Este documento describe el desarrollo de variedades de cebolla sin lágrimas y no picantes mediante mutagénesis con iones de neón. Se seleccionaron dos líneas de cebolla con bajos niveles de expresión de ARNm de aliinasa y producción reducida de factor lacrimógeno. Esto resultó en bulbos que no inducen lágrimas ni picor al ser cortados. El desarrollo de estas variedades sin transgénicas puede beneficiar a los consumidores y trabajadores que procesan cebollas.

1. 1
Estandarización de protocolo en la mejora genética para la obtención de variedad
de cebolla sin olor
Protocol standardization in genetic improvement to obtain an odorless onion
variety
Luis Cagua Montaño1
Universidad Estatal de Milagro
Facultad de Ciencias Agrarias
Carrera de Ingeniería Agrícola Mención Agroindustrial
lcagua@uagraria.edu.ec
Diana Castillo Solis2
Universidad Estatal de Milagro
Facultad de Ciencias e Ingeniería
Carrera de Ingeniería en Biotecnología
dcastillos2@unemi.edu.ec
RESUMEN
El factor lacrimógeno de la cebolla (LF) se produce a partir de trans - S-1-propenil-L-cisteína
sulfóxido (PRENCSO) a través de reacciones sucesivas catalizadas por aliinasa (EC 4.4.1.4) y
factor lacrimógeno sintasa (LFS), y es responsable de la propiedad de inducción de lágrimas y
la pungencia de las cebollas frescas. Desarrollamos cebollas sin lágrimas y no picantes de
forma no transgénica irradiando semillas con iones de neón a 20 Gy. Los bulbos obtenidos de
las semillas irradiadas y sus bulbos descendientes producidos por autofecundación se cribaron
mediante evaluación organoléptica de la propiedad de inducción de lágrimas o análisis por
HPLC de la producción de LF. Después de la selección repetida y la producción de semillas por
autofecundación, se identificaron dos bulbos sin lágrimas y no picantes en los bulbos de tercera
generación (M3). Veinte bulbos M4 obtenidos de cada uno de ellos no mostraron propiedades
de inducción de lágrimas o pungencia cuando fueron evaluados por 20 panelistas
sensoriales. Los niveles de producción de LF en estos bulbos fueron aproximadamente 7.5
veces más bajos que los de la cebolla normal. Los bajos niveles de producción de LF se
debieron a la reducción de la actividad de aliinasa, que fue el resultado de una baja expresión
de ARNm de aliinasa (menos del 1% de la de la cebolla normal) y las consiguientes cantidades
bajas de la proteína aliinasa. Estas cebollas sin lágrimas y no picantes deben ser bien recibidas
por todos los que desgarran mientras pican cebollas y aquellos que trabajan en instalaciones
donde se procesan cebollas frescas.
Palabras clave: Allinase .; pungency; production of LF.
ABSTRACT
Onion tear factor (LF) is produced from trans-S-1-propenyl-L-cysteine sulfoxide (PRENCSO)
through successive reactions catalyzed by alliinase (EC 4.4.1.4) and tear factor synthase (LFS)
, and is responsible for the tear inducing property and pungency of fresh onions. We develop
1
Ingeniero Agrícola Mención Agroindustrial, Master en Biotecnología Molecular, Evaluador de Calidad de Laboratorio
Bacteriológico, Docente Universidad Estatal de Milagro
2
Estudiante de Universidad Estatal de Milagro

2. 2
tear-free and non-spicy onions in a non-GMO way by irradiating seeds with neon ions at 20 Gy.
The bulbs obtained from the irradiated seeds and their descendant bulbs produced by selfing
were screened by organoleptic evaluation of the tear induction property or HPLC analysis of the
production of LF. After repeated selection and seed production by selfing, two tearless and non-
pungent bulbs were identified in the third generation bulbs (M3). Twenty M4 bulbs obtained from
each of them did not show tear inducing properties or pungency when they were evaluated by
20 sensory panelists. The levels of LF production in these bulbs were approximately 7.5 times
lower than those of the normal onion. Low levels of LF production were due to reduced alliinase
activity, which was the result of low alliinase mRNA expression (less than 1% of normal onion)
and consequent low amounts of the protein. alliinase. These tearless, non-spicy onions are to
be welcomed by all who rip while chopping onions and those who work in facilities where fresh
onions are processed.
Keywords: Allium cepa L.; pungency; LF formation reactions.
INTRODUCCIÓN
La cebolla de bulbo ( Allium cepa L.) es una de las hortalizas más cultivadas del mundo. Su
producción anual en 2013 se estimó en aproximadamente 85,8 millones de toneladas, lo que
ocupó el tercer lugar después del tomate y la sandía en cantidad en una lista de cultivos de
hortalizas cultivadas en todo el mundo (FAOSTAT , 2013).
La característica más llamativa de la cebolla son sus propiedades picantes e inductoras de
lágrimas, que no son bien recibidas por muchos consumidores. Se han propuesto numerosos
consejos para evitar que se rompa a la hora de picar cebollas, como encender un fósforo, llevar
gafas selladas con gomaespuma, enfriar la cebolla, picarla bajo el agua, etc. El consumo de
cebollas poco pungentes representa ahora entre el 15 y el 25% del consumo total de cebollas
en los Estados Unidos (Block, E., 2009).
De hecho, se han reportado cebollas en las que la aliinasa o el factor lacrimógeno sintasa se
suprimieron a través de la interferencia del ARN . En la mayoría de los países, sin embargo, las
plantas transgénicas recientemente desarrolladas tienen que pasar por un difícil proceso de
aprobación antes de que puedan producirse comercialmente (Eady, CC , 2005).
Recientemente, los haces de iones pesados se han utilizado ampliamente para generar
mutantes de plantas superiores porque, a diferencia de otras técnicas mutagénicas, inducen
mutaciones con alta frecuencia a una dosis relativamente baja, y se pueden obtener varios
fenotipos sin que otras características de la planta se vean afectadas (Kazama, Y. , 2013).
En este estudio, utilizamos un haz de iones de neón para producir una cebolla sin lágrimas y no
picante utilizando el cultivar de cebolla japonés con día largo (sensibilidad a la duración del día:
aproximadamente 14 horas), almacenamiento prolongado (duración de almacenamiento: 6–7
meses), de tamaño mediano a grande (peso del bulbo: 180–260 g) y características de alta
pungencia (contenido de ácido pirúvico: 5–10 μmol / g pf) (Takano, N., 2013).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los productos químicos utilizados se compraron en Wako Pure Chemical (Osaka, Japón)
o Kanto Chemical (Tokio, Japón) a menos que se indique lo contrario. Todos los disolventes
utilizados fueron de calidad cromatográfica. La semilla de cebolla (cultivar 'Super-Kitamomiji')
se adquirió en Plant Breeding Institute Co., Ltd. (Hokkaido, Japón). Las cebollas de día corto de
una variedad desconocida cultivada en Chiba, Nagasaki, Saga, Kagoshima y Shizuoka en
Japón se compraron en una tienda local. La cebolla amarilla normal (cultivar 'Sapporo-Ki')

3. 3
cultivada en el mismo campo y por el mismo método de cultivo que la cebolla sin lágrimas y no
picante se usó como control. La aliinasa se preparó a partir de dientes de ajo frescos usando
una columna de hidroxiapatita y una columna de concanavalina A-Sefarosa 4B como
describieron previamente Imai et al . . La aliinasa purificada se disolvió en tampón de fosfato de
sodio 500 mM (pH 7,0) que contenía glicerol al 10% y fosfato de piridoxal 25 µM a 250
unidades / ml (Imai, S., Akita, K., 2006).
Cuadro 1. En la investigación llevo a cabo medidas de bioseguridad de uso de
materiales de laboratorio de investigación
3. RESULTADOS
3.1 Sitio de estudio
Se sembraron y cultivaron un total de 1.450 semillas M1 de la manera habitual para obtener
457 bulbos maduros, de los cuales se seleccionaron 9 bulbos que presentaban una producción
de factor lacrimógeno más débil o escasa según lo determinado por evaluación organoléptica y
análisis HPLC y se utilizaron para la producción de semillas M2 mediante autofecundación. Se
cosecharon y sembraron aproximadamente 350 M2 de semillas, de las cuales se obtuvieron
197 bulbos y se analizaron para determinar la proteína aliinasa mediante el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se seleccionaron dieciocho bulbos que
mostraban menos de 1/10 de una señal de ELISA mostrada por una cebolla normal (no
irradiada) y se plantaron para la producción de semilla M3 por autofecundación. De las 3.250
M3 semillas cosechadas, se sembraron 1.078 semillas para obtener 466 bulbos, de los cuales
finalmente se seleccionaron dos bulbos (# 6 y # 10) en base a la cantidad de PRENCSO (>
3. 26 μmol / g FW) restantes después de la rotura del tejido y los exámenes organolépticos de
la pungencia.
Figura 1: Una fotografía de los bulbos de cebolla sin lágrimas y no picantes (# 6, # 10) y
el bulbo de cebolla no irradiado
Figura 2: Análisis de la producción de LF en bulbos de cebolla (control, # 6 y # 10).
Guantes Cebolla Mascarilla
Lector de
micro placas
Pocillos Kit de ensayo de
proteína
Mixer Mill Agua
destilada
Fosfato de Sodio

4. 4
Las producciones de LF se presentan como área de pico de LF por μL de sobrenadante. El
control representa la cebolla normal ('Sapporo-Ki') cultivada en el mismo campo y por el mismo
método de cultivo que el n. ° 6 y el n. ° 10. Los datos son la media ± DE, n = 5 (control), n = 19
(tanto el n. ° 6 como el n. ° 10), n = 18 (ambos n. ° 6 + alinasa y n. ° 10 + alinasa). Las diferencias
significativas entre el control y las muestras de prueba mediante la prueba de Dunnett (P <0.01)
(Figura. 2 )
Figura 3: Análisis de ácido pirúvico en bulbos de cebolla (control, cebolla de día corto, #
6 y # 10)
Las concentraciones de ácido pirúvico se presentan como μmol por g de peso de cebolla
fresca. El control representa la cebolla normal ('Sapporo-Ki') cultivada en el mismo campo y por
el mismo método de cultivo que el n. ° 6 y el n. ° 10. El cultivar de día corto representa cebollas
de día corto recolectadas de 5 áreas diferentes (Chiba, Nagasaki, Saga, Kagoshima y
Shizuoka) en Japón. Los datos son la media ± DE, n = 5 (control), n = un total de 5 (uno de
cada área (corto), n = 19 (ambos # 6 y # 10). Diferencias significativas según la prueba de
Tukey-Kramer (P < 0.01) se indican con letras diferentes (Figura 3).
Figura 4: Análisis de PRENCSO en bulbos de cebolla calentados (control, # 6 y # 10).

5. 5
Las concentraciones de PRENCSO se presentaron como μmol por g de peso de cebolla
fresca. El control estaba en la cebolla normal ('Sapporo-Ki') cultivada en el mismo campo y por
el mismo método de cultivo que el n. ° 6 y el n. ° 10. Los datos son la media ± DE, n = 5
(control), n = 19 (tanto el n. ° 6 como el n. ° 10). No se observaron diferencias significativas
entre el control y las muestras de prueba (n. ° 6, n. ° 10) mediante la prueba de Dunnett
(Figura 4).
Figura 5: Análisis de PRENCSO en bulbos de cebolla sin calentar (control, # 6 y # 10).
Las concentraciones de PRENCSO se presentan como μmol por g de peso de cebolla
fresca. El control representa la cebolla normal ('Sapporo-Ki') cultivada en el mismo campo, el
mismo método de cultivo que el n. ° 6 y el n. ° 10. Los datos son la media ± DE, n = 2 (control),
n = 8 (n. ° 6) yn = 9 (n. ° 10). ND, no detectado (Figura 5).
3.2 Estudio estadístico

6. 6
Los datos se presentan como media ± DE. La significación estadística de los datos se evaluó
mediante la prueba de Dunnett o las pruebas de comparación múltiple de Tukey-Kramer. Las
diferencias se consideraron significativas cuando p <0,01.
Discusión
En este estudio, logramos producir dos líneas de cebolla sin lágrimas y no picante mediante el
uso de mutagénesis por haz de iones pesados. Las características sin lágrimas y no picantes
en estas dos líneas se debieron a la reducción significativa de los niveles de expresión de
ARNm de aliinasa. PRENCSO en estas líneas no fue degradado por la alinasa y permaneció
después de la rotura del tejido debido a la ausencia de actividad de la alinasa. Sin embargo,
sigue sin resolverse cómo y por qué los niveles de expresión de ARNm de alinasa en estas dos
líneas son tan dramáticamente más bajos. (Lancaster, JE, Shaw, ML,, 2000)
Una posibilidad es que la mutación se haya producido en un gen de alinasa que se expresa en
el bulbo. Hasta la fecha, se han aislado de Allium cepa dos tipos de genes de alinasa, el tipo de
bulbo y el tipo de raíz . La expresión de los genes del tipo de la raíz en los bulbos de cebolla no
es detectable o, como mucho, es muy baja. Por lo tanto, es más probable que la mutación se
haya producido en el gen del tipo bulbo, si fue el gen afectado por la irradiación del haz de
iones de neón. (Van Heusden, AW, Shigyo, M., 2000)
Además, en el mapa de ADNc intraespecífico informado por Martin et al . dos loci de genes de
aliinasa se ubicaron a distancia en un grupo de ligamiento no asignado a los
cromosomas . Sobre la base del análisis de los dos mapas genéticos elaborados por King et
al . y Martin et al . junto con los resultados del mapeo Tyr-FISH de un clon de aliinasa,
Khrustalevaaet al . asumió que el grupo de ligamiento no asignado que posee los loci de
alinasa pertenecía al cromosoma 4 . No se dispone de información sobre el tamaño de las
deleciones causadas por irradiaciones con haces de iones de neón a una dosis de 20 Gy con
LET a 63 keV / μm, pero a 15 Gy con la misma LET, las irradiaciones supuestamente causaron
deleciones de tamaños que van desde 2 bps a 12 bps en varios genes, y mutaciones de
cambio de marco inducidas en arroz. (Kogure, S., 2013)
En otro estudio basado en el enfoque de secuenciación de ampliaciones, se sugirió que se
habían producido deleciones de menos de 200 kbps a más de 2 Mbps en trigo irradiado a 50
Gy con el mismo LET . Aunque tales deleciones pueden ocurrir en múltiples sitios de los
cromosomas al mismo tiempo, las posibilidades de que ocurran deleciones simultáneas en los
dos loci de los genes de la aliinasa del bulbo ubicados a 6,9 cM de distancia deberían ser
pequeñas. Como sugirieron King et al . , el gen de la aliinasa del bulbo mapeado en uno de los
dos loci podría ser un pseudogén. (King, JJ, Bradeen, 1998)
En el próximo estudio, realizaremos un análisis diferencial de la expresión de la transcripción
utilizando secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNA-seq) entre cebollas sin lágrimas, no
picantes y cebollas normales para analizar las hipótesis anteriores con más detalle. Además,
desarrollaremos una población F2 cruzando cebollas normales con las dos líneas obtenidas en
este estudio y determinaremos la herencia de baja actividad aliinasa en las dos líneas para
revelar cuántos genes son responsables de la baja actividad aliinasa. (Fitzgerald, TL y col,
2015)
Creemos que estas cebollas sin lágrimas y no picantes no solo limpiarán las lágrimas de la
cocina y las instalaciones de procesamiento de alimentos, sino que también agregarán una
nueva dimensión al disfrute de las recetas de cebolla en todo el mundo. (Khrustaleva, L, 2012)
Conclusiones
La manera de neutralizar la cebolla al detener la producción de una enzima que se libera cuando
la cebolla se corta, y esto se logró mediante la aplicación de irradiación con iones. Al deshabilitar
las propiedades reactivas de esta enzima, los científicos han logrado poner fin a una reacción

7. 7
química que produce tanto las lágrimas como el tiosulfato – una sustancia responsable del fuerte
olor de la cebolla.
BIBLIOGRÁFIA
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