Presentaciones durante el webinar introductorio al Simposio: Edición de genoma. Cambiando la investigación agricola en América Latina.

1. Serie de Simposios de DuPont Plant Sciences
Octubre 17 y 18
Centro Internacional de Agricultura Tropical-CIAT
Palmira-Valle, Colombia
Con el apoyo de

2. Presentación del Webinar
• Introducción a la edición de genomas
Alejandro Brand, BSc
CIAT
• Errores innatos del metabolismo
Pedro M. Hernández, MSc
Pontificia Universidad Javeriana-Cali
• Detección y diagnóstico de enfermedades
Mónica Carvajal, PhD
CIAT

3. Introducción a la Edición de Genomas
Alejandro Brand, BSc
Plataforma de Transformación y Edición de Genomas
CIAT

4. Generar cambios/mutaciones permanentes y heredables en un sitio específico
del ADN. Estos cambios son mediados por los sistemas de reparación del ADN
de la maquinaria celular, que posibilitan la inserción, deleción o alteración de
las secuencias.
Aplicaciones
• Función génica: Knock-out
• Reemplazo de alelos, inserciones, Knock-in.
• Regulación de la expresión génica y epigenética
• Gene Drive
¿Qué significa editar un genoma?
https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/genomeediting

5. ¿Para qué editar un genoma?
• Estudiar la función de los genes (Reverse genetics)
• Tratamientos para combatir efermedades humanas
(HIV, Cancer, etc)
• Corregir enfermedaes hereditarias en embriones
humanos
• Crear modelos animales para el estudio de
enfermedades y tratamientos farmacológicos.
• Mejorar el desempeño de cultivos
• Controlar la propagación de enfermedades (Malaria,
Zika,) (Genedrive)
• Entender los factores de la regulación epigenética
http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(14)00604-7

6. Cambios en el ADN (Mutaciones): fuente de variación genética
Rio Red Grapefruit
https://www.thetreecenter.com/rio-red-grapefruit-tree/

7. Zinc-Fingers
Dominio de unión al DNA + Endonucleasa
Transcription Activator-Like Effector Nucleases
(TALENs)
Activadores de Transcripción + Endonucleasa
Herramientas moleculares usadas en edición de genomas
CRISPR associated Cas9
Nucleasa bacteriana + RNA guía

8. CRISPR/Cas: Sistema inmune bacteriano adquirido
CRISPR-Cas9: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats.
http://rna.berkeley.edu/crispr.html

9. J. Doudna
UC-Berkely
E. Charpentier
Max Plank-Berlin
F. Zhang (MIT-Broad Institute)
Francisco J.M. Mojica
U-Alicante

10. En 2015, el número de artículos relacionados con CRISPR (1185) casi triplicó la cantidad de artículos en los
que se utilizaban algunas tecnicas de edición anteriores (397).
Publicaciones relacionadas con CRISPR (2011-2015)
https://www.elsevier.com/research-intelligence/campaigns/crispr

11. CRISPR/Cas9

12. Inserciones/deleciones
Mutaciones de tamaño variable
Sistemas de reparación del DNA
Ran et al. 2013. Nat Protoc. 8:2281
Mutación/modificación precisa

13. ¿Qué se necesita para editar un genoma?

14. Una mutación en el receptor CCR5 de las
células inmunes, impide el ingreso del virus.
Terapia génica para tratar el HIV

15. Eliminación de virus endógenos en cerdos
https://www.egenesisbio.com/technology/
• Edición de PERVs (Porcine endogenous retrovirus) como
avance en el uso de Xenotransplantes
• Futuro: Editar genes relacionados con
inmunocompatibilidad

16. Gene drive
https://s1-ssl.dmcdn.net/lBSTc.jpg
Difusión de variantes alelicas en la
población a través de la edición
genomas de poblaciones silvestres.
Uso potencial en genes responsables
de la transmisión de virus y parásitos.
¿Cómo propagar una modificación genética de unos
cuantos mosquitos generados en el laboratorio a toda una
población silvestre en corto tiempo?
Herencia Mendeliana convencional

17. Gene drive
https://s1-ssl.dmcdn.net/lBSTc.jpg
Drive sequence
Cas9
Protein
sgRNA
Gen modificado
Difusión de variantes alelicas en la
población a través de la edición
genomas de poblaciones silvestres.
Uso potencial en genes responsables
de la transmisión de virus y parásitos.

18. Gene drive
https://s1-ssl.dmcdn.net/lBSTc.jpg
Difusión de variantes alelicas en la
población a través de la edición
genomas de poblaciones silvestres.
Uso potencial en genes responsables
de la transmisión de virus y parásitos.
La secuencia drive fue heredada con una eficiencia ≥ 98%

19. KO: Polyphenol oxidase (PPO) - Oxidación
KO: granule bound starch synthase GBSSI – Almidón
tipo ceroso (Waxy)
KO: Genes FAD2: Menos ácidos grasos poliinsaturados,
+ acumulación de aceite.
KI: TALENs, inserción alelo en el gen POLLED

20. Errores Innatos del Metabolismo.
Pedro M. Hernandez, MSc., PhD student.
Pontificia Universidad Javeriana-Cali

21. Contenido
Introducción y Justificación
Bases Teóricas
Estrategias Terapéuticas para el Tratamiento de los Errores Innatos
del Metabolismo, EIM.

22. Introducción y Justificación.

23. Los EIM son un grupo de enfermedades de origen genético, que como entidades individuales presentan muy baja prevalencia, pero que como
grupo de enfermedades tienen un alto impacto en la morbilidad y mortalidad infantil.
http://www.metascreen.com.my/newborn-screening/what-is-newborn-screening
Errores Innatos del Metabolismo, EIM:

24. Indels y Polimorfismos de único nucleótido, SNPs.
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a3/Mutaci%C3%B3n_ADN.jpg/250px-Mutaci%C3%B3n_ADN.jpg
http://1.bp.blogspot.com/-Pt_BTnxQflE/UaA4pqbjUGI/AAAAAAAAAFU/8vCGaJfd1v0/s1600/mutacion_adn.gif
http://fr.cdn.v5.futura-sciences.com/buildsv6/images/largeoriginal/0/7/9/0795b855fe_50036520_rnapol-abbondanzieri-dp.jpg

25. Modificación Post traduccional, el role de las chaperonas en el
plegamiento de proteínas y la identificación de errores.
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

26. X
Consecuencias de la degradación prematura de proteínas:
Enfermedades de Acúmulo Lisosomal, LSDs
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
http://images.slideplayer.es/8/2417390/slides/slide_23.jpg
http://www.16deabril.sld.cu/rev/218/image/gaucher2.png

27. CRISPR-Cas9 como Estrategia Terapéutica para el Tratamiento de
los Errores Innatos del Metabolismo, EIM.

28. Estrategias terapéuticas para el tratamiento de los EIM
Trasplante de Células Hematopoyéticas
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/cb/Bone_marrow_biopsy.jpg
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/78/Cellular_tight_
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/19/Membrantransport.p

30. Kimura Y, Oda M, Nakatani T, Sekita Y, Monfort A, Wutz A, et al. CRISPR/Cas9-mediated reporter knock-in in mouse haploid embryonic stem cells. Sci Rep. 2015
https://www.youtube.com/watch?v=D2PLICc3-hM
Kimura Y, Oda M, Nakatani T, Sekita Y, Monfort A, Wutz A, et al. CRISPR/Cas9-mediated reporter knock-in in mouse haploid embryonic stem cells. Sci Rep. 2015
https://thedotingskeptic.wordpress.com/2016/02/06/crispr-cas9-not-just-another-scientific-revolution/
Homology-dependent double strand break repair

31. http://pirros.tripod.com/gaucher/celulamacrofaga.jpg
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
http://www.jci.org on September 30, 2017. https://doi.org/10.1172/JCI21476
*
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32. CRISPR-Cas9, Retos y Potenciales.
https://www.savalnet.cl/cienciaymedicina/progresosmedicos/en-el-corazon-de-la-edicion-genica.html
Ma H, Marti-Gutierrez N, Park S-W, Wu J, Lee Y, Suzuki K, et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human
embryos.
Hong Ma
Professor of Biology
Huck Distinguished Research Professor
Molecular Biology
Cardiomiopatía Hipertrófica
* Padres Homocigoto
Recesivo.
* Enfermedad Genética
Dominante

33. Otros Usos de CRISPR-Cas9 en Salud
https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells
Emily Whitehead y Layla Richards
El CAR en la superficie de la célula está compuesto de fragmentos, o
dominios, de anticuerpos sintéticos.
Los dominios que se utilizan pueden afectar hasta qué punto el
receptor reconoce o se une al antígeno en la célula tumoral.
Avances en la ingeniería intracelular de las células
Expanción clonal
Tiempo de sobrevida en circulación = Persistencia.

34. Detección de ácidos nucleicos con CRISPR-Cas13a
Monica Carvajal, PhD
Virología
CIAT

35. Cas: Proteinas asociadas a CRISPR
Diversidad de sistemas CRISPR-Cas
Sistema Clase Tipo Aislado Proteina Cas Blanco Aplicación
CRISPR/Cas9 2 II Streptococcus pyogenes Cas9 DNA Edición genomas
CRISPR/Cas13a 2 VI Leptotrichia shahii
C2c2
(Cas13a)
RNA
Detección /
Diagnóstico

36. Mark A. Young
CRISPR: Un enfoque alternativo para detectar virus
Yellowstone National Park
Metagenomic date sets- CRSPR
spacers library (2000) Microarrays
Spacer’s probes
• Diseño una plataforma de micro arreglos utilizando las secuencias espaciadoras de CRISPR (son a
menudo derivados de virus) como sondas para detectar virus.
• Las secuencias espaciadoras dentro de los loci CRISPR pueden servir como un registro de los virus
que se han replicado dentro de la célula
• Permite detectar virus que no se han caracterizado previamente
• Demostraron que puede ser usado para monitorear cambios temporales de la poblaciones virales dentro de un ambiente.
Virus diversity
~500 (25%)
Snyder et.al., 2010

37. El uso de CRISPR para el diagnóstico: CRISPR-Dx
Specific
High-sensitity
Enzymatic
Reporter
unLOCKing
Feng ZhangJames Collins
• Detección de patógenos
(nivel attomolar)
• Genotipificación
• Monitoreo de enfermedades
CRISPR-Dx: SHERLOCK
Esta plataforma combina:
• La enzima Cas13a (blanco ARN)
• Una amplificación isotérmica
CRISPR-Cas13a
2017

38. El Sistema de detección SHERLOCK
ARN
ADN
Reacción de amplificacion
Grandes cantidades de ADN
Crear copias de ARN
T7RPA

39. SHERLOCK
+
Cas13a
crARN
Cas13a
OFF ON
=
Secuencia blanco
Cas13a
crARN
+

40. Cas13a
+
Cas13a
crARN
OFF ON
=
Secuencia blanco
SHERLOCK
SEÑAL

41. SHERLOCK en comparación con otros métodos
Sensible
Específico
Sencillos
Rápido
Bajo costo
Gotenberg et al, 2017
qPCR
RPA-SYBR green SHERLOCK
Digital droplet PCR

42. 1) Diagnóstico de enfermedades infecciosas
2) Genotipificación rápida en humanos
Aplicaciones de SHERLOCK
Gotenberg et al, 2017

43. El virus del zika (ZIKV)-ARN
Síntomas tales como: fiebre no muy elevada, exantema, conjuntivitis,
dolores musculares y articulares, malestar o cefaleas.
Asociado a microcefalia en neonates y síndrome de Guillan-Barré
Sherlock es capaz de detectar con alta sensibilidad ZIKV 2aM (1,25 cp/ul) en muestras
de suero (S) y Orina (U)
Detección del virus del Zika (ZIKV) con SHERLOCK
Gotenberg et al, 2017

44. CRISPR-Dx para identificar bacterianas
http://www.huffingtonpost.com https://sueishaqlab.org
GEN ARN ribosomal 16S
Gotenberg et al, 2017
SHERLOCK logro sensibilidad y detección específica de E. coli
y P. aeruginosa

45. 1) Diagnóstico de enfermedades infecciosas
2) Genotipificación rápida en humanos
Aplicaciones de SHERLOCK
Gotenberg et al, 2017

46. • Introducción de cambios sintéticos en los crRNAs para detector diferencias en un solo nucleótido
• Oportunidad para usar SHERLOCK para genotipificación rápida en humanos
Genotipificación rápida en humanos
• Seleccionaron 5 loci en diferentes cromosomas
• SNPs asociados a problemas de salud
Colección de saliva
gDNA
Genotipificaron
SHERLOCK

47. SHERLOCK distingue alelos asociados a enfermedad

48. papel de filtro
Autoclavado
Bloqueo (BSA)
Remocion de RNasas
Lavado
Congelado-secado
Preparación
Reacción Cas13
Muestra
RPA
SHERLOCK: Rápido, portable y bajo costo
$ 0,61 USD/ muestra
+T7polymerase

49. CRISPR-Dx en el campo
Monitoreo y vigilancia de
enfermedades
Evaluar la diversidad genética
de los cultivos
Asistir la toma de decisiones
para la edición de genomas
Diagnóstico rápido, sensible,
confinable y a bajo costo

50. Gracias!
©J.C.Martínez