Extracción de células madre derivadas del tejido adiposo

1. Dr. Jesús Benito Ruiz Células madrederivadas del tejido adiposo

2. el tejido adiposo humano contiene una población de células capaz de proliferar y diferenciarse en múltiples líneas celulares, características de las células troncales o células madre (Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH (2002) Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 13:4279–4295)

3. Estas células, denominadas Celulas Troncales derivadas del tejido adiposo (Adipose-Derived Stem Cells) son capaces de elaborar factores de crecimiento (Yi, CG et al., VEGF gene therapy fort he survival of transplanted fat tissue in nude mice. J. Plast. Reconstr.Aesth.Surg., 2007, 60:272-278) (Patrick CW et al., Long term implantation of preadypocite-seeded PLGA scaffolds. Tissue Eng., 2002, 109:1292-1298).

4. El tejido adiposo también contiene células endoteliales progenitoras que participan en la formación de vasos sanguíneos Miranville A, Heeschen C, Sengenes C, Curat CA, Busse R, Bouloumie A (2004) Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation 110:349–355 Planat-Benard V, et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological en therapeutic perspectives. Circulation 2004, 109: 656-663.

5. El conjunto de estas células se conoce como Células regenerativas derivadas del tejido adiposo o fracción vascular estromal, caracterizadas por su capacidad para generar nuevo tejido adiposo y vasos sanguíneos asi como producir factores de crecimiento que ayuden a sobrevivir a los adipocitos y a la formación de la red vascular Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL (2004) Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation 109:1292–1298

6. 1 gramo de tejido adiposo aspirado tiene 6.9 x 105 adipocitos y 2.1 x 106 de celulas no-adipocitos. Considerando factores como la distinta concentración en las distintas fases del centrifugado y el tamaño de adipocitos (entre 90 y 100 µ, calculan que hay 1.000.000 de adipocitos en 1 ml. El 37% de las células no adipocitos están en la fracción estromal vascular y que ocupan la parte baja del centrifugado son células madre derivadas del adipocito Suga H, Matsumoto D, Inoue K, Shigeura T, Eto H, Aoi N, Kato H, Abe H, Yoshimura K. Numerical measurement of viable and nonviable adipocytes and other cellular components in aspirated fat tissue. Plast Reconstr Surg. 2008 Jul;122(1):103-14.

8. Se han aislado células tanto en la fraccion de tejido adiposo como en el líquido de la centrifugación. Estas células se caracterizan por tener marcadores CD34+ y CD45- El marcador tipico de la ASC es CD31- CD34+ CD45- CD90+ CD105- CD146- CD34+ significa que son progenitores de pericitos En cultivo las ASC expresan CD31+ que es típico de las células endoteliales. También expresan CD105+ que es el marcador relacionado con con las células mesenquimales Yoshimura K, Shigeura T, Matsumoto D, Sato T, Takaki Y, Aiba-Kojima E, Sato K, Inoue K, Nagase T, Koshima I, Gonda K. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 2006 Jul;208(1):64-76

9. Esto explica que las ASC son capaces de diferenciarse a células adiposas, condrales, óseas, musculares, neurales, endoteliales y hepáticas (con el estímulo adecuado)

10. El tejido adiposo aspirado tiene también factores de crecimiento y se han aislado bFGF, IGF-1, PDGF-BB y VEGF. Pallua y cols han estudiado el centrifugado a temperatura ambiente y a los 3 y 5 dias y estos factores permanecen. Pallua N, Pulsfort AK, Suschek C, Wolter TP. Content of the growth factors bFGF, IGF-1, VEGF, and PDGF-BB in freshly harvested lipoaspirate after centrifugation and incubation. Plast Reconstr Surg. 2009 Mar;123(3):826-33.

11. Estudio en muestra nativa sin Centrifugar y en centrifugada

15. bFGF (basic fibroblastic growth factor) induce neovascularización y s eha visto que añadido a una muestra de tejido adiposo aumenta la supervivencia VEGF: aumenta la viabilidad del tejido transplantado y la angiogénesis y su expresión aumenta en hipoxia PDGF-BB: platelet derived groth factor. Inducido en el proceso inflamatorio, estimula la proliferación de preadipocitos, aumenta la supervivencia del transplante y es quimiotáctico.

16. Parece pues que tanto los factores presentes como la hipoxia del transplante favorecen la conversión de las ASC en celulas endoteliales, aumentando la vascularización y favoreciendo la angiogénesis. No sólo contribuyen a la supervivencia del implante sino que también a la vascularización de la dermis donde se implantan (validado en la experiencia clínica)

17. Influencia de diversos factores en la supervivencia de adipocitos y ASC durante el proceso de obtención y transferencia

18. La temperatura Matsumoto D, Shigeura T, Sato K, Inoue K, Suga H, Kato H, Aoi N, Murase S, Gonda K, Yoshimura K. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 2007 Nov;120(6):1510-7

19. Estudian la degeneración de la grasa y persistencia de adipocitos y ASC en muestras centrifugadas a 2330g por cinco minutos a 1-2-4-24 horas a temperatura ambiente, 4ºC a 1-2-3 dias y a -80ºC por 1 mes. Estudian el “oil ratio” y la presencia de glicerol-3-fosfato dehidrogenasa (una enzima intracelular) asi como porcentaje de ASCs

20. 2330 g = 3600 rpm Los adipocitos aguantan bien la Centrifugacion incluso a 4300 g

24. Hasta las 4 horas de preservacion a Temperatura ambiente hay aumento progresivo de oil ratio y GPDH, muy significativa a 24 h Las ASC parecen mantenerse hasta 4 h. Pero a las 24 horas casi han desaparecido si se preserva a -4ºC el número de ASC se mantiene 24 h. Pero Luego se reducen.

25. Recomiendan hacer la transferencia en menos de 4 horas Si se ha de enviar tejido adiposo para procesar y obtener ASC puede enfriarse a 4ºC, teniendo 24 horas.

26. La centrifugación Kurita M, Matsumoto D, Shigeura T, Sato K, Gonda K, Harii K, Yoshimura K. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 2008 Mar;121(3):1033-41

27. Estudio de viabilidad de adipocitos y ASC a 400 – 800 – 1200 – 3000 y 4200 g. Injerto en ratones y medida del peso del injerto al mes ( Coleman es a 1286 g)

29. Hay cierta reduccion de tejido Adiposo y aumento de fracción oleica al Aumentar la centrifugación pero no es Significativa El número de ASC es consistente hasta 1200g pero luego cae a partir de 4000g La supervivencia de los injertos al mes En ratones es ligeramente superior en Los centrifugados a 3000 g No hay incremento de paso de células rojas Y de ASC al liquido a mayor fuerza de centrifugacion

30. El tejido adiposo nativo es más rico en ASC que el aspirado, pero la centrifugación hace que el tejido se compacte y aumenta de forma relativa la concentración de ASC. Calculan que de 140 ml aspirados, se obtienen 100 ml una vez centrifugados y de éstos se consiguen unos 80 ml de aumento

31. Recomiendan 1200 g que viene a ser lo que expuso Coleman (1286 g) g = (1.119 x 10^-5) * rpm^2 * r r es el radio del rotor

32. Lavado vs centrifugado Condé-Green A, Gontijo de Amorim NF, Pitanguy I. Influence of decantation, washing and centrifugation on adipocyte and mesenchymal stem cell content of aspirated adipose tissue: a comparative study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2009

33. Estudian la diferencia en número de adipocitos y células no adipocitos El lavado y el centrifugado eliminan la mayor parte de células de serie roja, pero el lavado parece conservar más adipocitos y ASC que el centrifugado.

35. CD 45+ son celulas rojas, CD 45- son celulas endoteliales (CD 34+), Células mesenquimales (CD 105+) y ASC (CD 31+)

36. El vacío No hay datos concluyentes que aseguren que la obtención a jeringa sea mejor que con lipoaspirador. Se recomienda usar lipoaspirador a 0.5 atm La jeringa obtiene una presión de 660 mmHG (0.86 at)

37. Kahveci R et al., A useful technique to obtain adequate negative pressure for liposuction, J Plast Reconstr Aesthet Surg (2009),