cuanto a su
forma, borde, elevación, tamaño,
consistencia, etc. (5)
Fig 4. Aspectos más comunes de colonias
microbianas aisladas en medio sólido.
De acuerdo a la figura anterior, las colonias
observadas tenían forma puntiforme, borde
entero, elevación convexa, en cuanto a la
superficie se veía cremosa y brillante de
color amarillento.
Imagen 7. Cultivo en agar EMB obtenido
de una muestra de agua.
El Agar Eosina y Azul de Metileno es un
medio utilizado para el aislamiento y
diferenciación de bacilos entéricos Gram
negativos. Este medio también es conocido
como Agar EMB por sus siglas en inglés.
El uso de la eosina y del azul de metileno
permite la diferenciación de las colonias
fermentadoras de lactosa de las no
fermentadoras. La sacarosa está incluida en
el medio para detectar a los miembros del
grupo coliforme que fermentan más
rápidamente la sacarosa que la lactosa. (4)
Este medio permite diferenciar al grupo
y otros organismos lactosa
negativos de organismos coliformes.

8. Este medio permite el aislamiento selectivo
de enterobacterias y otras especies de
bacilos Gram negativos. La diferenciación
entre organismos capaces de utilizar la
lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son
incapaces de hacerlo, está dada por los
indicadores eosina y azul de metileno; éstos
ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas
bacterias Gram positivas. Muchas cepas de
. Presentan
un característico brillo metálico. Las cepas
que utilizan la lactosa poseen centro oscuro
con periferia azulada o rosada, mientras
que las que no lo hacen son incoloras. Este
medio permite el crecimiento de
. Como colonias rosadas y puntiformes;
la siembra en profundidad permite el
desarrollo de clamidosporas en
Crece en este medio
como colonias puntiformes y
transparentes, mientras que
y otras bacterias oxidativas pueden dar
colonias de color azul lavanda; esto puede
ocurrir aunque las cepas no sean capaces
de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y
ello se debe a la incorporación de azul de
metileno a sus membranas. En este medio
se obtiene además, un buen desarrollo de
especies de . (8)
De acuerdo a lo anterior es posible
identificar que el muestra se encontraban
bacterias Gram -, ya que el medio facilito el
desarrollo de colonias. Según su aspecto es
descartable la presencia de
ya que el aspecto de las
colonias no presentaban brillo metálico,
por el contrario, estas se venían incoloras,
por lo que es posible suponer que los
microorganismos presentes en las cepas no
utilizaban lactosa, como
Presentes precisamente en muestras de
aguas contaminadas, o estancadas.
CAUSAS DE ERROR
 Contaminación del medio de
cultivo por exposición al ambiente
en el que se está realizando la
prueba.
 Rasgar el agar por exceso de
presión cuando se está haciendo el
extendido.
 Estrés que afecte la capacidad de
división del microorganismo, y no
permita observar colonias en el
cultivo, aun cuando el medio
propicie ambiente favorable para su
desarrollo.
CONCLUSIONES
 Cada microorganismo presenta
patrones de diferenciación, que deben
ser tenidos en cuenta si se desea aislar
de una población mixta.
 Las exigencias para el desarrollo es
variante de un microorganismo a otro,
por esto existen diferentes medios de
cultivos que favorecen el crecimiento
de acuerdo a sus requerimientos.
 La importancia de la variabilidad de las
técnicas de aislamiento radica en el
tipo de estudio que se desee hacer.
 La siembra y aislamiento ha permitido
el desarrollo desde el ámbito
farmacológico y clínico, la génesis de
medicamentos específicos para
determinado microorganismo.

9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
1. Biología de los microorganismos –
Michael T. Madigan, John Martinko, Jack
Parker – Editorial Pearson
2. Medios de cultivo, métodos de
siembra – Marcela Sanchez. Publicado el
9 de mar. de 2012 [Internet] Disponible
en:
https://es.slideshare.net/tmfvidal/medios-
de-cultivo-mtodos-de-siembra
3. Los medios de cultivo en
microbiología [Internet]. Extraído de:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/
SeminarioMedios.htm
4. Medios de Cultivo en un
laboratorio de microbiología. Mª
Concepción Casado González. Gertrudis
Torrico Cabezas. María Medina Anguita.
2012 [Internet]. Obtenido de:
https://libroslaboratorio.files.wordpress.c
om/2012/09/medios-de-cultivo-en-un-
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5. Técnicas de siembra. Hugo Pineda.
[Internet] Disponible en:
http://www.academia.edu/11620994/T%
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6. Microbiología del agua. Dr. Félix
Daniel Andueza. Facultad de Farmacia y
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7. Nutritivo Agar [Internet].
Encontrado en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/product
os/b02/nutritivoagar.htm
8. E.M.B. Agar. [Internet].
Disponible en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/product
os/b02/embagar.htm