NGS現場の会第2回_アメリエフ株式会社_RNAseq解析

RNA-Seq解析パイプラインの検討

2012年5月24日
アメリエフ株式会社

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アノテーションデータ

• Illumina iGenomes（http://tophat.cbcb.umd.edu/igenomes.html）
– iGenomesはモデル生物のリファレンスゲノム配列や既知遺伝子情報などを
まとめたデータセットです。
– gene_idやtss_idが正確に記述されているので、以下の解析ではこのデータを
使うことをお奨めします。
http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.htmlからダウンロードできる既知遺伝子情報（例）
～（略）～ gene_id "NR_024540"; transcript_id "NR_024540";

cufflinksではgene_idを遺伝子名, transcript_idをmRNA名, tss_idを転写開始
iGenomesの既知遺伝子情報（例）位置情報として集計するので、これらの値がちゃんと入っていたほうがよい

～（略）～ gene_id "WASH7P"; gene_name "WASH7P"; transcript_id "NR_024540"; tss_id "TSS7245";
生物アイコン © ライフサイエンス統合データベースセンター licensed under CC表示2.1 日本

• 2012年5月時点の対応生物種は、ヒト、マウス、ラット、牛、犬、
鶏、ショウジョウバエ、シロイヌナズナ、線虫、出芽酵母
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2

生の
リードデータ

リードQC
ワークフロー
きれいな
リードデータ
マッピングチェック・カバレージチェックマッピング・
マッピングチェッ
転写構造予測
ク結果ジャンクション情
マッピング結果
報
平均カバレージ
チェック結果

発現レベル予測
SNP/InDel検出
SNP/InDel 発現レベル
転写物情報
検出結果情報

コンセンサス
転写構造・発現レベル比較転写物予測
コンセンサス
比較結果
転写物融合遺伝子
予測
視覚化既知転写物と比較
新規転写物融合遺伝
グラフ画像
候補子候補

3

リード Q C

• 内容
– Prinseq（http://prinseq.sourceforge.net/）を用いてPolyA/T tailを除去します。
– 弊社独自ツールを用いてリードデータのクオリティをチェックし、クオリティの
低い配列を除去します。
• 入力
– 生のリードデータ（fastq）
• 出力
– クオリティの低い配列を除去したリードデータ（fastq）
– 除去されたリードデータ
• 詳細はポスター番号 T-38 をご覧ください。

4

融合遺伝子予測

• 内容
– deFuse（http://sourceforge.net/apps/mediawiki/defuse/index.php）を用いて、
融合遺伝子を検出します。
• 入力
– リードデータ（fastq）
• 出力
– 融合遺伝子検出結果（タブ区切りテキスト）
• 実行例
– $ perl defuse.pl -c config.txt -d data_dir -o output_dir -p 8
– 【ご参考】弊社ブログ記事：http://blog.amelieff.jp/?eid=175531

5

マッピング～転写構造予測

• 内容
– リードをリファレンスゲノムにマッピングします。
– TopHat（http://tophat.cbcb.umd.edu/index.html）では、スプライシングを考慮
したマッピングおよびジャンクション構造予測が可能です。
• 入力
– リードデータ（fastq）
• 出力
– マッピング結果（bam）、ジャンクション情報（bed）、挿入情報（bed）、欠失情報
（bed）
• 実行例
– $ tophat –r 250 -o output_dir -G refgene.gtf -g 1 hg19 fastq1 fastq2

6

発現レベル予測

• 内容
– Cufflinks（http://cufflinks.cbcb.umd.edu/）を用いて、遺伝子やmRNAごとの発
現レベル（FPKM）を予測します。
• FPKM=Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments。発
現量をエキソン長と全マッピング数で補正したもの。遺伝子の長さや、ラ
ンあたりのシーケンシング量によるバイアスを補正する。
• 入力
– マッピング結果（bam）
• 出力
– 転写物情報（gtf）、発現レベル情報（fpkm_tracking）
• 実行例
– $ cufflinks -o output_dir -M mask.gtf -g refgene.gtf accepted_hits.sorted.bam

7

コンセンサス転写物予測

• 内容
– Cufflinks（http://cufflinks.cbcb.umd.edu/）を用いて、複数サンプル由来の転
写物情報をマージしてコンセンサスな転写物を予測します。
• 入力
– 転写物情報ファイル（gtf）を羅列したテキストファイル
• 出力
– コンセンサス転写物（gtf）
• 実行例
– $ cuffmerge -s hg19.fa gtf_list.txt

8

既知転写物と比較

• 内容
– Cufflinks（http://cufflinks.cbcb.umd.edu/）を用いて、コンセンサスな転写物と
既知転写物を比較し、新規転写物候補を検出します。
• 入力
– コンセンサス転写物（gtf）
• 出力
– 新規転写物候補（gtf）
• 実行例
– $ cuffcompare -s hg19.fa -r refGene.gtf merged.gtf

9

転写構造・発現レベル比較

• 内容
– Cufflinks（http://cufflinks.cbcb.umd.edu/）を用いて、サンプル間の転写構造
や発現レベルを比較します。
• 入力
– 複数サンプルのマッピング結果
• 出力
– 各転写物の正規化された発現レベル情報（fpkm_tracking）、サンプル間の転
写構造・発現レベル比較結果（diff）
• 実行例
– $ cuffdiff transcripts.gtf sample1_hits.bam sample2_hits.bam

10

結果の視覚化

• 内容
– Rのパッケージ：cummeRbund（http://compbio.mit.edu/cummeRbund/）を用
いて、発現比較結果を視覚化します。
• 入力
– cuffdiffの出力結果
• 出力
– グラフ

11

解析パイプライン

• Galaxy（https://main.g2.bx.psu.edu/）により、これらの処理をWebブラウザからGUI
で実行できます。

結果

実行記録

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