1. UNIVERSITETI I PRISHTINËS FAKULTETI I SHKENCAVE MATEMATIKE –NATYRORE DEPARTAMENTI I BIOLOGJISË PUNIM DIPLOME TEMA: Efekti i vitaminës C në disa parametra biokimik dhe hematologjik në serum të gjakut të pulës Hybro të ekspozuar Cr (VI) Mentori: Kandidati: Dr.sc. Fetah Halili, prof. ord. Ardian Hyseni Prishtinë 2008

2. FALENDERIMI Për finalizimin e kësaj teme të diplomës falënderoj Dr. sc. Fetah Halili prof. ord. (mentor) për propozimin e temës, Dr. sc. Ismet Bajraktari, prof. ord për këshillat dhe sugjerimet si dhe Dr. sc. Kemajl Bislimi prof.ass. për ndihmesën e dhënë gjatë punës eksperimentale dhe angazhimin konkret në finalizimin teorik të temës. Falënderoj edhe Mr. sc. dr. Nexhmedin Osmani pediater për ndihmën në punë dhe përkthim të literaturës, gjithashtu falenderoj edhe Klementina Hasanaj, Milazim Vokshi si dhe Flakron Shabani për asistim në punimin e analizave biokimike dhe hematologjike. U jam mirënjohës të gjithë kolegëve të Departamentit të Biologjisë për ndihmën në literaturë dhe mbështetjen gjatë studimeve. Një falënderim të veçant ia dedikoj familjes time për mbështetjën dhe ndihmën financiare të pakursyer gjatë studimeve.

3. Hyrje Me ndotje nënkuptojm shkarkimin e një substance (duke përfshirë substanca në formë të ngurtë apo në formë të gaztë), ose energji (duke përfshirë radiacionin, ngrohjen, dritën, zhurmën apo forma tjera të energjisë) në mjedis, që ka potencial domethënës të shkaktoj dëme shendetit njerzorë, organizmave të gjallë, ekosistemeve apo dëme mjedisore. Shkaqet e ndotjes janë të shumta dhe më kryesoret mund të përmendim: ndotjet fizike, kimike dhe biologjike. Në përgjithësi metalet i ndajm në: metale kalimtare, metale të rënda dhe metale të lehta. Metalet e rënda shkatojnë ndryshime edhe në strukturën funksionimin e materialit gjenetik e që janë afatëgjata, pra barten në pasardhës dhe ështe vështirë të përcillen, pasi lajmërohen në gjeneratat e mëvonëshme. Disa nga këto substanca toksike mundë të qëndrojnë për një kohë të gjatë në tokat ose ujërat, ku edhe depozitohen në trupin e organizmave të gjallë dhe të cilat përmes sistemit trofik të arrijnë edhe te njeriu.

4. Të dhëna të përgjithshme për kromin Kromi është minerali i 21-të më i pranishëm në korën e tokës, është pak i përhapur në natyrë, në kore të tokës ndodhet 0.03% (pjesmarrje mase ) i takon elementeve të grupit VI-a të sistemit periodik si dhe hynë në grupin e elementeve tranzite. Konfiguracioni elektronik i kromit është : 1s2 2s2 2p6 3s2 3p6 3d5 4s1 Gjatë djegjes së lignitit në TC e Kosovës lirohen shumë gazëra e pluhur, dhe mbetet shumë hi. Sipas një studimi strategjik mjedisor për Kosovën, 2001, vetëm një njësi e Kosovës A për çdo orë liron 25 ton pluhur. Nëse këtyre të dhënave i shtojmë faktin se deponia e hirit të TC që gjenden afër Prishtinës nuk është mirë e menagjuar, andaj jo vetem TC, por edhe deponia si e tillë është burim potencial i ekspozimit me ndotës, në mesin e tyre edhe me krom që i bënë këto hulumtime edhe më të justifikueshme.

5. Bioakumulimi i kromit në organizëm Sipas studimeve ekotoksikologjike është vërtetuar se akumulimi i kromit në organizëm, bëhet përmes zinxhirit trofik përkatësishtë prej tokës te bimët dhe prej bimëve tek njeriu. Rrugët e hyrjes së kromit (Cr) në trupin e njeriut janë: Përmes frymëmarrjes, gëlltitjes dhe përmes lëkurës. Të dhëna nga disa eksperimente në kafshë tregojnë që kromi Cr (VI) absorbohet me më pak vështirsi sesa Cr (III), me siguri sepse Cr (VI) më lehtë kalon membranat qelizore.

6. Sekretimi i kromit (Cr) Kromi i absorbuar së pari derdhet në urinë me anë të filtrimit glomerular apo hudhet në ndonjë molekulë transportuese organike, një sasi e vogël gjithashtu eliminohet me qime gjatë djersitjes dhe me anë të vrerit. Sekretimi i kormit sidomos përmes sistemit urinar mundë të rritet 10 deri 300 herë në situatë stresuese, apo për shkak të dietave të pasura me karbohidrate. Një përmbledhje e faktorëve të ndyshëm është propozuar nga Anderson (1997): Tab.1 Kromi në sekretimin urinar Kjo tabelë tregon se në cilat situata rritet nevoja për Cr dhe kur përbërja e tij në dietë duhet të rritet. 10,80 Trauma fizike 0,37 Laktacioni 0,28 Dieta të pasura me karbohidrate 0,09 Stresi kronik 0,30 Stresi akut 0,16 Gjendje normale (pa stres) Cr në urinë(mg/ditë) Stres faktori

7. Efektet karcinogjene të kromit (Cr) Në një rast të studimit epidemiologjik të punëtorëve në një fabrikë të kromit të cilët kishin punuar në atë fabrikë për më shumë se një vit, nga 1931-1949 përqindja e vdekshmërisë për shkak të kancerit të mushkërive ishte afër 18,2%, përqindja e pritur ishte 1,2 %. Studimet në punëtorët që punonin me ngjyra kromi, pllaka kromi dhe industrit e ferrokromit gjithashtu na japin një pasqyrë të rëndësishme të lidhjes në mes të ekspozimit të punëtorëve dhe kancerit të mushkërive. Dozat e ulëta të ekpozimit të kromit në përgjithësi shkaktojnë vetëm efekte kalimtare të veshkëve, kurse efekte më të mëdha të kromit në veshkë ndodhin vetëm pas futjes parenterale të dozave më të mëdha.

8. Ekspozimi akut dhe kronik Ekspozimi akut –ekzpozimi për një kohë të shkurtë por me nivel të lartë të përqëndrimit shkakton irritmin në vendin e kontaktit, duke përfshirë ulqerën e lëkurës, iritimin e mukozës së hundës, iritimin e traktit gastrointestinal, dëmtimin e shqisës së nuhatjes dhe ç’ngjyrosjen (verdhosjen) e dhëmbëve dhe gjuhës. Ekspozimi kronik - Kur një trejtje e kromit vjen në kontakt me lëkurën mund të shkaktoj plagë depërtuese të njohura si vrima të kromit apo ulqera kromike, veçanërishtë në zonat ku një dëmtim në epidermë është vetëm i pranishëm, këto ulqera janë zakonishtë jo të dhimbshme por mund të zgjasin me muaj.

9. Roli i vitaminave në zbritjen e efektit toksik dhe kancerogjenik të komponimeve heksavalente të kromit Pra vitamina C, si reduktant i rëndësishëm biologjik i njerzëve dhe kafshëve, mund të përdoret për të transformuar kromin heksavalent në krom esencial jotoksik trivalent. Sipas një studimi në institutin e hulumtimeve të ushqimit të njerzëve në Bratisllavë të Çekosllovakisë, mungesa e vitaminës C në komponimet heksavalente të kromit, në këtë rast (bikromatit të kaliumit) në derrat e egër, ka shprehur efekt mutagjenik dhe toksikologjik. Kromi heksavalent, në nivel molekular qelizor vepron duke shkatëruar struktura të caktuara të ADN-së dhe rritë proceset e reduktimit qelizor.

10. QËLLIMI I HULUMTIMIT Këto hulumtime janë ndërrmarrë me qëllim që të krahasohen rezultatet e fituara për parametra të njejtë për të hulumtuar në dy laboratore të ndryshme, në mënyrë që të vlerësohet efekti i Cr (VI) dhe i vitaminës C në sjelljen e disa parametrave hematologjik si: sedimentimi i eritrociteve, përqëndrimi i hemoglobinës, vlerën e hematokriti;aktivitetin e enzimave: alfa amilaza, GGT, fosfataza alkalike dhe përqëndrimin e kreatininës në gjakun e zogut të pulës (Hybro), pas trajtimit të tyre katërmujorë me dy doza të CrO3 (25 µg / kg / m.t dhe 50 µg / kg / m. t ), si dhe dozat e përmendura të CrO3 +10 mg vitaminë C.

11. MATERIALI DHE METODAT E PUNËS Materiali Si material për hulumtimet tona, janë shfrytëzuar 25 zogjë të pulës Hybro, këta zogjë kanë qëndruar 7 ditë për aklimatizim në vivariumin e Veterinës të Fakultetit të Bujqësië në Prishtinë,dhe pasi janë peshuar janë ndarë në pesë grupe (I-V) me nga 5 individ. Secilit grup përveq grupit kontrollë në ushqim ju shtohen dozat e caktuara të kromit dhe kromit me vitamin C. Zogjtë e çdo grupi, për çdo dite kanë marrë njërin nga këto tretmane: Grupi i I (kontrollë): 0 µg CrO3/kg m.t., Grupi i II: 25 µg CrO3/kg m.t., Grupi III : 50 µg CrO3/kg m.t., Grupi IV : 25 µg CrO3 + 10 mg vit.C/kg m.t., Grupi V :50 µg CrO3 + 10 mg vit. C/kg m.t. Foto.1 Pula Hybro

12. Metoda e marrjes së gjakut Foto. 2. Gjaku merret në venën brahiale nën krahë.

13. 4 . DISA NJOHURI PЁR ANALIZAT HEMATOLOGJIKE Sedimentimi i eritrocitëve Ky parametër është mjaftë i saktë për të treguar çrregullimët në mushkëri dhe disa patologji të tjera në organizëm si p.sh. reumatizmin, karcinoma të ndryshme etj. Metoda e punës Në një eprovetë qesim 200 µl Na citrate, pastaj shtohet gjaku deri te vendi i caktuar në eprovetë.përmbajtja përzihet, pastaj vendoset shtyllza për numrim, leximi bëhet pas një dhe dy orëve. Foto.3. Shtyllëzat për sedimentacion e eritrociteve

14. Hemoglobina Roli kryesor i hemogloginës konsiston në lidhjen reverzibilie të O 2 ngase çdo molekulë e hemoglobinës ka 4 molekula hem pra 4 atome Fe ++ andaj një molekulë hemoglobinë i lidhe 4 molekula O 2 e që prap mbetet dy valent. Metoda e punës Përcaktimi i përqëndrimit të Hb është bërë me ragensa të firmës Human. Reagensi i punës pregaditet, një shishë RGT A dhe një shishë RGT B përzihen në 450 ml ujë të destiluar pastaj e qesim me një shishë të qelqit të mbyllur me tapë, filtri Hg 546 nm. Pastaj lexohet me faktor ku është 368. Foto.4. Aparatura për përcaktimet e analizave biokimike.

15. Hematokriti Paraqet raportin procentual të plazmës dhe elementeve të gjakut (HCT). Për aplikimin e kësaj metode përdoren gypat kapilar special për mbushjen me gjak deri në nivel të caktuar përafersishtë 70 % e gjatësisë. Foto.5..Centrifuga për hematokrit Foto.6. Mbyllësi për kapilar Kapilarët vendosen në centrifugë për hematokrit ashtu qe ana e mbyllur duhet të vendoset kahë periferia, centrifugohen 7 min në 12000 rrotullime për minutë. Pas centrifugimit në kapilar shtresohen dy shtresa, shtresa e elementeve të gjakut dhe plazma. Foto.7. Letra për leximin e hematokritit Foto.8. Lexuesi mbi centrifugë

16. DISA NJOHURI P Ё R ANALIZAT BIOKIMIKE Kreatinina Kreatina me strukturën kimike është acid metilguanidinoktan. Me humbjën e një molekule të ujit nga kjo krijohët kr eatinina,pra ky është anhidrid i kreatininës . Fosfataza alkalike Me termin fosfatazë alkalike nënkuptojmë një grup i tërë enzimeve me një veprim optimal në ambient alkalin me PH 9.8-10.5. Alfa – amilaza- (-1. 4-glucan-4-glucanohydrolase) Janë enzime të grupit të hidrolazave të cilat e zberthejnë glikogjenin. Më parë janë quajtur edhe diastaza. Amilaza hidrolizon 1,4 lidhjet glikozide në vendët fqinje të spiralëve të poliglikonit ashtu që formohet maltoza dhe mbetjet e glukozës nga amilaza. GGT (L-G- Glutamyltransferaze) gjendët në tubulet e veshkave, në murët e zorrëve të holla d.m.th në vendët ku realizohet absorbimi.

17. Tabela 2 . Rezultatet e parametrave hematologjik (sedimentimi i eritrociteve, hemoglobina dhe hematokriti) në gjakun e zogut të pulës Hybro. K:T1=NS K:T2=NS K:T3=NS K:T4=NS T1:T2=NS T1:T3=NS T1:T4=NS T2:T3=NS T2:T4=NS T3:T4=P<0.01 K:T1=NS K:T2=NS K:T3=NS K:T4=NS T1:T2=NS T1:T3=NS T1:T4=NS T2:T3=NS T2:T4=NS T3:T4=NS K:T1=NS K:T2= NS K:T3=NS K:T4=NS T1:T2=NS T1:T3=NS T1:T4=NS T2:T3=NS T2:T4=NS T3:T4=NS Signifik. (p) 0.25±0.013 (5) 91.4±3.95 (5) 1.8± 0.83 (5) T4=50µg CrO3+10mg Vit. C/kg m.t. 0.27±0.012 (5) 98.2±6.0 (5) 1.8± 0.83 (5) T3=25µg CrO3+10mg Vit. C/kg m.t. 0.26±0.030 (5) 96.0±10.8 (5) 2.4± 1.14 (5) T2=50 µg CrO3/kg m.t. 0.25±0.028 (5) 91.9±8.92 (5) 2± 0.7 (5) T1=25 µg CrO3/kg m.t. 0.26 ±0.030 (5) 95.5 ±10.6 (5) 1.6 ± 0.89 (5) K=0 µg CrO3/kg m.t. Hematokriti % Hemoglobina g/L Sedimentimi i eritrociteve mm/h PARAMETRAT HEMATOLOGJIK Grupi i shtazëve dhe doza

18. Tabela 3 . Rezultatet e parametrave biokimik në gjakun e zogut të pulës Hybro. K:T1=P<0.001 K:T2= P<0.001 K:T3= P<0.001 K:T4= P<0.001 T1:T2=P<0.01 T1:T3= P<0.001 T1:T4=NS T2:T3=NS T2:T4=NS T3:T4=P<0.01 K:T1=NS K:T2=NS K:T3=NS K:T4=NS T1:T2=P<0.001 T1:T3=NS T1:T4=NS T2:T3=NS T2:T4=NS T3:T4=NS K:T1=NS K:T2=NS K:T3=NS K:T4=NS T1:T2=NS T1:T3=NS T1:T4=NS T2:T3=NS T2:T4=NS T3:T4=NS K:T1=NS K:T2= NS K:T3=NS K:T4=NS T1:T2=NS T1:T3=NS T1:T4=NS T2:T3=NS T2:T4=NS T3:T4=NS Signifik. (p) 32.4±2.96 (2) 92.7±9.6 (2) 24.55±12.2 (2) 31.7±0.64 (2) T4=50µg CrO3+10mg Vit. C/kg m.t. 21.4±0.70 (2) 79.0±1.41 (2) 22.15±2.61 (2) 30.7±7.14 (2) T3=25µg CrO3+10mg Vit. C/kg m.t. 21.6±2.05 (2) 97.3±1.69 (2) 17.85±3.46 (2) 34.1±1.62 (2) T2=50 µg CrO3/kg m.t. 30.0±1.41 (2) 123.4±33.3 (2) 12.0±8.3 (2) 31.1±1.55 (2) T1=25 µg CrO3/kg m.t. 7.9±0.98 (2) 89.55±14.2 (2) 183.0±91.8 (2) 35.9±7.14 (2) K=0 µg CrO3/kg m.t. - GT U/L - amilaza U/L Fosfataza alkalike U/L Kreatinina µmol/L PARAMETRAT BIOKOMIK Grupi i shtazëve dhe doza

19. Grafiku 1. Efekti i ingjestionit katër mujor i dy dozave të Cr (VI) dhe Vit. C në sedimentimin e eritrociteve në gjakun e pulës Hybro. Grafiku 2. Efekti i ingjestionit katër mujor i dy dozave të Cr (VI) dhe Vit.C në përqendrimin e hemoglobinës në gjakun e pulës Hybro.

20. Grafiku 3. Efekti i ingjestionit katër mujor i dy dozave të Cr (VI) dhe Vit.C në vlerën e hematokritit në gjakun e pulës Hybro. Grafiku 4. Efekti i ingjestionit katër mujor i dy dozave të Cr (VI) dhe Vit.C në përqëndrimin e kreatininës në gjakun e pulës Hybro.

21. Grafiku 5. Efekti i ingjestionit katër mujor i dy dozave të Cr (VI) dhe Vit.C në aktivitetin e fosfatazes alkalike në gjakun e pulës Hybro. Grafiku 6. Efekti i ingjestionit katër mujor i dy dozave të Cr (VI) dhe Vit.C në aktivitetin e α –amilazës në gjakun e pulës Hybro.

22. Grafiku 7. Efekti i ingjestionit katër mujor i dy dozave të Cr (VI) dhe Vit.C në aktivitetin e GGT në gjakun e pulës Hybro

23. 7. DISKUTIMI Gjatë diskutimit të rezultateve të hulumtimit tonë që kanë të bëjnë me efektet e ingjestionit katërmujor të Cr (VI) në disa parametra biokimik të serumit të zogut të pulës Hybro,duhet theksuar se në kuptimin më të gjerë këto rezultate përputhen me rezultatet e disa hulumtimeve të mëhershme të fituara me monitoring pasiv (kërmij H. pomatia, krimba të dheut LL. terestris ) apo monitoring aktiv ( zogjtë e pulës Hybro) në Departamentin (Halili, 1980; Cakaj, 2004; Gashi et al , 2005, 2006). Rezultatet e hulumtimit tone të kaptinës hematologjike dhe biokimike të serumit të zogjëve të të gjitha grupeve eksperimentale, tregojnë se efekti toksik i kromit gjashtëvalent varet nga doza, koha e veprimit dhe parametri hematologjik përkatësisht biokimik.Rezultatet e hulumtimit tonë tregojnë se vitamina C e kombinuar me Cr (VI) në disa raste e “zbut” efektin toksik të Cr heksavalent (sedimentimi i eritrociteve, kreatinina, alfa amilaza), kurse në rastet tjera vepron së bashku me kromin në mënyrë sinergjike, në kuptim të rritjes së efekteve toksike të Cr (VI), fosfatazes alkalike, rritje shumë e lehtë e GGT , ose nuk vërehet fare efekti i saj psh. hemoglobina dhe hematokriti. Komentin e fillojmë me sedimentimin e eritrociteve, ku nuk kemi vërejtur ndonjë ndryshim në mes grupit të zogjëve kontrollë dhe atyre të trajtuara për katër muaj me krom VI valent. Nuk kemi hasur në të dhëna në literaturë të cilat flasin për implikimin e Cr (VI) në sedimentimin e eritrociteve, por sa i përket vlerës së hematokritit dhe sasisë së hemoglobinës në kuptim më të gjërë rezultatet e hulumtimit tonë përputhen me hulumtimet autorëve tjerë si psh te pëllumbi (Kendel dhe Scalon, 1982; Andres dhe bashkëp., 1982), patat (Pain dhe Rattner, 1988) dhe te mjellmat (Simpson dhe bashkëp.,1979) të intoksikuara me plumb. Përndryshe analiza e vlerës së hematokritit dhe hemoglobinës nuk mund të shërbejnë si indikator besnik i intoksikimit me doza të vogla të plumbit (Prpic-Majic , 1984) në rastin tonë ndaj dozave të vogla të ekspozuara me krom si dhe krom + Vit. C

24. Nga e gjithë kjo që u tha më lartë del se ndonëse te zogjtë e trajtuar me Cr (VI), vlera e kreatininës edhe pse kane një ngritje të lehtë nuk është sinjifikante në krahasim me grupin kontrollë, por për shkak të rolit të rëndësishëm të kreatininës, ne konsiderojmë se çdo ndryshim në aktivitetin e këtij enzimi është pasojë e veprimit të toksikantëve të ndryshëm. Rezultatet tona tregojnë për ulje të aktivitetit të FA në të gjitha grupet e trajtuara me Cr (VI) dhe Cr (VI) me vit. C, e që janë në përputhje me rezultatet e Sastry et Sharma. 1979 , Sastry et Agraval,1979 ,Sastry et Gupta 1979, konstatojnë inhibim të FA në llojet e ndryshme të shtazëve pas trajtimit të tyre me pesticide apo metale të rënda. Po ashtu Rozhaja 1980, pohon se aktiviteti i FA inhibohet mbi një përqendrim të caktuar të metaleve të rënda, që është në përputhje me rezultatet e hulumtimit tonë për rënje të aktivitetit të FA te zogjtë e trajtuar me krom në krahasim me kontrollën . Ndërsa te parametrat e alfa amilazes është vërejtur një rritje në parametrat e ekspozuara me krom pa vitaminë C. Rritja e aktivitetit të saj është e lidhur kryesisht me sëmundjen e melçisë dhe kanaleve biliare. Sa i përkët komentit të rezultateve të hulumtimit tonë që kanë të bëjnë me aktivitetin e enzimeve GGT , të zogjtë e trajtuar me Cr (VI), po theksojmë se kemi pas një rritje signifikante të keti enzimi gati se në të gjitha dozat e dhëna perveç kontrollës, prandaj kjo është vërtetuar edhe te psh; Mostagni et al 2005, dhe El-Demerdash, et al 2000, B. Bislimi, 2008. Andaj kemi një rritje jo të lartë të vlerave në serumin e gjakut të pulave Hybro kjo tregon për mungesë të metastazës në mëlçi. Te ikteri obstruktiv, GGT rrit aktivitetin për 10-20 herë, prandaj me daljen e bilës në serum rritet aktiviteti i kësaj enzime. Po ashtu aktiviteti i GGT rritet te ciroza e melçisë.

25. GGT normalizohet e fundit në serum në krahasim me markeret tjerë të melçisë. Prandaj përcjellja e aktivitetit të kësaj enzime në serum mundëson që të përcillet suksesi i terapisë dhe prognoza e hepatitit. Te hepatitis alkoolik vlera e kësaj enzime është e lartë, prandaj kjo enzimë shërben për zbulimin e alkoolisteve kronik etj. Mospërputhja e rezultatetve të hulumtimit tonë me rezultatet e hulumtimeve te autorëve të tjerë që kane të bejnë me toksikogjine e kromit ne e arsyetojmë me faktin se kemi aplikuar doza të ulëta të Cr (VI) , që janë të përafërta ose edhe më të ulëta nga ato që merrë njeriu me rrugë nutritive.