3. � Bệnh phẩm phải được đảm bảo về chất lượng và
số lượng; được thu thập, vận chuyển và xử lý
đúng cách.
� Tùy theo thể loại bệnh lao mà các loại bệnh
phẩm được thu thập khác nhau
3
4. THỂ TÍCH DỊCH NÃO TỦY - TỈ LỆ CẤY DƯƠNG
THỂ TÍCH DỊCH NÃO TỦY (ml)
%
BỆNH
PHẨM
PHÂN
LẬP
ĐƯỢC
M.tb
Thwaites, G. E., T. T. Chau, and J. J. Farrar. 2004. Improving the bacteriological diagnosis of
tuberculous meningitis. J Clin Microbiol 42:378-9.
118 BN LMN/HIV âm
4
5. ⮚ Các bệnh phẩm phải được chuyển đến phòng xét nghiệm
ngay lập tức.
⮚ Nếu không có điều kiện chuyển mẫu ngay (đàm), có thể
giữ mẫu ở 40C trong vòng 3-4 ngày
5
7. SỰ PHÁT TRIỂN CÁC XÉT NGHIỆM LAO
THEO THƠ
̀ I GIAN
1880s Phát hiện trực khuẩn Lao
bằng pp nhuộm Ziehl-Neelsen
1900s Phản ứng Mantoux
(phản ứng nội bì với
tuberculin)
1920s Môi trường Petragnani
Dẫn xuất protein được tinh
khiết
1930s Lowenstein-Jensen medium
1940s Dubos agar, Ogawa
medium
1950s Middlebrook 7H9
1990s Khuyếch đại acid Nucleic
2000s ELISPOT, QuantiFERON
2010 GeneXpert , iLED
2016 TB LAMP; LF LAMP
2017 Xpert ultra
Kính hiển vi
Miễn dịch
Cấy
Sinh học phân tử
8. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN MỚI …
⮚ Cần:
⮚ Cho kết quả nhanh
⮚ Cho kết quả chính xác: độ nhạy, đặc hiệu cao
⮚ Test có thể được lưu trữ và thực hiện ở nhiệt độ phòng
⮚ Dễ thực hiện, đơn giản
⮚ Không cần trang thiết bị hiện đại, phức tạp
⮚ Rẽ tiền
⮚ Có thể áp dụng rộng rãi ở những nước có mật đô lao cao
10. PHƯƠNG PHÁP SOI TÌM AFB
⮚Được áp dụng để chẩn đoán và phát hiện lao ở các
nước có gánh nặng về lao với nguồn lực hạn chế
⮚Dễ thực hiện, chi phí thấp
⮚Cho kết quả chính xác và nhanh, trong vòng vài giờ.
⮚Không phân biệt vi khuẩn sống hay chết, vi khuẩn
nhạy hay kháng thuốc, MTB hay NTM
⮚Các phương pháp soi:
⮚Soi trực tiếp (áp dụng rộng rãi)
⮚Soi thuần nhất (áp dụng hạn chế)
10
11. PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP (1)
⮚ 10.000 vi khuẩn/ml đàm
⮚ Độ nhạy: 50 – 80%, Độ đặc hiệu: 98 – 99%
⮚ Thu thập 2 mẫu đàm trong 1 ngày, cách nhau 2
giờ
11
12. Rửa nhẹ dưới vòi nước –
Để khô tự nhiên
Methylen 0.3% - 1 phút
Acid cồn 3% - 03 phút
Rửa nhẹ dưới vòi nước
Rửa nhẹ dưới vòi nước
Fuchsin 0.3% - 05 phút
NHUỘM
ZIEHL
NEELSEN
12
13. PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP NHUỘM ZN (2)
⮚ Tỉ lệ phát hiện:
▪ Đàm 1: 80 – 83%
▪ Đàm 2: Thêm khoảng 10%
▪ Đàm 3: Thêm khoảng 5%
Cách đọc và ghi kết quả
0 AFB/100 qt Âm tính
1 – 9 AFB/100pt Ghi số cụ thể
10 – 99 AFB/100qt 1+
1 – 10 AFB/qt 2+
>10 AFB/qt 3+
13
2011
14. Rửa nhẹ dưới vòi nước –
Để khô tự nhiên
KMnO4 0.5% - 1 phút
Acid cồn 0.3% - 3 phút
Rửa nhẹ dưới vòi nước
Rửa nhẹ dưới vòi nước
Auramine 0.1% - 20 phút
NHUỘM
HUỲNH
QUANG
14
15. SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (3)
NC phân tích tổng hợp Độ nhạy
(%)
Độ đặc hiệu
(%)
Bệnh phẩm
không xử lý
KHV thường 32 - 94 94 - 100
KHV HQ 52 - 97 94 - 100
Bệnh phẩm
đã xử lý
KHV thường 52 - 94 94 - 100
KHV HQ 63 - 97 94 - 100
Lancet Infect Dis, 2006.6(9):p.570-81
15
16. ⮚ Sử dụng đèn LED cực sáng như 1 nguồn sáng phản chiếu, chuyển
ánh sáng thường thành ánh sáng huỳnh quang
⮚ Không thay bóng đèn
⮚ Không tạo nhiệt trong quá trình sử dụng
⮚ Giảm năng lượng tiêu thu
⮚ Có thể sử dụng pin
⮚ Giảm giá thành
⮚ 10.000 giờ
⮚ Có thể sử dụng nhiều loại thuốc nhuộm (Au/KMnO4; Au-
Rhod/KMnO4; Au/MethBlue)
KHV HUỲNH QUANG LED
SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (4)
16
17. 17
Chuẩn vàng Độ nhạy LED-FM Độ đặc hiệu LED-FM
Cấy 93% (85% - 97%) 99% (98% - 99%)
Soi trực tiếp (ZN) Tăng 6% (0.1% - 13%) Không thay đổi
Soi huỳnh quang cổ
điển
Tăng 5% (0 – 11%) Tăng 1% (-0.7% - 3%)
Giảm thời gian đọc tiêu bản còn 50% so với ZN
KHV HQ LED đã được TCYTTG khuyến
cáo sử dụng vào năm 2009 để phát hiện
lao ở các nước có dịch tể lao cao
18. PHƯƠNG PHÁP CẤY
⮚ >100 - 1000 vi khuẩn/ml đàm
⮚ Vi khuẩn lao tăng sinh tốt trên môi trường trứng chứa
glycerol và asparagine hoặc môi trường lỏng chứa serum
hoặc albumin bò
⮚ Tăng tỉ lệ phát hiện khoảng 30 – 50% so với phương
pháp soi
⮚ Cho kết quả chậm vì thời gian nhân đôi dài (18-24 giờ):
▪ Phương pháp cấy đặc: 3 tuần – 1 tháng
▪ Phương pháp cấy lỏng: 2 – 3 tuần
⮚ Các chủng cấy dương có thể dùng để thực hiện :
▪ Các xét nghiệm định danh
▪ Kháng sinh đồ
▪ Xét nghiệm sinh học phân tử…
18
19. PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC
(1)
⮚ Được TCYTTG công nhận là chuẩn vàng trong chẩn đoán lao
⮚ Các loại môi trường:
▪ Löwenstein-Jensen (LJ): môi trường trứng chứa Glycerol và
Asparagine
▪ Môi trường OGAWA : môi trường trứng chứa Glycerol và
sodium glutamate
▪ Middlebrook 7H10 agar
⮚ Qui trình cấy:
▪ Bệnh phẩm được xử lý với NALC-NaOH hoặc NaOH 2-4%
(ngoại trừ dịch cơ thể vô trùng như dịch não tủy…)
▪ Cặn lắng của bệnh phẩm đã xử lý được cấy trên môi trường
LJ, ủ ở 35-370C cho đến khi thấy khóm trùng mọc
19
20. PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC
(2)
⮚ Đọc và phân tích kết quả:
▪ Đọc kết quả hàng tuần
▪ Thường có kết quả cấy dương sau 3-4 tuần :
▪ Khóm trùng có màu kem, sần sùi như bông cải súp lơ
▪ Khi hòa tan khóm trùng trong nước muối sinh lý sẽ thấy sự
hiện diện của các hạt rất nhỏ
▪ Quan sát dưới KHV: hình ảnh dây thừng với chiều dài khác
nhau
▪ Nếu có kết quả cấy dương trong vòng 1 tuần:
▪ Nhóm vi khuẩn mọc nhanh (Mycobacterium Other Than
Tuberculosis – MOTT hay Nontuberculosis mycobacteria-
NTM)
▪ Trả kết quả âm tính sau 8 tuần
⮚ Tỉ lệ ngoại nhiễm chấp nhận: 2-3%
20
21. Mẫu cấy LJ dương
Khóm trùng vi khuẩn lao
trên mẫu cấy dương
Đọc kết quả Giải thích
Không mọc Âm tính
1-19 khóm trùng Dương tính: số cụ
thể
20-100 khóm trùng Dương tính: 1+
100-200 khóm trùng Dương tính: 2+
200-500 khóm trùng Dương tính: 3+
>500 khóm trùng Dương tính: 4+
Ngoại nhiễm Ngoại nhiễm
21
22. PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC
(4)
⮚ Ưu điểm
▪ Môi trường dễ pha chế
▪ Rẻ tiền
▪ Vi khuẩn lao mọc tốt trên môi trường này
▪ Sau khi pha chế, có thể sử dụng trong vài tuần (giữ
4-80C)
▪ Môi trường có chứa malachite green dùng để ức
chế sự phát triển của các tạp khuẩn.
⮚ Khuyết điểm
▪ Thời gian cho kết quả lâu (4-8 tuần)
22
23. PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (1)
⮚ Hệ thống BACTECTM MGITTM 960 (Becton Dickinson, Sparks,
MD)
⮚ Ưu điểm:
⚫ Vi khuẩn lao mọc và phát triển trên môi trường lỏng nhanh
hơn môi trường đặc
⚫ Độ nhạy cao hơn phương pháp cấy đặc khoảng 10%
⚫ Đọc kết quả bằng máy
⚫ Thời gian cho kết quả nhanh (10-14 ngày)
⮚ Khuyết điểm
⚫ Đắt tiền
⚫ Tỉ lệ ngoại nhiễm cao hơn (5-10%)
Năm 2007, TCYTTG khuyến cáo sử dụng phương pháp cấy lỏng
để tăng tỉ lệ phát hiện
23
24. PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (2)
⮚ MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube
⮚ Tube MGIT chứa Middlebrook 7H9, OADC và PANTA
⮚ Đáy tube được phủ 1 lớp silicon chứa muối ruthenium
(ruthenium salt) đóng vai trò như 1 chất phát huỳnh quang.
⮚ Bình thường, oxy hiện diện trong môi trường cấy sẽ che lấp
sự phát quang của muối ruthenium.
⮚ Khi vi khuẩn sử dụng oxy để chuyển hóa và tăng sinh trong
môi trường nuôi cấy, lượng oxy trong môi trường sẽ giảm, sự
phát quang ở đáy tube sẽ được nhìn thấy khi xem dưới đèn
UV
⮚ Cần xác định sự hiện diện của AFB trong mẫu cấy 24
25. ĐỊNH DANH VI KHUẨN LAO (1)
Định danh vi khuẩn lao chủ yếu dựa vào các tính chất sau:
⚫Vi khuẩn sinh trưởng chậm
⚫Nhiệt độ sinh trưởng 35 – 370C
⚫Không sinh sắc tố
⚫Phản ứng Niacin dương tính
⚫Phản ứng Nitrate dương tính
⚫Phản ứng catalase dương tính ở 680C, pH 7.0
⚫Không mọc trên môi trường LJ có chứa 500mg/L p-
nitrobenzoic acid
⚫Mọc trên môi trường có chứa thiophen-2-carboxylic
acid hydrazide (2µg/ml TCH) 25
26. TEST ĐỊNH DANH MTB COMPLEX
26
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Dec. 2011, p. 4343–4346
Phát hiện protein MPT 64 (kháng nguyên) do M.tb complex tiết ra trong
môi trường cấy lỏng
28. PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1)
⮚ Phương pháp kháng sinh đồ cổ điển: phương pháp tỉ lệ kháng
(proportional DST method)
▪ Là phương pháp kháng sinh đồ gián tiếp
▪ Được công nhận là chuẩn vàng trong chẩn đoán lao kháng
thuốc
▪ Tính chất kháng thuốc được xác định dựa trên tỉ lệ % của
số khóm trùng đếm được ở ống môi trường có thuốc trên
ống môi trường không thuốc.
▪ Được khuyến cáo thực hiện ở những bệnh nhân lao/nghi lao
kháng thuốc: BN bỏ trị, thất bại điều trị, tái trị, HIV…
▪ Rẻ tiền
▪ Thời gian có kết quả từ 28 – 42 ngày kể từ khi có kết quả
cấy dương tính
28
29. Thuốc kháng lao hàng 1 Thuốc kháng lao hàng 2
INH Ofloxacin
Streptomycin Amikacin
Rifampicin Ethionamide
Ethambutol Kanamycin
PAS
Capreomycin
29
PZA: Phương pháp Wayne: positive: nhạy (có pyrazinamidase)
pyrazinamidase/MTB (pncA gene)
PZA (prodrug) Pyrazinoic acid (POA)
dạng hoạt động của PZA, diệt MTB
Jonmalung et al. BMC Microbiology 2010, 10:223
PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1)
30. PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (3)
⮚ Giải thích kết quả: vd: với tỉ lệ kháng 1%
▪ Nếu tỉ lệ này <1%: chủng nhạy
▪ Nếu tỉ lệ này≥1%: chủng kháng
30
31. BACTECTM MGITTM 960 SIRE/PZA
� Kháng sinh đồ gián tiếp
� Cơ chế hoạt động của máy tương tự MGIT 960
� Một bệnh phẩm: Ống control
Ống INH 0.1μg/ml
Ống RIF 1μg/ml
Ống STR 1μg/ml
Ống EMB 1μg/ml
� Máy tự so sánh độ phát quang đo được ở ống thuốc so
với ống không thuốc để xác định sự nhạy/kháng thuốc
� Máy tự động phân tích và báo kết quả 31
32. LINE PROBE SSAY – LPA
GENOTYPE MTBDR-PLUS (1)
� Xét nghiệm sinh học phân tử
� Phát hiện M.tb complex trực tiếp từ mẫu đàm hoặc từ
mẫu cấy dương
� Phát hiện chủng kháng INH (đột biến gen katG và
inhA)
� Phát hiện chủng kháng RIF (đột biến trên gen ropB)
trực tiếp từ mẫu đàm
� Thời gian cho kết quả trong vòng 24 giờ
32
33. Genotype®MTBDRplus – Version 1 (2)
Mẫu đàm soi dương:
Nhạy – RIF : 98.9%
Đặc hiệu – 99.4%
Nhạy– INH: 94.2%
Đặc hiệu – INH: 99.7%
Mẫu đàm soi âm
Không giải thích được
kết quả:
RIF: 20% (n=4/20)
INH: 26% (n=5/19)
Barnard, Am J Respir Crit Care Med,
33
34. GENOTYPE®MTBDRPLUS (3)
Năm 2008, TCYTTG khuyến cáo:
⮚ Áp dụng test SHPT này trong chẩn đoán sớm lao đa
kháng
⮚ Chỉ áp dụng cho mẫu đàm soi dương hoặc mẫu cấy
dương
⮚ Không thể thay thế hoàn toàn các phương pháp cấy
và kháng sinh đồ cổ điển
34
35. XPERT MTB/RIF (1)
� Hệ thống khép kính
� Xét nghiệm trực tiếp từ mẫu đàm
� Phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng RIF
� Có kết quả trong 90 phút
� Tăng tỉ lệ phát hiện khoảng 30% so với phương pháp soi
� Sử dụng tại tuyến cơ sở
35
36. XPERT MTB/RIF (2)
Độ nhạy Đặc hiệu
Cấy (+) Soi (+) /cấy (+) Soi (-)/cấy(+) Không lao
3 mẫu đàm
n=x/y
(%)
723/741
(97.6)
566/567
(99.8)
157/174
(90.2)
604/616
(98.1)
2 mẫu đàm
n=x/y
(%)
1423/1482
(96.0)
1127/1134
(99.4)
296/348
(85.1)
1215/1232
(98.6)
1 mẫu đàm
n=x/y
(%)
675/732
(92.2)
551/561
(98.2)
124/171
(72.5)
604/609
(99.2
Catharina C Boehme et al. NEJM, 2010
36
37. CHỈ ĐỊNH XÉT NGHIỆM XPERT
� 2017: Nghi lao HIV, lao trẻ em, lao màng não, 1
số trường hợp lao AFB(-)
� 2018: 2017, bổ sung
⚫ AFB(-) trước khi điều trị
⚫ Nghi lao đa kháng và AFB(+) mới
� 2019: 2018, bổ sung
⚫ XQ bất thường
� 2020: Nghi lao
Quyết định 1314/2020/QĐ-BYT 37
39. TRIỂN KHAI ÁP DỤNG KỸ THUẬT …
⮚ KHV huỳnh quang LED: Thay thế KHV đèn
sáng và KHV huỳnh quang cổ điển
⮚ Kỹ thuật SHPT (LPA): Chuẩn vàng, không thể
loại bỏ pp cấy và kháng sinh đồ cổ điển
⮚ Xpert MTB/RIF: Thay thế cho phương pháp soi.
Xpert MTB/RIF không thể loại bỏ hoàn toàn sự cần thiết
của các pp soi, cấy và LPA trong tương lai gần 39
41. � Xét nghiệm dựa trên sự phát hiện kháng nguyên mycobacterial
lipoarabinomannan (LAM) antigen trong nước tiểu
� Xét nghiệm thực hiện trên mẫu nước tiểu nên có ưu điểm hơn
so với xét nghiệm thực hiện trên mẫu đàm vì mẫu nước tiểu dễ
thu thập và lưu trữ, và không có các nguy cơ kiểm soát nhiễm
khuẩn liên quan đến thu thập mẫu đàm.
� Kháng nguyên LAM là một lipopolysaccharide hiện diện
trong thành phần màng tế bào của mycobacterial, được giải
phóng trong quá trình chuyển hóa hoặc phân hủy tế bào vi
khuẩn.
� LAM được tìm thấy nổi bật ở những người đang mắc lao; và
có phản ứng chéo thấp với nhiễm mycobacteria không lao.
42. � Sự hiện diện của LAM trong nước tiểu có liên quan gián
tiếp đến đáp ứng miễn dịch của người; và quá trình phát
hiện nó có đóng góp vào việc phá triển các test POC có
chi phí không đắt.
� Có độ nhạy chưa đạt yêu cầu, test LAM nước tiểu hiện
tại không thích hợp để sàng lọc lao. Tuy nhiên, không
giống các phương pháp chẩn đoán lao khác, nó có độ
nhạy được cải thiện ở nhóm HIV/Lao và cải thiện hơn
nữa nếu CD4 thấp.
42
43. KHUYẾN CÁO
1. Ngoại trừ những trường hợp đặc biệt được nêu dưới đây đối
với người nhiễm HIV có CD4 thấp hoặc những người bệnh
rất nặng, LF-LAM không được dùng để chẩn đoán lao
(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp).
1. LF-LAM có thể được dùng để hỗ trợ chẩn đoán lao ở bệnh
nhân người lớn ngoại trú nhiễm HIV có các triệu chứng của
lao (lao phổi/lao ngoài phổi) và có CD4 ≤ 100 cells/μL, hoặc
người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể CD4 là bao
nhiêu/không biết số lượng CD4 (khuyến cáo có điều kiện,
bằng chứng có chất lượng thấp).
44. Lưu ý:
▪ Khuyến cáo này cũng áp dụng đối với BN HIV ngoại
trú có triệu chứng mắc lao (LP/LNP) có CD4 ≤100
cells/μL, hoặc người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể
CD4 là bao nhiêu/không biết tình trạng CD4, dựa trên
khái quát kết quả của BN nội trú.
▪ Khuyến cáo này cũng áp dụng đối với BN HIV trẻ em
có triệu chứng mắc lao (LP/LNP) , dựa trên khái quát kết
quả của BN người lớn.
3. LF-LAM không được dùng làm test sàng lọc lao
(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp )
44
49. KHUYẾN CÁO
1. TB-LAMP có thể được sử dụng như 01 xét nghiệm thay
thế cho XN soi đàm để chẩn đoán lao phổi ở người lớn
có triệu chứng nghi lao (Khuyến cáo có điều kiện, bằng
chứng có chất lượng thấp).
2. TB-LAMP có thể được sử dụng như 01 XN hỗ trợ thêm
XN soi đàm đối với những BN người lớn có triệu chứng
nghi lao phổi, đặc biệt khi cần làm thêm XN ở BN soi
đàm âm tính (Khuyến cáo có điều kiện, bằng chứng có
chất lượng thấp).
50. LƯU Ý
• Các khuyến cáo này được áp dụng ở những nơi có thực hiện
XN soi đàm trực tiếp.
• TB-LAMP không được sử dụng để thay thế các XN sinh học
phân tử nhanh để phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng
RIF, đặc biệt là ở nhóm BN có nguy cơ mắc lao đa kháng
thuốc.
• Chưa có bằng chứng để kết luận liệu TB-LAMP có giá trị chẩn
đoán hỗ trợ đối với XN soi đàm ở BN đồng nhiễm HIV có
triệu chứng và dấu hiệu mắc lao.
• Các khuyến cáo này chỉ áp dụng đối với XN TB-LAMP trên
mẫu đàm ở BN có triệu chứng và dấu hiệu mắc lao.
• Các khuyến cáo này cũng được áp dụng ở trẻ em, dựa trên
bằng chứng ở người lớn, vì viết rằng rất khó thu thập mẫu đam
ở trẻ em.
