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Semelhante a Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione
Semelhante a Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione (20)
Mais de Francesco Centorrino
Mais de Francesco Centorrino (17)
Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione
- 1. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione Simone Rinaldi Microbiologia a 360º (Vivere Scienze/Vivere Farmacia)
- 2. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione “Procedura consistente nell'interpretazione di segni e sintomi raccolti, quali manifestazioni di un processo patologico in atto o pregresso” (Enciclopedia Treccani, Dizionario di medicina, 2010) Diagnosi = Esame obiettivo + Anamnesi + Esami strumentali La raccolta di un gran numero di queste informazioni nel corso del tempo e la loro catalogazione fornisce la base per gli studi di Epidemiologia Diagnosi
- 3. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione Aggravamento quadro clinico vs ●Uomini più colpiti delle donne: un mix di stili di vita e fattori biologici Soggetti a rischio Suscettibilità (predisposizione) all'infezione ●Ipertensione arteriosa: overespressione e ruolo del recettore ACE2 ●Patologie pregresse: cardiache, polmonari, oncologiche. Diabete.
- 4. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione ●Il recettore- enzima transmembrana ACE2 fa parte del cosiddetto:”Sistema Renina-Angiotensina- Aldosterone” (SRRA),un complesso insieme di meccanismi molecolari con cui il corpo umano regola il volume dei fluidi extracellulari, in particolare quello sanguigno, in modo da mantenere più o meno costante il valore della pressione sanguigna. ●Il sistema SRRA è a sua volta regolato da neurotrasmettitori come adrenalina e noradrenalina, nonché da ormoni quali il cortisolo, che fanno parte invece di quell'insieme di risposte del sistema nervoso dette:” Fight or Flight” (“Combatti o scappa”). Si tratta di meccanismi evolutisi negli organismi superiori come risposta ad una minaccia ma non devono essere mantenuti attivi per un periodo di tempo prolungato, perchè altrimenti danneggerebbero l'organismo stesso! Il ruolo del recettore ACE2 (in estrema sintesi) Lo stile di vita sbilanciato del mondo moderno porta ad una continua sovraeccitazione delle risposte “Fight or Flight” = STRESS
- 5. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione ●L'ipertensione arteriosa è una delle patologie più frequenti negli adulti ed è causata in prevalenza da stili di vita scorretti (sedentarietà, abuso di alcool e fumo di sigaretta, cattiva alimentazione...): come tale, è conseguenza diretta dello stress. (7,6 milioni di morti ogni anno nel mondo, 280000 in Italia) ●La terapia farmacologica prevede l'utilizzo di molecole che intervengono in vario modo sul sistema SRRA, in modo da mitigarne e regolarne la funzionalità ! I soggetti che soffrono d'ipertensione arteriosa presentano una sovraespressione (overespressione) del recettore ACE2 sul proprio endotelio vascolare, come meccanismo fisiologico di compensazione ai farmaci assunti Suscettibilità (predisposizione) all'infezione: Ipertensione arteriosa Il recettore ACE2 è quasi ubiquitario, ma risulta particolarmente espresso nei polmoni, nei reni e nel cuore.
- 6. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione Il recettore ACE2 è la porta d'accesso preferenziale! Meccanismo di penetrazione del Coronavirus: il recettore ACE2, nei pneumociti polmonari di tipo II che producono il surfattante che impedisce agli alveoli di collassare, rappresenta da solo circa l'83% dei recettori espressi sulla loro superficie. Camostat mesilato
- 7. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione ●Fisiologicamente, ACE2 svolge anche un'importante funzione nel proteggere il polmone dai danni causati da infiammazioni, infezioni e stress vari. ●Quando il virus si lega ad ACE2, ne fa diminuire l'espressione e lo sottrae pertanto allo svolgere il suo ruolo protettivo ●Nelle donne in età fertile, gli estrogeni sono in grado di aumentare la concentrazione di ACE2 anche dopo l'infezione; viceversa, gli androgeni nell'uomo invece sembrano svolgere un ruolo opposto nell'influenzare l'espressione degli enzimi successivi alla penetrazione di SARS-CoV-2. ●Sembra inoltre che il corpo di Barr nelle donne mantenga tuttavia attive porzioni codificanti proprio per il gene di ACE2. La cosiddetta:”Tempesta di citochine” (IL-6, IL-5, TNF-alfa, NF-kB ed altre ancora) che si riscontra nei pazienti infetti, pare inoltre sia dovuta, tra le altre cause, proprio all'interruzione o alla riduzione dell'attività di ACE2 E' tuttavia un po' più complesso di cosi': il ruolo di ACE2 lo rende infatti anche un importante fattore di aggravamento del quadro clinico!
- 8. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione A proposito di “aggravamento quadro clinico”: le vostre domande Patologie pregresse - Malattie infiammatorie croniche intestinali (morbo di Crohn e coliti ulcerose): quale legame col decorso da Covid-19? Studio italiano osservazionale prospettico, pubblicato sulla rivista Gut ed unico finora a livello internazionale: campione di 79 pazienti con patologia in fase attiva e sotto terapia immunosoppressiva che avevano contratto infezione da SARS-CoV-2. Sono state valutate variabili quali età, sesso, comorbidità e tipo di terapia in corso. ● Attività di malattia, età avanzata e presenza di comorbidità sono risultati associati ad un aumentato rischio di polmonite e ad un esito finale infausto (decesso) ●Terapia concomitante biologica o immunosoppressiva non è associata invece a rischio polmonite ed aumento della mortalità: i farmaci utilizzati per le malattie infiammatorie croniche intestinali non incidono inoltre sul decorso della Covid-19. ●!E' importante che la malattia rimanga in remissione: il principale fattore di rischio in questi casi è infatti che la malattia infiammatoria sia in fase attiva, non la terapia.
- 9. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione Patologie pregresse – Malattie sistemiche autoimmuni (Lupus eritematoso, vasculiti sistemiche e malattie autoimmuni): quale legame col decorso da Covid-19? Studio italiano condotto all'ospedale Careggi di Firenze e pubblicato su Autoimmunity Reviews: campione di 458 pazienti, in maggioranza di sesso femminile e con età media di 56 anni. Analisi della prevalenza di casi positivi al Coronavirus (valutata mediante tampone) in questo campione, comparata col totale dei casi positivi nella regione Toscana. Follow up. ●Confermando altre osservazioni recenti, i pazienti affetti da patologie reumatiche non presentano una prevalenza d'infezione maggiore rispetto alla popolazione generale. ●In particolare: il follow up del 56% in trattamento con corticosteroidei ha mostrato come la presenza di una risposta immunitaria attiva potrebbe invece essere associata ad una maggiore suscettibilità a contrarre l'infezione ●! PROBABILE VALORE PROTETTIVO: é importante non interrompere le terapie in corso per le patologie sistemiche autoimmuni
- 10. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione IL GRUPPO SANGUIGNO A (Ancora da convalidare!) Studio condotto dall'Università di Wuhan: le persone con gruppo sanguigno A avrebbero un rischio significativamente più elevato di contrarre l'infezione rispetto a quelle di gruppo 0. Pare inoltre che la mortalità dei soggetti di gruppo A sia maggiore di quella dei soggetti di gruppo 0 in 86 casi su 100. A Wuhan, a fronte di una popolazione di 11 milioni, tra i soggetti sani la prevalenza del gruppo A è del 34% e quella del gruppo 0 è del 32% ; tra i pazienti Covid-19 invece le percentuali diventano 41% (A) e 25% (0). Lo studio sui pazienti ha preso in considerazione un campione di 2173 soggetti. Aggravamento quadro clinico oppure Suscettibilità all'infezione? Forse entrambi... Lo studio,prettamente statistico, non chiarisce però perchè questo avvenga. C'è ancora del lavoro da fare...
- 11. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione Non abbiamo ancora finito di scoprire tutto quello che c'è da sapere sul SARS- CoV-2: le ricerche infatti sono tuttora in corso e sono studi che normalmente richiederebbero anche anni per essere completati (ma siamo in corsa contro il tempo..!). Una recente ricerca pubblicata sul prestigioso JAMA (Journal of American Medical Association), riporta ad esempio come un alterato (diminuito) senso dell'olfatto, oppure del gusto, potrebbe essere un indicatore precoce d'infezione da SARS-CoV-2. Ciò avviene con particolare frequenza nei soggetti moderatamente o pauci sintomatici, importanti diffusori della patologia Covid-19. Se v'interessa approfondire al riguardo, vi segnaliamo questo articolo: https://www.lescienze.it/news/2020/04/21/news/sars-cov- 2_l_alterazione_dell_olfatto_uno_dei_primi_sintomi-4716985/ ! Un sintomo particolare: le alterazioni dell'olfatto (curiosit
- 12. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione I Diagnostica molecolare: “Conosci il tuo nemico” ●Ordine dei Nidovirales, famiglia Coronaviridae, sottofamiglia Orthocoronaviridae, genere Betacoronavirus. ●Virus con envelope (membrana che riveste il capside proteico), sul quale sono presenti: ●* glicoproteine spike (S), tra cui quelle dotate del dominio RBD responsabili dell'interazione col recettore ACE2 nell'uomo ●* proteine M di membrana ●* dimero agglutinina esterasi, responsabile del rilascio dei virioni dalle cellule infette ●* proteina E, che coadiuva la S nell'attacco alla cellula ●Genoma ad RNA, elica (+)
- 13. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione Il metodo d'elezione per confermare una diagnosi di Covid-19 al momento resta il tampone nasofaringeo! ●E' un test sensibile (capacità d'identificare correttamente i soggetti malati) ●E' un test specifico (capacità d'identificare correttamente i soggetti sani) ●Rileva e misura direttamente la presenza del virus (carica virale), NON la risposta dell'organismo all'infezione (come invece fanno i test sierologici). IgM prodotte dal sistema immunitario in 5-6 giorni dall'infezione IgG prodotte dal sistema immunitario in 15 giorni dall'infezione Tempo d'incubazione del SARS-CoV-2: dai 14 ai 20 giorni dall'infezione Diagnostica molecolare “Ad oggi i test basati sull'identificazione di anticorpi (sia di tipo IgM che di tipo IgG) diretti verso il virus Sars-CoV-2 non sono in grado di fornire risultati sufficientemente attendibili e di comprovata utilità per la diagnosi rapida nei pazienti che sviluppano Covid-19 e non possono sostituire il test classico, basato sull'identificazione dell'Rna virale nel materiale ottenuto dal tampone rino-faringeo” Comitato Tecnico Scientifico dell'Istituto Superiore di Sanità, 18 Marzo 2020
- 14. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione
- 16. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione . “Un valore Ct inferiore a 40 è clinicamente riportato come PCR positivo. Questa positività inizia a diminuire entro la settimana 3 e successivamente diventa non rilevabile. Tuttavia, i valori Ct ottenuti nei pazienti ospedalizzati gravemente malati sono inferiori ai valori Ct dei casi lievi e la positività della PCR può persistere oltre 3 settimane dopo l'insorgenza della malattia quando la maggior parte dei casi lievi produrrà un risultato negativo. In una PCR "positiva" il risultato riflette solo il rilevamento dell'RNA virale e non indica necessariamente la presenza di virus vitale. In alcuni casi, l'RNA virale è stato rilevato da RT-PCR anche oltre la settimana 6 dopo il primo test positivo. Alcuni casi sono stati segnalati positivi anche dopo 2 test PCR negativi consecutivi eseguiti a distanza di 24 ore. Non è chiaro se si tratta di un errore di test, reinfezione o riattivazione.” (Nandini Sethuraman. Interpreting diagnostic test for SARS-CoV-2. Jama,6 Maggio 2020) La PCR e' uno strumento potente...ma da sola non basta!
- 17. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione Risultati “falsi negativi”, si possono verificare insomma principalmente a causa di una tempistica inappropriata nella raccolta dei campioni....
- 18. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione ●Nessun test diagnostico esistente è esente da una minima percentuale d'errore! La probabilità che si verifichi è direttamente correlata al numero di ripetizioni del test. ●La variabile umana gioca spesso un ruolo determinante e non prevedibile a priori “Tutti in Lombardia conosciamo persone con sintomi evidenti di covid-19, ma i cui tamponi risultano negativi (e che quindi, ricordo, non rientrano nei conteggi). Sappiamo dalla letteratura internazionale che quasi in un caso su tre si parla di "falsi negativi", cioè pazienti che in realtà hanno ancora il virus, ma questo non viene rilevato.Non sono sempre limiti del test, né, come sostiene qualcuno, segno che il virus è "sceso" tutto ai polmoni. In Lombardia spesso ormai fanno solo il tampone nasale, evitando di fare il prelievo anche dalla bocca, probabilmente per aumentare il numero e accelerare i tempi. E per incrementare la capacità di testare la situazione sono state reclutate per l'esecuzione molte persone che non avevano mai fatto prima questa operazione apparentemente banale, ma che banale non è!” (Dottoressa Roberta Villa, medico e divulgatrice scientifica)
- 19. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione “Tutte le persone con cui ho parlato, mi hanno spiegato che, per avere valore, il prelievo dal naso deve essere eseguito spingendo il tampone verso il basso, per raggiungere appunto la faringe, non le cavità nasali. Alcuni pazienti riferiscono invece che il bastoncino è stato spinto con forza verso l'alto” (Dottoressa Roberta Villa, medico e divulgatrice scientifica) Come per qualunque procedura analitica, la raccolta del campione è uno step fondamentale, la cui scorretta esecuzione può portare a risultati errati anche laddove il resto della metodica sia eseguito correttamente!
- 20. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione Per quanto una raccolta del materiale malfatta infici il successivo test molecolare, questo non è sicuramente l'unico motivo che può portare a risultati falsi positivi oppure falsi negativi! Esistono numerose altre variabili, intrinseche tanto alla natura del test (quantità e qualità del materiale da amplificare) quanto a limiti fisiologici (per esempio una bassa carica virale nei campioni istologici), che possono portare a risultati errati. Sarebbe illogico attribuire unicamente la responsabilità agli operatori che effettuano i tamponi, cosi' come lo sarebbe allo stesso modo considerare il test del tampone inaffidabile I casi di falsi positivi e falsi negativi sinora riscontrati sono esigui, specie alla luce di tutti i casi in cui invece il test del tampone si è rivelato decisivo ed ha permesso di salvare della vite. Resta pertanto lo strumento più affidabile e sicuro di cui disponiamo al momento! ATTENZIONE!
- 21. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione i Ma perchè non provare anche a cambiare approccio? Proteine glicosilate di superficie dell'envelope Proteina spike “S” come target dei test molecolari?
- 22. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione ●Realizzato dal laboratorio dal Dottor Lorenzo Azzi e dal Dottor Mauro Fasano, docenti presso l'Università dell'Insubria di Busto Arsizio, in collaborazione con ● l' Asst (Azienda Socio Sanitaria Territoriale) dei Sette Laghi. ●Già acquisito dall'azienda NatrixLab di Reggio Emilia (che ne sta realizzando il prototipo commerciale), a breve partirà una seconda sperimentazione in vista della sua commercializzazione su larga scala. ●La certificazione Ministeriale necessaria, di cui arriverà presto la convalida, ne consentirà l'utilizzo inizialmente sotto supervisione medica, tuttavia entro un paio d'anni potrebbe esserne autorizzato anche l'uso individuale (domestico). Test salivare: l'innovazione viene dall'Università dell'Insubria
- 23. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione ●Non invasivo e rapido: dai tre ai sei minuti per il risultato. ●Simile ad un test di gravidanza: un campione di fluido biologico (in questo caso saliva) viene posto con una pipetta su una striscia di materiale plastico. La saliva scorre lungo la striscia in appositi canaletti (letti capillari) e a causa di una reazione immunochimica coi reagenti che vi sono contenuti, si formano delle bande colorate: una sola banda risultato negativo due bande risultato positivo ●Lateral flow test”: immunocromatografia a flusso laterale Classica reazione antigene-anticorpo fissato su supporto solido. Sono presenti tre letti capillari, formati da polimeri di nitrocellulosa e dotati della capacità di trasporto capillare dei fluidi, fissati su un dispositivo in plastica. Test rapido salivare (Trs) : come funziona?
- 25. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione "Il test rapido è semplice e sicuro da usare e consente di fare uno screening immediato di primo livello della popolazione. Lo scopo è identificare i soggetti positivi, soprattutto gli asintomatici portatori del virus, da inviare successivamente a eseguire i test diagnostici di riferimento che, basandosi su metodiche molecolari, necessitano del laboratorio con tempi più lunghi di elaborazione" (Dottor Lorenzo Azzi. La Repubblica.it , 6 Maggio 2020 ) “Il test della saliva...non ha assolutamente intenzione di sostituire il tampone nasofaringeo: ha il compito invece di identificare i soggetti che possono essere portatori del virus ma in maniera asintomatica e che altrimenti non sarebbero mai andati a farsi un tampone” (Dottor Lorenzo Azzi. Tg24.Sky.it, 8 Maggio 2020) “Il test è estremamente preciso: durante la sperimentazione, in alcuni casi ha rilevato positività dove invece i tamponi avevano dato esito negativo. A questo punto abbiamo fatto altre analisi ed abbiamo rilevato la presenza del virus sia con tecniche di tipo molecolare che col test rapido, che sono stati concordi nel rilevare il virus nella saliva anche se non era presente nel tampone” (Dottoressa Andreina Baji. Tg24.Sky.it, 8 Maggio 2020) Test rapido salivare (Trs) : quali prospettive?
- 26. Diagnostica molecolare del Coronavirus e fattori di suscettibilità all'infezione ●Integrare il test del tampone con altri metodi, magari più semplici e rapidi ma comunque altamente affidabili, permette d'individuare falsi negativi, inconsapevoli portatori asintomatici o pauci sintomatici...nonchè di monitorare i pazienti in dimissione dagli ospedali: non sempre infatti, a causa delle scarsità di personale e di tamponi disponibili, vengono sottoposti a follow up di controllo! ●Adottare le opportune misure di contenimento, atte ad arginare la diffusione del virus, senza che questo incida necessariamente sull'intera popolazione. Migliorare la diagnostica vuol dire migliorare sempre di più la gestione dell'emergenza