1. Tahapan isolasi DNA plasmid meliputi kultivasi bakteri, lisis sel, dan pemurnian DNA plasmid.
2. Lisis sel dapat dilakukan dengan metode alkaline lysis menggunakan larutan A, B, dan C untuk memecah sel bakteri dan melepaskan DNA plasmid.
3. DNA plasmid dipisahkan dari fragmen sel lainnya melalui proses presipitasi dan pembilasan menggunakan natrium asetat dan etanol.
1. ISOLASI DNA PLASMID
Disusun dalam rangaka memenuhi tugas terstruktur
dalam mata kuliah Bioteknologi
Oleh : Amrullah M, S.Pd
8136173002
Kelas A Semester II
TA. 2014
Dosen Pengampu :
Dr. FAUZIYAH HARAHAP, M.Si
2. Isolasi DNA Plasmid
Pada dasarnya plasmid merupakan identitas
genetik yang ditemukan secara alami di dalam
sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot.
Dengan teknik rekayasa genetik, sekarang telah
dikembangkan plasmid artifisial dengan cara
menggabungkan gen-gen dari plasmid alami
maupun genom tertentu (Yuwono, 2009).
3. • Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom
yang dikenal pada bakteri, berutas ganda,
dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001).
• Plasmid merupakan salah satu vektor
pembawa molekul DNA di dalam proses
rekayasa DNA melalui teknologi DNA
rekombinan. Plasmid banyak sekali
digunakan dalam pengklonan DNA, karena
relatif mudah dalam penanganannya.
4. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid,
dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan
sebagai vektor untuk kloning DNA.
Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk
perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa
mengekspresikan gen tertentu.
Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah
karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya
marker sehingga dapat diketahui apakah gen
insert masuk atau tidak, memiliki copy number
yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai
dengan tujuan tertentu.
5. Plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkan
keuntungannya, maka ada banyak cara yang
digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut.
Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri.
Proses ini dikenal sebagai proses mini
preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-
20µg.
Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-
200µg) digunakan midi preparation dan maxi
preparation untuk jumlah yang lebih besar dari
200 µg.
6. Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah
menghancurkan membran sel sehingga semua
organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan
DNA kromosomal serta DNA ekstra kromosmal
(plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja
harus dilakukan pemurnian dari debris
membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya.
Metode yang dapat digunakan untuk isolasi
plasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysis
withdetergent, mechanical lysis, alkaline lysis,
dan enzimatic digestion.
7. Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan
plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor)
kloning, antara lain adalah :
a. Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga
DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;
b. DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih
stabil selama diisolasi secara kimia;
c. Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat
memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang
secara otonomi;
d. Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy)
sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan
membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;
e. Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan
terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih
memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang
membawa gen tertentu.
8. Tahapan Isolasi DNA Plasmid
(Brock, et al., 1994).
Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu :
1. tahap kultivasi dan harvesting,
2. tahap lisis dan
3. tahap pemurnian DNA plasmid.
Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri untuk
memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid
dalam jumlah yang banyak.
Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas
membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas
lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan
sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer
yang juga terintegrasi protein di dalamnya.
Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi,
dan pembilasan DNA plasmid.
9. 1. Kultivasi DNA Plasmid dimulai dengan
tahapan sebagai berikut:
Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam.
15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.
Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl
pH 8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.
10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan.
Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.
Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C.
Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.
Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.
Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam
tabung eppendorf 1,5 ml.
Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-
pelansehingga timbul benang-benang halus DNA.
Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.
Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan.
Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.
Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang
diperlukan.
10. 2. Tahap resuspensi dan lisis DNA
plasmid
Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid:
Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke
dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.
Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1,
didiamkan dalam es selama 5 menit.
Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5
menit.
Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara
membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit.
Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.
Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan
Vortek.
Disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.
11. Senyawa-senyawa kimia
• Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa
kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil
sulfat).
• Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat
magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun
mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.
• Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak
membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis.
• Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan
dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida
(DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol
(mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan
protein dan polisakarida dari larutan).
• Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan
mengendapkan DNA.
12. 3. Tahap pemurnian DNA plasmid
Tahap ini meliputi proses berikut:
Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan
perbandingan 1:1 (v/v).Dicampur dengan vortek.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil.
Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan
PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein
dengan DNA.
Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi
pada 37°C semalam.
Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin.
Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol
70%.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 μl, masukkan ke dalam tabung.
Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada
suhu - 200C. jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian
DNA.
13. Fungsi Penambahan Senyawa
a. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih
tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.
b. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single
stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut
dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan
mencuci plasmid.
c. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula
fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai
DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik
antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai
DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H
dan - pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik
yang tinggi.
d. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk
menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan
DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.
14. Program Pascasarjana UNIMED
Program Studi Pendidikan Biologi
Mata Kuliah: Bioteknologi
Dosen Pengampu: Dr. Fauziyah Harahap, M.Si
By:
Al Khudri Sembiring
8136173001
Kelas: A Semester II
15. Tahapan Isolasi DNA Plasmid metode alkaline
lysis (Birnboim dan Dolly tahun 1979) (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523).
1. Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi
dalam suhu 370 C dan dalam waktu 1 malam.
2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan
menggunakan mikropipet.
3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml.
4. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan
kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet
dan supernatan.
5. Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan
A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam pelet.
16. Fungsi-fungsi Senyawa
EDTA : Thrometamine ethylenediamine tetraacetic acid:
sebagai kofaktor yang esensial bagi aktivitas Dnase dalam
mencacah molekul DNA
Tris HCL: Thrometamine HCL: Buffer menjaga pH,
melindungi isi sel agar tidak lisis.
SDS : Sodium dodesil sulfat : Mendenaturasi protein yang ada
dalam lisat, dengan jalan memutuskan ikatan-katan non
kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga
kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier
polipeptida.
NaOH (sodium hidroksida) : Pemisahan DNA plasmid dari
DNA kromosomal.
17. Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Lanjutan)
6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.
7. Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke
dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian dibolak-
balik 4-6 kali.
8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran
pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu
memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge
dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga
terbentuk supernatan dan pelet.
9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan
ke dalam tabung yang baru kemudian didiamkan selama
1 malam
18. Tahap presipitasi
1. Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan
ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang
telah didiamkan selama 1 malam.
2. Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu -
20C sampai -40C selama 1 jam.
3. Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge
dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.
4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di
atas tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.
19. Tahap pembilasan
1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan menambahkan 2 ml
ethanol 70 % pada pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit.
2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai
kering selama ± 5 menit.
3. Menambahkan 50 mikrolit dH2O pada DNA plasmid dengan menyedot dan
menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna
kuning sampai bercampur.
4. Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya
ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.
HASIL akhir
1. Sentrifuge setelah inkubasi : Terbentuk dua lapisan yaitu supernatan yang
berwarna keruh dan pellet yang berwarna kuning
2. Setelah Penambahab larutan C : Terbentuk endapan putih
3. Sentrifuge setelah penambahan larutan C : Terbentuk 3 lapisan. Lapisan
bawah adalah pellet yang mengandung plasmid lapisan tengah adalah
supernatant, dan lapisan atas adalah debris molekul
20. Fungsi zat-zat
Glukosa: berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidak
pecah.
FKI (Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol) : Memisahkan
kandungan lipid, protein dari DNA, menghilangkan
kontaminan yg masih melekat
NaOAc: menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar
bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbanagan sel agar
tidak lisis
Asam asetat : Menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh
ion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis
sebelumnya
ethanol absolut 70 % : memurnikan DNA
mikrolit dH2O :
21. DAFTAR PUSTAKA
Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004.
Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press.
Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi
5th ed. Jakarta :Erlangga.
Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B.
James D. 2000. Molecular Cell Biology. Wh Freeman
Company
Suryani, Yoni dkk. 2007. Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan
Molekuler. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.
23. Plasmid adalah molekul DNA sirkular berukuran kecil
yang terpisah dari kromsom. Palsmid ini ditemukan di
dlam bakteri dn ragi yang merupakan eukariota
uniseluler. Plasmid dapat bereplikasi tanpa tergantung
dengan genom sel yang lain dan kadang-kadang
ditransfer diantara sel-sel.
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk
kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan
dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran
yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom
Isolasi DNA plasmid
24. Tahapan isolasi DNA plasmid
1. Sampel berupa biakan Escherichia coli yang
mengandung plasmid.
2. Biakan E. Colli kemudian diisolasi dari cawan dan
tumbuhan di dalam 2 ml media LB (Luria Bertani)
yang mengandung 100 ml/gr ampisilin di dalam
shaker (250 rpm) pada suhu 37 0C selama satu
malam.
3. Diendapkan dengan sentrifugasi pada 10.000
rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit
4. Endapan bakteri disuspensikan dalam 300 µl
buffer suspensi sel (50mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM
EDTA).
5. Dilakukan vortex.
25. Fungsi- fungsi Senyawa
Luria Bertani medium yang mengandung Amphisilin ; berguna
untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat
kontaminan yang peka.
Larutan buffer ; untuk menjaga struktur DNA selama
proses penghancuran dan purifikasi sehingga
memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA
serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan
mencegah perubahan pada molekul DNA.
Tris HCl ; Thrometamine HCl; buffer menjaga pH, melindungi
isi sel agar tidak lisis
EDTA ; ethylenediamine tetraacetic acid: menginaktivasi enzim
DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang di isolasi
26. 6. Bila sudah tidak ada endapan, dilisis dengan
menggunakan 300 µl buffer lisis
7. Tabung reaksi di balik-balikkan 8x, dan di biarkan 1-2
menit.
8. Setelah lisis campuran ditambakan 300 µl buffer
netralisasi dan dibalik-balikan kembali agar tercampur rata.
9. Disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm pada suhu 4
0C selama 20 menit.
10. Cairan jernih di bagian atas di ambil dan dipindahkan ke
tabung ependorf yang bersih
11. Cairan yang mengandung DNA plasmid diekstraksi
dengan fenol.
12. Divortex
Tahapan isolasi DNA plasmid (Lanjutan)
27. 13. Disentrifugasi lagi pada kecepatan 10.000 rpm dengan suhu
ruang selama 1-2 menit.
14. Terbentuk dua fase yang dibatasi oleh dua lapisan putih yang
sangat tipis
15. cairan bagian atas dipindahkan ke tabung ependorf yang
bersih atau yang baru
16. Di tambah Rnase dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu
37 0C, untuk menghilangkan RNA.
17. DNA plasmid diendapkan dengan sentrifugasi pada
kecepatan 15.000 rpm selama 20 menit.
18. Endapan dibilas dengan etanol 70% dan disentrifugasi
19. Endapan dikeringkan kemudian ditambah ddH2O dan Rnase.
20. Endapan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37 0C
Tahapan isolasi DNA plasmid (Lanjutan)
28. Fenol ; memisahkan kandungan lipid , protein dari
DNA, menghilangkan kontaminan yang masih
melekat
RNAse ; enzim yang memisahkan DNA dengan
RNA, melisis RNA
Etanol ; dilakukan pencucian dengan etanol,
perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan
residu etanol dari pelet DNA.
Larutan ddH2O dan RNAse : berfungsi
menghilangkan sisa-sisa RNA untuk memperoleh
yang murni
Fungsi- fungsi Senyawa
29. Metode elektroforesis
1. mensuspensikan gel agarose didalam larutan
penyangga yang sesuai (TAE 1x) dengan konsentrasi
tertentu sesuai dengan kebutuhan di dalam
erlenmeyer.
2. Kemudian dipanaskan dengan microwave atau
hot-plate hingga tidak terlihat lagi butiran agarose,
dan dilarutkan menjadi jernih (transparan, tidak
putih).
3. Agarose dibiarkan dingin terlebih dahulu sambil
menyiapkan tempat untuk menuang gel (tray).
4. Kemudian dipasang sisir pada tempat tersebut
5. Setelah suhu turun, agarose dituangkan ke dalam
tempat tersebut.
30. 6. Setelah beku, gel ditempatkan pada alat untuk
elektroforesis sedemikian rupa sehingga sisir
terletak pada kutub negative
7. dituangkan larutan penyangga TAE 1x sampai gel
terendam
8. Sisir diambil secara hati-hati, selanjutnya ditambahkan
ethidium bromida (EtBr) pada larutan penyangga sebagia
pewarna DNA.
9. DNA yang akan dimigrasi dicampur dengan larutan
pewarna (loading dye) untuk menandai laju migrasi.
10. Larutan DNA yang telah di campur loading dye
dimasukkan ke dalam sumur pada gel agarose
menggunakan pipet mikro
Metode elektroforesis (Lanjutan)
31. Fungsi- fungsi Senyawa
TAE : Tris Asetat EDTA; memisahkan molekul
DNA dan RNA
etidhium bromida ; untuk membantu
visualisasi, karena etidhium bromida akan
memendarkan sinar UV
32. 11. Alat elektroforesis dihubungkan dengan alat catu
listrik sedemikian sehingga kutub positif dihubungkan
dengan kutub positif dan kutub negatif dengan kutub
negatif.
12. DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif.
13. Selanjutnya alat catu listrik dihidupkan pada 30-250
volt (tergantung dari besarnya DNA dan larutan
penyangga yang digunakan)
14. Setelah cukup jauh bromfenol biru bermigrasi, catu
listrik dimatikan.
15. Kemudian gel diambil, dibilas dan diperiksa DNA yang
bermigrasi dengan menggunakan sinar ultraviolet.
Metode elektroforesis (Lanjutan)
33.
34. ISOLASI DNA PLASMID
ISOLASI DNA
PLASMID
DEWI SARTIKA SARI
8136173004
PROGRAM
PASCASARJANA
PENDIDIKAN BIOLOGI
35. DNA PLASMID
Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal
yang berbeda karakternya dengan DNA
kromosomal, berupa DNA sirkuler yang terdapat
di sitoplasma, beruntai ganda serta mampu
secara independen bereplikasi.
Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan
terletak di luar kromosom dalam sel prokariot
khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat
rendah seperti khamir.
36. TAHAP ISOLASI DNA PLASMID
Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui
proses :
1. isolasi plasmid
2. elektroforesis
3. visualisasi menggunakan sinar ultraviolet
(UV)
(Yuwono, 2009)
37. ISOLASI DNA
Prinsip Isolasi DNA
Prinsip dasar isolasi total
DNA/RNA
dari jaringan adalah dengan
memecah dan mengekstraksi
jaringan tersebut sehingga
akan
terbentuk ekstrak sel yang
terdiri DNA, RNA dan
substansi dasar lainnya
•Isolasi DNA dilakukan
dengan tujuan untuk
memisahkan DNA dari
bahan lain seperti
protein,lemak, dan
karbohidrat.
Isolasi
•Pemisahan DNA dari
bahan padat seperti
selulosa dan protein
Ekstraksi •Menghilangkan
beberapa kontaminan
seperti senyawa
sekunder (fenol),
polisakarida, RNA dan
juga protein.
Pemurnian
38. METODA
ISOLASI DNA
BAKTERI
Kultur Bakteri
(E.Coli)
- Kultur selama 1 malam
- Sentrifuge (mengambil kultur dan
menghilangkan medium)
Larutan I
(glucose)
Larutan II
(NaOH & SDS)
NaOH : merusak membran
sel
SDS : sabun untuk
menghancurkan membran
sel
Larutan III
(netralisasi)
- sentrifuge
Menggumpal &
menyatu
Supernatan
(berisi DNA)
Indikator untuk melihat
lendir-lendir dimulut
tabung yang menandakan
bahwa bahwa membran sel
telah terpecah
Jika ada larutan
berkonsentrasi
tinggi masuk ke
dalam sel, dengan
sendirinya
membran sel akan
rusak
- Treatment PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl
alcohol)
DNA bebas dari komponen
lain
+ etanol 100% dan NaAc (membantu
pengendapan)
Pengendapan
- Inkubasi
- Cuci dengan EtOH
70%
- Keringkan
DNA murni
39. TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID
1. Sampel bakteri Escherichia coli yang diinkubasi
dalam suhu 370 C dan dalam waktu 1 malam.
2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair
dengan menggunakan mikropipet.
3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung
eppendorf 15 ml
4. endapkan bakteri dengan microsentrifuge
dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit
sehingga terbentuk pelet dan supernatan.
5. supernatan dibuang, kemudian menambahkan
2 ml larutan A (EDTA dan Tris-HCl) ke dalam
pelet.
40. TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID
6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.
7. Ditambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke
dalam campuran pelet dan larutan A. Kemudian
dibolak-balik 4-6 kali
8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran
pelet, larutan A, dan larutan B. Setelah itu
memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge
dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga
terbentuk supernatan dan pelet.
9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan
memasukkan ke dalam tabung yang baru kemudian
didiamkan selama 1 malam
41. FUNGSI- FUNGSI SENYAWA
EDTA : ethylenediami tetraacetic acid :
Menginaktivasi enzime DNAse yang dapat
mendenaturasi DNA yang diisolasi
Tris-HCl ( Thrometamine HCL) : merupakan
buffer yang menjaga pH, melindungi isi sel agar
tidak lisis
NaOH (Natrium Hidroksida) merupakan alkali
yang berfungsi merusak membran sel
SDS (sodium dodecyl sulfate): merupakan
detergen, yang dapat melisis dinding sel dan
mendenaturasi protein.
Ka-Asetat (Kalium asetat) sebagai penetralisir
42. TAHAP PRESIPITASI (PENGENDAPAN)
1. tambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 larutan
ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan
yang telah didiamkan selama 1 malam.
2.Simpan ke dalam freezer dengan
suhu 20C sampai -40C selama 1 jam.
3.Endapkan DNA plasmid dengan disentrifuge
dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.
4. Membuang supernatan dan membalik botol
konikel di atas tissue dan mendiamkannya
selama ± 5 menit.
43. FUNGSI ZAT
NaOAc (Sodium Asetat ): sebagai senyawa
berbentuk larutan untuk presipitasi yakni
mengendapkan DNA.
Ethanol untuk presipitasi DNA (pengendapan)
44. TAHAP PEMURNIAN.
1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh
dengan menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada
pellet dan mendiamkankannya selama ± 5 menit.
2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel
di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit.
3. Menambahkan 50 mikrolit dH2O pada DNA
plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan
kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip
sampai bercampur.
4. Menghisap larutan dengan mikropipet tip dan
memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian
dimasukkan ke dalam freezer.
45. FUNGSI ZAT-ZAT
1. ethanol 70 % untuk membersihkan sisa-sisa
larutan yang digunakan untuk mengendapkan
plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh
plasmid yang murni.
2. mikrolit dH2O berfungsi melarutkan DNA agar
DNA yang diendapkan tercampur (Brown
2010).
46. METODE POLYMERASE CHAIN REACTIONS
(PCR)
Sebanyak 33,6 mL ddH2O (Water Nucleus
Free) dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf.
Kemudian ditambahkan kromosom (template
DNA)1 mL; primer forward 16s rRNA dan primer
reserve 16s rRNA 2 mL;dNTP (10mM) 1 ml; 5 ml
buffer (dapar) PCR dan Mg2+ (MgCl2)sebanyak 5
mL.
PCR (tahap denaturasi awal 94 0C selama
dua menit; penempelan (annealing) 48 0C selama
satu menit, extention 72 0C selama satu menit,
reaksi dilakukan sebanyak 30 siklus).
47. ELEKTROFORESIS
Produk PCR dielektroforesis dan hasil
elektroforesis dilihat dibawah sinar UV 312 nm
menggunakan alat transilluminatorUV (Cole-
Palmer)
Sebagai penampak bercak digunakan ethidium
bromida.
48. Disusun oleh :
Dian RamadhaniTanjung
NPM : 8136173005
Pendidikan Biologi A
ISOLASI DNA PLASMID
49. PLASMID
Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler
(tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di
dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi
secara autonom
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa
molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui
teknologi DNA rekombinan.
50. Beberapa hal yang dapat menyebabkan plasmid dapat
digunakan sebagai wahana (vektor) kloning :
Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga
DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;
DNA-nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil
selama diisolasi secara kimia;
Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat
memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara
otonomi
Mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy)
sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan
membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;
Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap
antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam
mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu.
51. TAHAPAN ISOLASI DNA PLASMID
1. Tahap kultivasi dan harvesting
2. Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid
3. Tahap pemurnian DNA plasmid
52. Tahap kultivasi dan Harvesting
Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri
untuk memperbanyak diri sehingga pada saat
pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang
banyak. Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini
adalah E. coli yang telah tersisipi plasmid.
53. Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut:
1. Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama
1 malam.
2. 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.
3. Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM
Tris HCl pH 8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.
4. 10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan.
5. Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.
6. Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada
suhu 40C.
7. Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.
8. Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.
9. Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan
dalam tabung eppendorf 1,5 ml.
10. Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-
pelansehingga timbul benang-benang halus DNA
11. Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.
12. Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet
dikeringkan.
13. Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.
54. Fungsi Zat – Zat
1. LB ( Lactose broth ) yang terdiri dari Pepton dan ekstrak beef
menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri.
Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat
difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan
pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform.
Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef;
0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.
2. Sentrifugasi adalah proses yang memanfaatkan gaya
sentrifugal untuk sedimentasi campuran dengan menggunakan
mesin sentrifuga atau pemusing
3. Tris HCl pH, NaCl, EDTA, SDS berfungsi untuk
menghilangkan polisakarida sementara
55. 4. TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan
EDTA pada konsentrasi tertentu berfungsi sebagai larutan
penyangga , memiliki kapasitas buffering terendah tetapi
memberikan resolusi terbaik untuk DNA yang lebih besar
Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid)
sebanyak yang diperlukan.
56. 2. Tahap Resuspensi dan Lisis DNA Plasmid
Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas
membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas
lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan
sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid
bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and
Parkers, 1999).
Lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa
kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS
(sodium dodesil sulfat).
57. Berikut ini adalah prosedur resuspensi dan lisis DNA plasmid:
1. Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke
dalam tabung yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.
2. Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam.
3. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
4. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution
1, didiamkan dalam es selama 5 menit.
5. Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5
menit.
6. Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara
membolakbalikkan, diinkubasi dalam es selama 5 menit.
7. Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
8. Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.
9. Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur denga
Vortek.
10. Disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.
58. Fungsi Zat – zat
Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat
magnesium yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun
mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.
Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk
merusak membran sel yang menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel
yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan
cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA
dan RNA).
Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat
protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein
dan polisakarida dari larutan).
Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan
mengendapkan DNA.
59. 3. Tahap pemurnian DNA plasmid
1. Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan
CIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v).
2. Dicampur dengan vortek.
3. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas
diambil.
4. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan
ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk
memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.
5. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase
dan diinkubasi pada 37°C semalam.
6. Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol
absolut dingin.
60. 7. Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC
selama 10 menit.
8. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet
dicuci dengan ethanol 70%.
9. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
10. Pellet dikeringkan, ditambahTE 50 μl, masukkan ke dalam
tabung.
11. Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk
digunakan lebih lanjut pada suhu - 200C. jika perlu DNA
dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian
DNA.
61. Fungsi Zat – zat
Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer,
presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid.
Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin
masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.
Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan
single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut.
etanol absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan
juga untuk membilas dan mencuci plasmid.
62. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada
gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan
menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif.
Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk
menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak
ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah
terpresipitasi.
63. Uji Kuantitas
Uji Kuantitas DNA dilakukan dengan spektrofotometer UV
dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA
yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan
protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA
pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio
OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif
murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi
pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi
konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda
tiap ml (Suharsono danWidyastuti, 2006)
64. Uji Kulitas
Uji Kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis. DNA yang
terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr),
kemudian dilihat di atas sinar ultra violet
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu
harus ditambahkan loading buffer (dye)
Pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan
ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan
DNA standar
65. PCR
Sebanyak 5µl komposisi PCR koloni yang telah dimix dengan
0,3 µl primer L1 dan 0,3µl primer L2, selama dalam mesin
PCR dilakukan pradenaturasi pada suhu 95ºC selama 5 menit,
berlanjut terjadinya denaturasi selama 5 menit, proses
annealing pada suhu 52ºC selama 30 menit, kemudian
extension 72ºC selama 2 menit dan proses akhir selama 10
menit.
66. Restriksi
Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali
urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di
antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut.
Enzim yang digunakan dalam isolasi DNA plasmid adalah
Enzyme tipe II yang menghasilkan fragmen-fragmen tertentu
dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa.
Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara
sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam.
67. Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA
Plasmid
Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-
fragmen, 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%), 1 ul enzim restriksi (10
unit/ul) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke
dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dH2O, larutan penyangga,
DNA plasmid, enzim).
Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C
Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan/enzim restriksi
ditambahkan lagi.
Bila telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan
DNA pada suhu 65-70°C.
Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. NotI, 2. EcoRI, 3.
HindIII, 4. SacI, 5. EcoRI dan HindIII, 6. HindIII dan SacI, 7. NotI dan
HindIII, 8. NotI dan EcoRI.
68. ISOLASI
DNA PLASMID
M. K : BIOTEKNOLOGI
JHONAS DONGORAN ( 8136173010 )
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI ( Kelas- A )
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS NEGERI MEDAN
2014
69. ISOLASI DNA
DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua
kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin
dan pirimdin.
DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat
berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang
menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.
Isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom
dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman,
kultur mikroorganise, atau sel manusia.
70. PLASMID
PLASMID :
Molekul DNA utas ganda sirkular, berukuran kecil yang
terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan
replikasi secara autonom
71. KARAKTER PLASMID
1. Dapat melakukan replikasi
2. Terdapat di luar kromosom
3. Secara genetik dapat ditransfer dengan stabil
1 sel 1 plasmid
72. KELOMPOK PLASMID
1. Plasmid F (fertilitas) ---- gen tra (konjugasi)
2. Plasmid R (resisten) ---- antibiotik, L.B.
3. Plasmid dengan penyandi toksin dan bakteriosin
4. Plasmid degradatif ---- metabolisme mol. organik
(Pseudomonas putida)
5. Plasmid virulensi ---- patogenitas sel inang
(Agrobacterium tumifaciens)
73. Isolasi DNA Plasmid
Isolasi DNA plasmid adalah menghancurkan membran
sel sehingga semua organel sel dapat keluar, sehingga
didapatkan DNA kromosomal serta DNA
ekstrakromosmal (plasmid).
Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu
boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,
alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang
paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode
alkaline lysis.
74. Tahapan Isolasi DNA Plasmid
1) Tahap kultivasi dan harvesting
Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi
bakteri untuk memperbanyak diri sehingga
pada saat pemanenan didapatkan plasmid
dalam jumlah yang banyak.
75. Kultivasi dimulai dengan tahapan sebagai berikut:
- Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, digojog pada suhu 370C,selama 1 malam.
- 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,15 menit, pada suhu 40C.
- Supernatan dibuang, pada pellet ditambahkan 750 μl buffer lisis (100mM Tris HCl pH
8,100mM NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu divortek.
- 10 μl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditambahkan.
- Diinkubasi pada suhu 550C selama 30 menit.
- Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C.
- Dipindahkan supernatannya pada tabung eppendorf 1,5 ml.
- Kemudian ditambahkan 700 μl phenol, digojog pelan.
- Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan dalam tabung
eppendorf 1,5 ml.
- Ditambahkan etanol dingin, perbandingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelansehingga timbul
benang-benang halus DNA.
- Benang-benang halus DNA diambil dan dicuci dengan etanol 70%.
- Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, supernatan dibuang, pelet dikeringkan.
- Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml.
Kemudian dilanjutkan dengan harvesting (pemanenan plasmid) sebanyak yang diperlukan.
76. 2) Tahap resuspensi dan lisis DNA plasmid
Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar
dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid,
lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran
fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and
Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan
menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan
SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel
dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan
integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak
asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk
merusak membran sel. Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan
phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan
protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan,
memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA.
77. Berikut ini adalah prosedur resuspensi
dan lisis DNA plasmid:
Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar, dipindahkan ke dalam tabung
yang telah berisi 5 ml LB-medium dan antibiotik.
Digojok kuat-kuat dalam shaker incubator 37oC, semalam.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 100 ml Lysing solution 1, didiamkan
dalam es selama 5 menit.
Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2, diinkubasi pada es selama 5 menit.
Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3, dicampur dengan cara membolakbalikkan,
diinkubasi dalam es selama 5 menit.
Disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan diambil dalam filter, pellet dibuang.
Ditambah phenol CIAA sebanyak volume supernatan, dicampur dengan
Vortek.
Disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit.
78. 3) Tahap pemurnian DNA plasmid
Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer, presipitasi, dan
pembilasan DNA plasmid. penambahan C-I dilakukan dua kali karena
protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I
pertama. Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan
single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol absolut
dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan
mencuci plasmid. Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge
pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti
rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik
antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA
masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan -
pada O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.
Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol adalah untuk
menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA
dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.
79. Tahap pemurnian meliputi sebagai
berikut :
Lapisan atas hasil dari tahap sebelumnya diambil, ditambahkan CIAA dengan
perbandingan 1:1 (v/v).
Dicampur dengan vortek.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil.
Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI
(fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA.
Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada
37°C semalam.
Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, dan 2 kali volume ethanol absolut dingin.
Dicampur dengan dibolak-balik, didiamkan dalam -20oC selama 10 menit.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, lalu pellet dicuci dengan ethanol 70%.
Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.
Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 μl, masukkan ke dalam tabung.
Tempatkan tabung berisi DNA plasmid pada es untuk digunakan lebih lanjut pada suhu -
200C. jika perlu DNA dapat dielektroforesis untuk menganalisis kemurnian DNA.
80. Fungsi-fungsi Zat / Senyawa
EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil
sulfat). fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara
mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan
integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim
nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang
merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak
membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Untuk
menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat
protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan
protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk
memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan
DNA.
81. Lanjutan,,,!!!
Na Asetat
Fungsinya membuat konsentrasi garam tinggi dan single
stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etanol
absolut dingin akan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk
membilas dan mencuci plasmid.
Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge
pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan
menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam
air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih
lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air
(ingat air memiliki 2 muatan + pada H dan - pada O).
82. Lanjutan,,,!!!
Fungsi penambahan pelarut organik seperti
etanol adalah untuk menurunkan konstanta
dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan
DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih
mudah terpresipitasi.
84. Tahapan Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri
Escherchia Coli
Oleh:
Maiderawati (8136173012)
Program Studi Pendidikan Biologi
Program Pascasarjana
Universitas Negeri Medan
2014
Dosen Pengampu:
Dr. Fauziyah Harahap, M.Si
85. Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari
molekul-molekul lain di inti sel.
Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada
bakteri, berutas ganda, dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001).
Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan terletak di
luar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dan
sel eukariot tingkat rendah seperti khamir. Plasmid
mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang.
Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan menggunakan Escherichia coli sebagai inang
sehingga dalam rekayasa genetika, plasmid sering
digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu
yang diinginkan ke dalam suatu sel inang.
86. Tahapan Isolasi DNA plasmid dari bakteri
Escherchia coli
Tahap isolasi
1. Menyiapkan kultur bakteri Escherichia coli yang diinkubasi dalam suhu 370 C
dan dalam waktu 1 malam.
2. Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan mikropipet.
3. Memasukkan kultur bakteri ke dalam tabung eppendorf 15 ml.
4. Mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm
selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan.
5. Membuang supernatan kemudian menambahkan 2 ml larutan A (EDTA dan Tris-
HCl) ke dalam pelet.
6. Memvortex campuran dengan kecepatan 3500 rpm.
7. Menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan
larutan A. Kemudian dibolak-balik 4-6 kali.
8. Menambahkan larutan C (Ka-Asetat) pada campuran pelet, larutan A, dan larutan
B. Setelah itu memvortexnya dengan menggunakan microsentrifuge dengan
kecepatan 3500 rpm selama 10 menit hingga terbentuk supernatan dan pelet.
9. Mengambil supernatan sebanyak 4 ml dan memasukkan ke dalam tabung yang
baru kemudian didiamkan selama 1 malam.
87. Fungsi Zat-zat
o EDTA dapat berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat
mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang
berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga
membran plasma menjadi tidak stabil.
o Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada
pH nya.
o NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan
mulai menghidrolisis RNA.
o SDS berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan
mendenaturasi protein
o kalium asetat (Ka-Asetat) menyebabkan renaturasi plasmid
88. Tahapan DNA plasmid (Lanjutan)
Tahap presipitasi
1. Menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan
ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah
didiamkan selama 1 malam.
2. Menyimpannya ke dalam freezer dengan suhu -20C sampai -
40C selama 1 jam.
3. Mengendapkan DNA plasmid dengan disentrifuge dengan
kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.
4. Membuang supernatan dan membalik botol konikel di atas
tissue dan mendiamkannya selama ± 5 menit.
89. Fungsi Zat-zat
o NaOAc adalah garam buffer yang membantu proses
pengendapan.
o Ethanol absolut berguna untuk mengendapkan
plasmid karena perbedaan polaritas.
90. Tahapan Isolasi DNA Plasmid (Lnjutan)
Tahap pembilasan
1. Membilas DNA plasmid yang diperoleh dengan
menambahkan 2 ml ethanol 70 % pada pellet dan
mendiamkankannya selama ± 5 menit.
2. Membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas
tissue sampai kering selama ± 5 menit.
3. Menambahkan 50 mikrolit dH2O pada DNA plasmid dengan
menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali
dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur.
4. Memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan
memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian
dimasukkan ke dalam freezer.
91. Fungsi Zat-zat
o Ethanol 70 % berfungsi untuk membersihkan sisa-
sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan
plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh
plasmid yang murni.
o dH2O steril yang berfungsi untuk melarutkan DNA
plasmid.
92. Daftar Pustaka
Akmalia, L. 2012. Tahapan DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli, (Online),
(http://lulluakmalia.blogspot.com/2012/10/laporan-praktikum-bio-logi-sel-uler-mol.html, diakses 14 Januari
2014).
Febrina, G, Dkk. 2011. Isolasi DNA Plasmid, (Online), (http://kampungbiologi.blogspot.com/2011/10/isolasi-
dna-plasmid.html, diakses 14 Januari 2014).
Lab Biomol. 2011. Isolasi DNA, (Online), (http://labbiomol.blogspot.com/2012/12/v-
behaviorurldefaultvmlo_17.html, diakses 14 Januari 2014).
Mubin, A.M. 2013. Isolasi Plasmid Dna Bakteri (E. coli), (Online),
(http://duniapeternakanunram.blogspot.com/2013/12/tugas-pengantar-bioteknologi-isolasi_1580.html,
diakses 14 Januari 2014).
Prima. 2011. Isolasi Plasmid Dan Elektroforesis, (Online), (http://prima31.wordpress.com/2011/03/18/isolasi-
plasmid-dan-elektroforesis/, diakses 14 Januari 2014).
Waliyuddin , M. 2013. Isolasi Dan Pemurnian Dna Plasmid, (online),
(http://muhammadwaliyuddin10.blogspot.com/2013/01/laporan-praktikum-tanisolasi-dan.html, diakses 14
Januari 2014)
93. ISOLASI DNA PLASMID
OLEH : SISKA OBERLINA PURBA
NIM : 813 6173014
DOSEN PENGAMPU :
Dr. FAUZIYAH HARAHAP, M.Si
PROGRAM PASCA SARJANA
PENDIDIKAN BIOLOGI
UNIVERSITAS NERGERI MEDAN
2014
94. Plasmid merupakan salah satu vektor
pembawa molekul DNA di dalam proses
rekayasa DNA melalui teknologi DNA
rekombinan. Plasmid banyak sekali
digunakan dalam pengklonan DNA, karena
relatif mudah dalam penanganannya.
Plasmid adalah molekul DNA utas ganda
sirkuler (tidak berujung) yang berukuran
kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan
dapat melakukan replikasi secara autonom
(Suharsono dan Widyastuti, 2006).
95. Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid
dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara
lain adalah :
a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga
DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;
b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih
stabil selama diisolasi secara kimia;
c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat
memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara
otonomi;
d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy)
sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan
membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;
e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap
antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam
mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et
al., 1994).
96. Tahapan Isolasi Plasmid pada Bakteri E.Coli
Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan,
yaitu
tahap kultivasi dan harvesting, yakni memberikam kesempatan
bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat
pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak .
tahap lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun
atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas
lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan
sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid
bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and
Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan
dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA
(ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat).
tahap pemurnian DNA plasmid menghilangkan protein dari
larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil
RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida
dari larutan).
97. Sambungan...
Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid
ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l,
bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas
shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama
semalam.
Kemudian 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml
lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm (Tomy
MRX-150) 4°C selama 10 menit. Lalu endapan bakteri
disuspensikan ke dalam 100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl
pH 7.5 + EDTA) dan di-vortex.
Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis (0.2M NaOH, 1%
SDS). Suspensi dihomogenkan dengan membolak-balik
tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit.
Buffer netralisasi (1,32M Na-asetat pH 4,8) ditambahkan
sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik
tabung. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm 4°C
selama 10 menit.
98. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian
dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil
alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein
dengan DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung
DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C
semalam.
Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-
asetat pH 5,2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol
absolut untuk mengikat air.
Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam, dilakukan
sentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 menit.
Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi
kembali 10.000 rpm selama 10 menit pada 4°C.
Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya
pelet dilarutkan ke dalam buffer TE (Tris-HCl pH 8 10
mM, EDTA 1 mM).
99. Fungsi Zat-zat
EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat
magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan
integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim
nuklease yang merusak asam nukleat.
Buffer TE Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA
tetap terjaga pada pH nya.
SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan
untuk merusak membran sel atau DNA (DNA double strain
menjadi single strain).
NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal)
dan mulai menghidrolisis RNA. Sehingga DNA
kromosomal akan kehilangan bentuknya setelah
terdenaturasi dan yang dapat diperoleh setelah proses ini
kemungkinan besar adalah DNA plasmid.
100. Sambungan...
PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan
untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya
dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari
senyawa organik dan komponen lipid.
RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa
fragmen RNA.
natrium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan
alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada
DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi.
phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan
chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari
larutan).
Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA
dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).
101. Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi
DNA dengan Spektrofotometer
Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan
mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE.
Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca
absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam
konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas
ganda tiap ml. Untuk mengetahui kemurnian DNA
terhadap kontaminan protein, nilai absorbansi 260
nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.
102. Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan
Elektroforesis Gel Agarosa
Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam
buffer TAE 1x (Tris-HCl pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM,
EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM, asam borat 83 mM,
EDTA 1 mM), dipanaskan hingga jernih dengan microwave.
Setelah suhu tidak terlalu panas (60°C), gel dicetak dengan
menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat
sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke
dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur
dengan larutan pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene
cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%).
Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, λ
yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa.
DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi, direndam
dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di atas UV setelah dicuci
dengan H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara
pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita
DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid
ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.
103. OLEH :
Elena Mayanti Nduru
813673008
Pendidikan Biologi A’ 2013
PRORAM STUDI MAGISTER PENDIDIKAN BIOLOGI
SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MEDAN
T.P. 2013/2014
104. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda
sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil
yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan replikasi secara autonom
(Suharsono dan Widyastuti, 2006)
Plasmid banyak sekali digunakan dalam kloning
gen karena relatif mudah dalam
penanganannya. Untuk itu, DNA plasmid harus
diisolasi.
105. 1. Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung
plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB
semalaman pada suhu 37°C
2. sebanyak 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam
tabung 1,5 ml
3. Diendapkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm
(Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit.
4. Endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100
l buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 +
EDTA), di-vortex
106. Media LB : Luria-Bertani media : media
pertumbuhan bakteri yang terdiri dari ekstrak
ragi, tryptone/pepton, dan NaCl
Tris HCl : Thrometamine HCl : buffer penjaga
pH, melindungi isi sel agar tidak lisis
EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid :
Menginaktivasi enzim DNAse yang dapat
mendenaturasi DNA yang diisolasi
107. 5. Ditambah 200 l buffer lisis (0.2M NaOH, 1%
SDS)
6. Suspensi dihomogenkan dengan membolak-
balikkan tabung sebanyak 6-8 kali
7. Didiamkan selama 3 menit
8. Ditambahkan Buffer netralisasi (1,32M Na-
asetat pH 4,8) sebanyak 300 l.
9. Tabung dibolak-balik agar suspensi menjadi
homogen
10. Disentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10
menit
108. NaOH : Natrium Hidroksida : larutan basa
berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA
(DNA double strain menjadi single strain).
SDS : Sodium Dodesil Sulphate) : merupakan
deterjen yang berperan untuk melisis dinding
atau membran sel yang terdiri dari lipid
(fosfolipid).
Na-Asetat : Sodium asetat : Untuk
menetralkan / menjaga pH
109. 11. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru
12. Diekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-
isoamil alkohol)
13. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA
di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C
semalaman
14. DNA diendapkan dan ditambahkan Na-asetat
pH 5,2 dan etanol absolut
15. Diinkubasi pada 30°C selama 2 jam
16. Disentrifugasi 10.000 rpm 4°C selama 10 m
110. PCI : fenol-kloroform-isoamil alkohol : pelarut
organik untuk memisahkan antara DNA dan
komponen lainnya
Rnase : enzim yang memisahkan antara DNA dan
RNA, melisis RNA
Na-Asetat : Sodium Asetat : Untuk menetralkan
pH
Etanol : mengikat air yang sebelumnya terikat
pada DNA sehingga DNA mengendap dengan
sentrifugasi.
111. 17. Pelet dibilas dengan etanol 70%
18. Disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 10
menit pada 4°C
19. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan.
20. Pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8
10mM, EDTA 1 mM).
112. Etanol 70% : Untuk mendapatkan pelet yang
murni
TE : Tris HCl-EDTA : Menjaga Struktur DNA
tetap seimbang, menetralisir DNA agar tidak
rusak
113. 1. Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan
mengambil 1 l dalam 99 l H2O atau TE
2. Dibaca absorbansinya pada panjang gelombang
260 nm dan 280 nm
3. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260
nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1
OD260 = 50 g DNA utas ganda tiap ml.
4. Untuk mengetahui kemurnian DNA terhadap
kontaminan protein, nilai absorbansi 260 nm
dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.
114. H2O : Air : Untuk mengencerkan suspensi DNA
plasmid
TE : Tris HCl-EDTA : Untuk mengencerkan
suspensi Dna plasmid
115. Gel agarose 1% dipanaskan hingga jernih
dengan microwave.
Pada suhu 60°C, gel dicetak dengan
menggunakan gel tray (cetakan gel) dan
dipasang sisir untuk membuat sumuran, lalu
dibiarkan beku.
Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam
electrophoresis chamber.
Sebanyak 1-2 l DNA dicampur dengan larutan
pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%,
xylene cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%).
116. sampel DNA beserta penanda kuantitas (marker, λ yang
dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel
agarosa.
DNA dimigrasikan, lalu direndam dengan larutan etidium
bromide
Dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O.
Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara
pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan
pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 mg.
Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah
pita di dalam gel.
117. 20 l larutan dH2O+larutan penyangga+DNA
plasmid,+enzim restriksi dimasukkan ke dalam tabung
eppendorf 500 l
Larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C
Dielektroforesis untuk mengecek apakah enzim telah
memotong DNA
Bila telah terpotong, DNA dipanaskan pada suhu 65-
70°C.
Dielektroforesis kembali untuk menentukan ukuran
plasmid dan fragmen-fragmennya.
118. Anam, K. 2010. Isolasi dan Pemetaan DNA
Plasmid. Laporan Praktikum Rekayasa
Genetika, IPB
Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gen
(terjemahan). Yayasan Essentia Medica
Suharsono dan Widyastuti. 2006. Penuntun
Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen.
Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi IPB
119. PLASMID DNA ISOLATION
Compiled by :
SUKMAWATI SUNDARI SIREGAR
8136173016
Pendidikan Biologi-A
Program Pascasarjana
Universitas Negeri Medan
120. OUTLINE
AIMS:
To isolate DNA PLASMID from Bacteria
METHOD:
This is the classical method of isolating plasmid dna, using small resin
filters that nest within a microcentrifuge tube, are also as kits from
suppliers of materials for molecular biology.
TIMING:
It takes about 60 minutes, including a period of 30 minutes when the
materials are being chilled.
121. PLASMID
A plasmid is a small DNA molecule that
is physically separate from, and can
replicate independently of, chromosal
DNA within a cell.
Most commonly found as small circular,
double-stranded DNA molecules in
bacteria, plasmids are sometimes present
in archae and eukaryotic organisms.
They are genetically modified and are
used in the recombinant DNA
technology..They are able of carrying 20
genes at a time
Source:
http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid
123. APPARATUS FUNCTIONS
Beaker Glass are normally used in holding liquids and work with
them during chemical analysis. Generally, beakers are calibrated to
allow the user to measure the liquid that is to be used. The type of
glass that is normally used in making beakers can also be heated and
cooled without breaking.
Vortex Mixers are used in bioscience laboratories to mix two different
chemicals for a desired effect or to dilute an acid or alkali by mixing
them with water.
Centrifuge tubes are conical tubes of various sizes made of plastic or
glass material. They are mainly used in micro-centrifuges in molecular
biology laboratories and vary in capacity.
126. APPARATUS FUNCTIONS
Micropipette tips are used to measure and transfer small
volumes of liquids.
Centrifuges are often used to separate suspensions in liquids.
Because of their high rotation rates, centrifuges are delicate
and can break easily.
Hair drier is for drying the eppendorf tube
127. APPARATUS AND MATERIAL
1 cm3 liquid culture of E.coli containing plasmid DNA, grown overnight at
370C. It is best to use a plasmid with a high copy number. Antibiotics is need in
the medium to mantain the plasmid
crushed ice, in an expanded polystyrene cup, as an incubation container
Lysis Solution I (Resuspension solution):
100 µl Glucose/EDTA/Tris (Get) Buffer
Glucose maintains the osmotic pressure and prevents lysis of the cells
EDTA weakens the cell membrane and bind Mg2+ ions that are needed by
Dnases, protecting the DNA from breakdown
Tris buffers the solution at pH 8
A. MATERIALS
128. APPARATUS AND MATERIAL
Lysis Solution II (lysis solution):
200µl SDS/Sodium Hydroxide (SDS/NaOH) :
SDS dissolves the cell membrane lipids and degrades the celluler proteins
but not plasmid DNA
NaOH splits the double stranded DNA into single strands.
Lysis Solution III (Neutralizing solution)
150µl Potassium acetate/ Ethanoic acid (KOAc)
Ethanoic acid neutralises the solution, enabling the DNA to renature
Potassium acetate precipitates SDS, proteins, lipid, and large DNA molecules
A. MATERIALS
129. TECHIC : HOW TO GET THE PLASMID
DNA Isolation
Cutting The DNA
Combining the DNA
Inserting the DNA recombinant into a living cells
Process of getting the plasmid as a vector shown
on video: DNA cloning.mp4.mp4
130. PROCEDURE
1. Spin down 1 cm3 of
bacterial culture in a 1.5
cm3 microcentrifuge tube
for 1 minute or until a
mass of cells some 2-3
mm in diameter is visible
131. PROCEDURE
2. Decant the supernatant
(liquid) into disinfectant in a
waste container
The substantion result of
centrigutaion are pellet and
supernatant
3. Ensure that all liquid is
removed, using a micropipette to
draw off any thatremains in a
tube
132. PROCEDURE
4. Add 100µl of GET bufffer to
the tube, resuspended the cells by
closing the tube, then flicking the
side repeatedly with a finger.
133. PROCEDURE
SDS is an ionic detergent which
dissolves the phospolipids and
proteins of the cell membrane.
This lyses the cells, releasing the
DNA.
The sodium hydroxide splitts
both the plasmid and
chromosomal DNA into single-
strained molecules, but each
denaturated plasmid remains
stuck as two interwined rings
135. PROCEDURE
8. Very carefully transfer 400µl
of the supernatant (liquid) to a
clean microcentrifuge tube.
Ensure that none of the cell
debris is carried over.
The supernatant contains the
plasmid DNA.
9. Add 400µl of ice cold ethanol.
Mix gently.
137. PROCEDURE
11. Decant the supernatant into a waste
container; taking care not to discard the
pellet of plasmid DNA
12. With a micropipette, remove the last
drops of liquid. If convenient, leave the
uncapped tube to stand at room
temperature for 15 minutes or use a hair
drier so that all the alcohol evaporates.
13. Dissolve the pellet in 15µl of TE
buffer; vigorous mixing is need to ensure
that this happens. Store the plasmid
solution in a freezer or run it on e gel
138.
139. DIFFERENCES
Isolation of plasmids can be done manually or using KIT
is available from a variety of biotechnology companies
(eg Thermo Scientific, Invitrogen, Qiagen, Macherey-
Nagel, Integrated DNA Technology).
Actually both of them use the same principle, namely it
will lysis the chromosomal DNA under alkaline
conditions (Alkaline Lysis), but using KIT more efficient
of time and is usually more pure on plasmid obtained,
but the manual method and is much more economical.
140. VIDEO OF DNA PLASMID ISOLATION PROCESS
1. PLASMID DNA ISOLATION PROCESS BY USING KIT
Plasmid DNA Extraction (Miniprep).mp4
2. PLASMID DNA ISOLATION USING VORTEX AND VIAL
Plasmid isolation protocol.mp4
141. REFERENCES
Bloom mark, et.al. Laboratory DNA Science: An introduction to
recombinant DNA techniques and methods of genome analysis, (Online),
(http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/DNA/PDF/DNA07.pdf,
accessed on January 2014).
Rifa’i Muhammad. 2010. Buku Ajar Genetika MAB4261:Genetika
Rekombinasi dan Populasi,(Online),
(http://muhaiminrifai.lecture.ub.ac.id/files/2011/01/Modul-Genetika.pdf,
accessed on January 2014)
http://www.ppsk.usm.my/lecturers/mravi/PDF_FIles/Plasmidextraction20
02.pdf, accessed on January 2014
143. BIOLOGY EDUCATION
POST GRADUATED PROGRAM
STATE UNIVERSITY OF MEDAN
2013
ISOLATION OF
PLASMID DNA
Compiled by :
Raja Novi Ariska
(8136173013)
144. Plasmid
• Plasmid is a double
stranded, circular extra
chromosomal DNA of
bacterium.
• Used in recombinant
DNA experiments to
clone genes from other
organisms and make
large quantities of their
DNA.
Schematic drawing of a bacterium with its
plasmids.
(1) Chromosomal DNA. (2) Plasmids
145. 1. Fertility-(F)plasmids: they are capable of conjugation or
mating.
2. Resistance-(R) plasmids: containing antibiotic or drug resistant
gene(s). Also known as R-factors, before the nature of plasmids
was understood.
Types of Bacterial Plasmids
3. Col-plasmids: contain genes that code for colicines, proteins
that can kill other bacteria.
4. Degrative plasmids: enable digestion of unusual substances,
e.g., toluene or salicylic acid.
5. Virulence plasmids: turn the bacterium into a pathogen.
Based on their function, there are five main classes:
146. How to Isolate Plasmid DNA??
Alkaline Lysis
a method used in molecular biology to isolate plasmid
DNA or other cell components such as proteins by breaking
the cells open.
Bacteria lyse with an alkaline lysis buffer consisting of a
detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) and a strong base
sodium hydroxide.
The detergent cleaves the phospholipid bilayer
of membrane and the alkali denatures the proteins which
are involved in maintaining the structure of the cell
membrane.
Steps involving agitation, precipitation, centrifugation, and
the removal of supernatant, cellular debris is removed and
the plasmid is isolated and purified.
147. Requirements for Plasmid Isolation
a. Tools
• Micro centrifuge.
• Water bath (37°C).
• Automatic micropipettes
with tips.
• 95-100% isopropanol Ice.
b. Media
• 2 ml Rich medium LB
(Luria-Bertani) containing
antibiotic w/ a single colony
of transformed bacteria
incubate overnight at 37°C.
c. Buffers and Solutions:
• Alkaline lysis solution I.
• Alkaline lysis solution II.
• Alkaline lysis solution III.
• Antibiotic for plasmid
selection.
• Ethanol.
• Phenol: chloroform (1:1,
v/v).
• STE.
• TE (pH 8.0) containing 20
μg/ml RNAse A.
148. Alkaline Lysis Solution
Alkaline Lysis Solution I :
• 50 mM glucose.
25 mM Tris-Cl (pH 8.0).
10 mM EDTA (pH 8.0).
Prepare Solution I from
standard stocks in
batches of approx. 100
ml, sterilize by
autoclaving and store at
4°C.
(For plasmid
preparation.)
Alkaline Lysis Solution II:
• 0.2 N NaOH (freshly
diluted from a 10 N
stock).
1% (w/v) SDS.
Prepare Solution II fresh
and use at room
temperature.
(For plasmid
preparation.)
149. Alkaline Lysis Solution III:
• 5 M potassium acetate, 60.0
ml.
Glacial acetic acid, 11.5 ml.
H2O, 28.5 ml.
The resulting solution is 3 M
with respect to potassium
and 5 M with respect to
acetate. Store the solution
at 4°C and transfer it to an
ice bucket just before use.
(For plasmid preparation.)
• LB Media:
• Deionized H2O, to 950 ml.
Tryptone, 10 g.
Yeast extract, 5 g.
NaCl, 10 g.
To prepare LB (Luria-
Bertani) medium, shake the
ingredients with Distilled
water until the solutes have
dissolved. Adjust pH to 7.0
with 5 N NaOH and make up
the final volume of the
solution to 1 liter with
deionized H2O. Then
sterilize it for 20 minutes by
autoclaving at 15 psi .
150. Procedures
1. Inoculate 2 ml of rich medium
(LB, YT, or Terrific Broth)
containing the appropriate
antibiotic with a single colony
of transformed bacteria.
Incubate the culture overnight at
37°C with vigorous shaking.
2. Pour 1.5 ml of the culture into a
microfuge tube (eppendorf).
Centrifuge at maximum speed
(13.000 rpm) for 30 seconds at
4°C in a microfuge. Store the
unused portion of the original
culture at 4°C.
3. Remove the medium by
aspiration, leaving the bacterial
pellet as dry as possible.
1.5 ml
culture
151. 4. Resuspend the bacterial pellet in 100 μl of ice-cold
Alkaline lysis solution I (Glucose, Tris-Cl (buffering
agent)
, EDTA (metal chelator)
, RNAse A) by vigorous
vortexing.
152. Function of chemical substances
• Rich medium LB : as a medium culture for the
bacteria
• Glucose : maintain the osmotic pressure and
prevent lysis of the cell.
• Tris-Cl : buffers the solution at pH 8
• EDTA : weakens the cell membrane and
chelates Mg2+ ions that are needed by a
DNAses , protecting the DNA from breakdown
• RNAse A : degrades RNA
153. 5. Add 200 μl of freshly prepared Alkaline lysis solution II (NaOH,
SDS) to each bacterial suspension. Close the tube tightly, and
mix the contents well by inverting the tube . Do not vortex.
Store the tube in ice.
SDS
NaOH
• Dissolves e bra es
• Bi ds to a d de atures protei s
• De atures DNA
Because plasmids are supercoiled,
both DNA strands remain
entangled after denaturation
154. • NaOH
The NaOH splits the
double- stranded DNA
into single strands
• SDS
The SDS dissolves the
cell membrane lipids
and degrades the
cellular proteins.
Function of chemical substances
155. 6. Add 150 μl of ice-cold Alkaline lysis solution III (Potassium acetate, Glacial
acetic acid, H2O). Close the tube and disperse Alkaline lysis solution III
through the viscous bacterial lysate by inverting the tube several times.
Store the tube in ice for 3-5 minutes.
1. Potassium acetate / acetic acid solution
• Neutralizes NaOH (renatures plasmid
DNA)
• Co verts soluble SDS to i soluble PDS
sodium dodecyl sulfate potassium dodecyl sulfate
(H2O sol. = 10%) (H2O sol. < 0.02%)
156. Function of chemical substances
• Potassium acetate
The potassium acetate
precipitates SDS,
proteins,lipids and large
DNA molecules.
• Acetic acid
Neutralises the
solution,enabling the
DNA to renature.
• Ethanol ; organic
solvent, precipitates
DNA
157. 7. Centrifuge the bacterial lysate
for 5 minutes at maximum
speed at 4°C in a microfuge.
Collect the supernatant to a
fresh tube.
Separate plasmid DNA from
contaminants by centrifugation
Supernatant contains:
- Plasmid DNA
- Soluble cellular constituents
Pellet contains:
- PDS
- Lipids
- Proteins
- Chromosomal DNA
158. 8. Precipitate nucleic acids
from the supernatant
by adding 2 volumes of
ethanol at room
temperature. Mix the
solution by vortexing
and then allow the
mixture to stand for 2
minutes at room
temperature.
159. • Collect the precipitated
nucleic acids by
centrifugation at maximum
speed for 5 minutes at 4°C in
a microfuge.
• Discard the supernatant
by aspiration.
• Add 1 ml of 70% ethanol to
the pellet and invert the
closed tube several times.
Recover the DNA by
centrifugation at maximum
speed for 2 minutes at 4°C in
a microfuge.
160. • Remove all of the
supernatant by aspiration.
• Remove any beads of
ethanol from the tube. Store
the open tube at room
temperature until the
ethanol has evaporated and
no fluid is visible in the tube
(5-10 minutes).
• Dissolve the nucleic acids in
50 μl of TE (pH 8.0)
containing 20 μg/ml DNase-
free RNase A (pancreatic
RNase). Vortex the solution
gently for a few seconds and
store the DNA at -20°C.
161. Quantifying Plasmid DNA
Quantify DNA using UV absorbance
– DNA UV absorbance peaks at 260 nm
– protein UV absorbance peaks at 230 nm
(peptide bond) and 280 nm (aromatic amino
acids)
– The ratio of the absorbance at 260 nm/280
nm is a measure of the purity of a DNA
sample; it should be between 1.65 and
1.85.
162. DNA Electrophoresis
• The process using electro-field to separate macromolecules
in a gel matrix is called electrophoresis.
• DNA, RNA and proteins carry negative charges, and
migrate into gel matrix under electro-fields.
• The rate of migration for small linear fragments is directly
proportional to the voltage applied at low voltages.
• At low voltage, the migration rate of small linear DNA
fragments is a function of their length.
• At higher voltages, larger fragments (over 20kb) migrate at
continually increasing yet different rates.
• Large linear fragments migrate at a certain fixed rate
regardless of length.
• In all cases, molecular weight markers are very useful to
monitor the DNA migration during electrophoresis.
163. Conformations of Plasmid DNAs
Plasmid DNA may appear in the following five
conformations:
Super Coiled
Linear DNA
SC
Relaxed region
Nicked DNAs
1) "Supercoiled" (or "Covalently Closed-Circular")
DNA is fully intact with both strands uncut.
2) "Relaxed Circular" DNA is fully intact, but "relaxed"
(supercoils removed).
3) "Supercoiled Denatured" DNA. small quantities occur
following excessive alkaline lysis; both strands are uncut
but are not correctly paired, resulting in a compacted
plasmid form.
4) "Nicked Open-Circular" DNA
has one strand cut.
5) "Linearized" DNA has both
strands cut at only one site.
164. Conformation of Plasmid DNAs
The relative electrophoretic mobility (speed) of these DNA
conformations in a gel is as follows:
Nicked Open Circular
(slowest)
Linear
Relaxed Circular
Supercoiled Denatured
Supercoiled (fastest)
165. Reference
• Amrita virtual lab, Plasmid Isolation (Mini Preparation),
available at
http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=77&sim=314&c
nt=1
• NCBE, 2000, Extraction of Plasmid DNA , available at
http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/DNA/P
DF/DNA07.pdf
• Rohde and Henze, 2011, Plasmid Isolation from
Bacteria. Available at
http://www.dsmz.de/fileadmin/Bereiche/Microbiology
/Dateien/Kultivierungshinweise/Plasmid_Isolation_fro
m_Bacteria.pdf
