3. 3
Glikogen fosforilaza
• EC 2.4.1.1;
• 1,4-alfa-D-glukan: ortofosfat alfa-D-glikoziltransferaza;
• Skraćenica GP
• Igra ključnu ulogu u metabolizmu ugljenih hidrata jer mobiliše
glikogen
• Katalizuje prvu rekciju u glikogenolizi u kojoj se glikogen prevodi u
glukozu-1-fosfat
5. 5
Glikogen fosforilaza
Struktura i izoenzimi GP
• GP postoji kao dimer i sastoji se iz dve identične subjedinice
• U humanom organizmu postoje tri izoenzima:
• GP-LL, GP-MM i GP-BB.
Distribucija izoenzima:
• GP-LL u jetri
• GP-BB u humanom mozgu
• U srcu su GP-BB i GP-MM, ali dominantan izoenzim je GP-BB.
R i T stanje glikogen fosforilaze
6. 6
Glikogen fosforilaza
• Uloga mišićne glikogen
fosforilaze
• obezbedjuje dovoljno energije za
mišićnu kontrakciju
• Lokacija u miocitima
• asocijacija sa glikogenom i
sarkoplazmatičnim retikulumom i
gradi makromolekulski kompleks.
• Stepen asocijacije GP sa ovim
kompleksom zavisi od
metaboličkog stanja mišića
Kada dođe do tkivne hipoksije, glikogen se razlaže i nestaje, GP postaje
rastvorljiv i može da se pomera sa odeljka peri-sarkoplazmatičnog retikuluma
direktno u ekstracelularnu tečnost
7. 7
Klinički značaj određivanja glikogen fosforilaze i
njenog izoenzima BB
• Preliminarna ispitivanja su polazala:
• GP-BB senzitivniji od CK i CK-MB za dijagnozu AIM u toku prvih 4
sata od pojave bola u grudima
• Rani marker akutnog infarkta miokarda
• Slično drugim citoplazmatičnim proteinima kao što su mioglobin i
CK-MB, dinamika GP-BB može biti pod uticajem reperfuzije
koronarne arterije, sa mnogo bržim povećanjem i većim pikom.
• GP-BB nije specifičan protein za srce
• primena ograničena
10. 10
Metode određivanja glikogen fosforilaze i
izoenzima glikogen fosforilaze BB
1. Određivanje aktivnosti glikogen fosforilaze
a. Metode se zasnivaju na određivanju glukoze-1-fosfata u
kuplovanim reakcijama
2. Separacija i određivanje izoenzima GP BB
a. Elektroforetsko razdvajanje izoenzima GP-BB
b. Novija metoda imunoenzimsko određivanje
– Gornja referentna vrednost ovog eseja je 7 µg/L
11. 11
Aldolaza
• EC 4.1.2.13;
• D-fruktoza-1,6-difosfat-D-gliceraldehid-
3-fosfat-lijaza;
• Skraćenica ALD
• Ovaj enzim katalizuje reakciju hidrolize
tj prevođenja fruktoza-1,6-difosfata u D-
gliceralaldehid-3-fosfat (GLAP) i
dihidroksiaceton (DAP), važne reakcije
u glikolitičkom razlaganju glukoze do
laktata.
13. 13
Aldolaza
• Struktura i genetika
• ALD je tetramer sa subjedinicama koje su određene sa tri različita
genska lokusa.
• Dva lokusa produkuju A i B subjedinice, koje su aktivne u većini
tkiva
• 5 izoenzima od kombinacija A i B subjedinica
• dva odgovaraju A i B homopolimerima
• Izoenzimski profil mozga
– C subjedinica je aktivna samo u mozgu
– Zajedno sa A subjedinicom
– 5 izoenzima (dva homopolimera)
14. 14
Klinički značaj aldolaze
• Serumska ALD ima klinički značaj kod primarnih bolesti
skeletnih mišića.
• Neki istraživači smatraju da povećane aktivnosti ALD se mogu
koristiti za razlikovanje neuromuskularne atrofije od miopatije u
kombinaciji sa odnosom CK/AST.
• Generalno merenje ALD ne pruža dodatne informacije u odnosu
na druge enzime prevashodno CK.
• Ispitivanja su pokazala da određivanje ALD nema benefita u
odnosu CK u evaluaciji pacijenata sa suspektnim oboljenjem
mišića.
15. 15
Metode određivanja aktivnosti aldolaze
• Sve metode određivanja se zasnivaju na reakciji cepanja F-1,6-difosfata.
• Postoje 2 grupe metoda:
– fotometrijska sa fiksnim vremenom i
– kontinuirana
• Osnovna reakcija za određivanje aktivnosti ALD se nadovezuje na dve
kuplovane enzimske reakcije
• Warburgov optički test
• Triozafosfat izomeraza (EC 5.3.1.1) se dodaje kako bi se GLAP brzo
konvertovao u DAP
• Glicerol-3-fosfat dehidrogenaza (EC 1.1.1.8) se dodaje da redukuje DAP u
glicerol-3-fosfat, sa NADH koji deluje kao donor hidrogena
• Meri se porast koncentracije NADH
16. 16
Određivanje aktivnosti aldolaze
Stabilnost enzima
• ALD aktivnost je dosta stabilna
• Aktivnost se ne menja na sobnoj temperaturi do 48 sati i na 4o C
nekoliko dana.
• Hemolizirani uzorci ne treba da se koriste
• Plazmi se daje prednost u odnosu na serum zbog mogućeg otpuštanja
enzima iz trombocita u toku koagulacije.
Referentne vrednosti
• Odrasli: 2,5 do 10 U/L na 37o C
• postoje razlike po polu, muškarci imaju više vrednosti
• novorođenčad imaju 4x veću aktivnost
• deca 2x veću u odnosu na starije
• U pubertetu se dostižu vrednosti kao kod odraslih
