Capitulo 6-crecimeitno microbian

CAPITULO 6

CRECIMIENTO MICROBIANO

INTRODUCCION
 Es el aumento del número de microorganismos a lo largo
del tiempo.
 No se refiere al crecimiento de un único microorganismo
(ciclo celular), sino al demográfico de una población.
 Se toma como base el crecimiento de bacterias, el
estudio puede servir también para entender el crecimiento
de levaduras y hongos.

 El crecimiento de una población resulta de la suma de los
ciclos celulares de todos los individuos de dicha población.

Ciclo celular : proceso de desarrollo de una bacteria
aislada.

División celular: fisión binaria

Gemación,
ej.
levaduras

REQUERIMIENTOS PARA EL

REQUERIMIENTOS FISICOS

 Temperatura
 pH
 Actividad de Agua
 Presión Osmótica

Temperatura
• Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento
adecuada.
• temperatura mínima por debajo de la que no hay crecimiento; a
temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la
velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que
se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es
máxima. Por encima de esta temperatura óptima, la velocidad de
crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.
• El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura
se debe al incremento generalizado de la velocidad de las
reacciones enzimáticas con la temperatura.
• La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la
reducción de la velocidad de crecimiento por la reducción de la
velocidad de reacción y al cambio de estado de los lípidos de la
membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos
impidiendo el funcionamiento de la membrana celular.

Efecto de la temperatura sobre la velocidad del crecimiento y las consecuencias
moleculares para la célula

• La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de las
proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas
temperaturas.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo
celular se enlentece y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué
morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la óptima, se
produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su
capacidad de división si baja posteriormente la temperatura.
Esto permite esterilizar por calor y no por frío.
Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de
crecimiento mínima, máxima y óptima.

• Sicrófilos - rango: < -5 ª 20°C, óptimo < 15oC
– organismos marinos, algas: Chlamydomonas nivalis (nieve
rosada), bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium
– membrana contiene alto % de ácidos grasos insaturados
• Sicrótrofos o Sicrófilos facultativos
- rango: 0-35°C, óptimo 20-30oC
– Pseudomonas - crecen en el refrigerador
• Mesófilos - rango: 15-45° C, óptimo: 30-40°C
– la mayoría de los microorganismos (del suelo, aguas, patógenos)
• Termófilos - rango: 40-70°C, óptimo de 55-65oC
– membrana contiene alto % de ácidos grasos saturados
– enzimas estables al calor
– Bacillus stearothermophilus, organismos de compostaje
• Hipertermófilos - rango: 80-113°C, óptimo > 90oC
– Pyrococcus, Pyrodictium (aguas termales)

• PHEsun parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos;
cada tipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho
de pH fuera del cual mueren rápidamente.
• El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células
ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la
existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados
de la membrana citoplásmica. El pH interno en la mayoría de los
microorganismo está en el rango de 6.0 a 7.0.
• Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos
son, también,distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden
vivir a pH=1.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10.0
• Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH
del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo.

• La bajada del pH del medio que producen ciertos
microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a
otros microorganismos competidores. Así, por ejemplo, las
bacterias lácticas que producen grandes cantidades de ácido
láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen
el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables
por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio
hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y
las lácticas se convierten en la población dominante.

• La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los
cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta
(fórmico, acético, láctico) por ciertas bacterias.

• La acción bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta
es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que
producen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son
tóxicos para algunas bacterias por sí mismos.

Clasificación de los microorganismos según su pH óptimo

Neutrófilo: pH óptimo 7 - Ej.:
bacterias patógenas
humanas.
Acidófilo: pH óptimo 7 - Ej.:
muchas de las archeobacterias
y hongos.
Basófilo: pH óptimo 7 - Suelos y
aguas ricas en carbonatos

Presión Osmótica
Los microorganismos requieren agua para su
crecimiento, además para obtener nutrientes de ésta.
Una presión osmótica alta causa pérdida de agua y plasmólisis
de la célula, por lo que se utiliza este fenómeno para
conservar los alimentos ya sea añadiendo sal o azúcar, lo que
previene el crecimiento bacterial.
Sin embargo algunas bacterias se han adaptado a altas
concentraciones de sal, a éstas se les conoce como halófilos
extremos.
Por otro lado, los halófilos facultativos no requieren una alta
concentración de sal, pero pueden crecer hasta una
concentración de 2%.
Otras bacterias pueden tolerar hasta un 15% de sal.

Actividad de agua:
• Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión
de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de
vapor del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está
relacionado con el de la humedad relativa (HR).

• El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad
de agua disponible metabólicamente.

• Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con
una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se
detiene.
•
• Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la
muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en
condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos
largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede
ser considerada prácticamente ilimitada

• La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua
muy altos para poder crecer.
• Los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a
título orientativo, los siguientes:
bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85,
hongos filamentosos aw >0.80.
• Los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de
agua mucho menor de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras.
Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua
(por ejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por
bacterias.
• En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que
pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y
xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas,
respectivamente.
• Xerófilos: microorganismos que crecen en condiciones de sequedad o con una Aw
inferior a 0.85.

• La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene
importancia aplicada en industria alimentaria. La utilización de almíbares,
salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su
deterioro bacteriano.

Efecto de la concentración de Sodio en el crecimiento de microorganismos con
diferentes halotolerancias. La concentración óptima de sal para los
microorganismos marinos tal como V. fischeri es del 3%; para los halófilos
extremos es de 15-30%, dependiendo del organismo.

REQUERIMIENTOS QUIMICOS
Carbono
Nitrógeno
Azufre
Fosforo
Oligoelementos
Oxígeno

Carbóno (C) todos los organismos requieren C para sintetizar los componentes celulares.

Nitrógeno, azufre.y fósforo. Estos elementos se requieren para la síntesis de DNA, RNA,
proteínas y ATP. Las bacterias pueden obtener nitrógeno (N) ya sea fijándolo directamente de la
atmósfera, como por ejemplo el género bacteriano Rhizobium. También pueden obtener este elemento
de compuestos inorgánicos que contengan N como nitritos, nitratos, sales de amonio o amino ácidos.
Las bacterias pueden obtener azufre de iones de sulfato, sulfito de hidrógeno y amino ácidos con azufre.
El fósforo es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos y membranas celulares. Una fuente para
obtener fósforo son los iones de fosfato y el ATP.

Elementos trazas. Otros elementos como hierro, cobre, molibdeno y zinc son requeridos por los
microorganismos en pequeñas cantidades. Usualmente tienen función de cofactores.

Oxígeno No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas formas de vida requieren
oxígeno para llevar a cabo respiración aeróbica. Los microorganismos que utilizan oxígeno molecular son
llamados aeróbicos. Estos se clasifican en aeróbicos obligados que son los que requieren oxígenos
molecular para vivir, y los aeróbicos facultativos los cuales utilizan el oxígeno molecular cuando está
presente, pero en su ausencia continúan su crecimiento por la vía de fermentación o respiración
anaeróbica, un ejemplo es Escherichia coli. Por otro lado tenemos los anaeróbico obligados que
necesitan ausencia de oxígeno molecular para crecer y donde este generalmente es tóxico, un ejemplo
es el género Clostridium. Estos microorganismos obtienen el átomo de oxígeno molecular del agua.
También se observan microorganismos anaeróbicos aerotolerantes los cuales no utilizan el oxígenos
molecular para su crecimiento, pero pueden tolerarlo. Los microaerofílicos sólo pueden crecer en
concentraciones de oxígeno molecular menor a las encontradas en el aire.

Macronutrientes

Fuente de - CO2
carbono - Compuestos Carbohidratos, azúcares,
orgánicos proteínas, aminoácidos,
lípidos, ácidos grasos,
glicerol
Fuente de - Inorgánica NH4, NO3-, N2
nitrógeno - Orgánica Proteínas, peptonas, aa,
bases púricas y
pirimídicas, urea
Fuente de - Inorgánica Fosfatos
fósforo - Orgánica Esteres del ácido
fosfórico
Fuente de - Inorgánica Sulfuros y sulfatos
azufre - Orgánica Aminoácidos sulfurados,
vitaminas

Tipos nutricionales Fuente de Fuente de Ejemplos
energía C
Cianobacterias,
Fotoautótrofos Luz CO2 bacterias
púrpuras y
verdes
Compuestos Algunas
Fotoheterótrofos Luz orgánicos bacterias
púrpuras y
verdes
Compuestos Algunas
Quimioautótrofos o inorgánicos CO2 Eubacterias y
litótrofos ej.: H 2, NH 3, muchas Archaea
NO2-, H2S
La mayoría
Quimioheterótrofos Compuestos Compuestos Eubacterias,
o heterótrofos orgánicos orgánicos algunas Archaea

Metabolismo en procariotas

Fuente
Energía Luz Compuestos Compuestos
Inorgánicos Orgánicos
Carbono

CO2
Fotoautótrofo Autoquimiolitótrofo Autótrofo

Compuestos
Fotoheterótrofo Mixótrofo (algunos) Quimioorganótrofo
orgánicos Heterótrofo
(pocos)

Fotótrofo Quimiolitótrofo Quimioorganótrofo

Oxigeno
• Clasificación de los microorganismos según el efecto del oxígeno:
• Aerobios
– obligados: requieren oxígeno (21% o más)
– Ej. Bacillus, hongos, etc.
• microaerofílicos: lo requieren pero a niveles menores que el
atmosférico (5-10%)
• Ej. Azospirillum
• Anaerobios
– facultativos: no requieren oxígeno, pero el desarrollo es
mejor con oxígeno.
– Ej. Levaduras, E. coli
– aerotolerantes: no son sensibles al oxígeno (crecen en
ausencia o presencia de oxígeno).
– Ej. Enterococcus faecalis, Sreptococcus spp.
– obligados: no toleran el oxígeno, muere en su presencia
• Ej. Methanobacterium, Clostridium

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENOEN TIOGLICOLATO

• Tubo # 1: Aerobio estricto
• Tubo # 2: Anaerobio facultativo
• Tubo # 3: Anaerobio aerotolerante ( Microaerofílico )
• Tubo # 4: Anaerobio estricto

FACTORES ORGANICOS DE
CRECIMIENTO
•Estos son compuestos orgánicos esenciales
que el organismo no puede sintetizar.

• Se incluyen las vitaminas, los amino
ácidos, las purinas y las pirimidinas.

Cultivo de microorganismos
Medios de cultivo :
- Químicamente definidos Un medio de cultivo incluye:
- Complejos - Fuente de Energía
- Macronutrientes esenciales
Tipos de cultivo: - Micronutrientes esenciales
- en medio sólido - Factores de crecimiento.
- en medios líquidos

MEDIOS DE CULTIVO
CULTIVO MICROBIANO. Es el desarrollo activo de
microorganismos en medios adecuados (medios de
cultivo).
• Toda célula viva para su mantenimiento y
reproducción requiere consumir nutrientes que le
permitan realizar los procesos metabólicos
necesarios para su supervivencia.
MEDIO DE CULTIVO
• Son una mezcla de nutrientes que en
concentraciones adecuadas y en condiciones físicas
óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos.
• Pueden ser: de laboratorio, industriales

Usos
• En laboratorio.
• Desarrollo de m.o (reproducción)
• Conservar m.o
• Aislar m.o.
• En la industria.
• Producción de biomasa.
• Producción de metabolitos

Requisitos de los medios

• 1. Ser nutritivos. contener los componentes
necesarios a los requerimientos del m.o de
interés
• 2. pH adecuado. La mayoría requiere pHs
neutros, pero algunos no, como Thiobacillus
ferroxidans pH=2.0
• 3. Ser estéril. para garantizar sólo el desarrollo
del ó los m.o de interés

COMPOSICION

• Deben contener los componentes necesarios para
formar las nuevas células por ejem:
• Bacterias
• Levaduras
• Hongos
• Algas
• Protozoarios

COMPOSICION
• Los hongos requieren una fuente orgánica a la que se
acompaña de antibióticos para evitar la presencia de
bacterias.
• El cultivo de microalgas requiere sales minerales
suplementadas con vitaminas. También suelen
añadirse antibióticos para evitar la contaminación
bacteriana.
• Para el cultivo de protozoos, que crecen difícilmente
en medios sólidos, se requieren medios líquidos
enriquecidos con otros microorganismos

CLASIFICACION. MEDIOS DE LABORATORIO
• Los medios de cultivo se pueden clasificar según diversos
criterios:
Por la naturaleza de sus constituyentes:
• Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias
complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente
complementadas con minerales y otras sustancias.
• Ejm. Extracto de levadura, agar-papa, extracto de maíz.
• En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades
exactas presentes de cada uno de ellos.
• Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una
composición química definida cualitativa y cuantitativamente.
• Se adquieren de laboratorios proveedores.
• Generalmente se usan en trabajos de investigación.

Clasificación uso del medio de cultivo:
De acuerdo al
• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el
crecimiento de un tipo de microorganismo en particular.
• Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo.
Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del
crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se
quieren cultivar.
• Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se
diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el
aislamiento de microorganismos específicos.
• Estos medios se enriquecen añadiendo sustancias que inhiban el
crecimiento de la flora no deseada.
• Un buen ejemplo sería el medio TCBS (tiosulfato-citrato-sales biliares-
sacarosa), especial para aislamiento de especies del género Vibrio, en
el que la sustancia inhibitoria son las sales biliares
• Medios diferenciales: contienen indicadores de productos derivados
de la actividad microbiana de los microorganismos.
• No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana.
Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos

Clasificación del medio.
• Por la consistencia
• medios líquidos son utilizados para la promoción del crecimiento.
Ejm. caldo lactosado para coliformes, caldos nutritivos,etc.
• El crecimiento se evidencia por la turbidez del tubo, si se trata de una
prueba bioquímica, además de la turbidez se observa un viraje del
indicador e inclusive en algunos casos (campanas de Durham)
producción de gas.----Ejm: caldo MRVP (peptona de
caseína, dextrosa, fosfato di potásico, agua) para investigar la ruta de
degradación de la glucosa.
• medios semisólidos ( agar al 0.7%)donde la finalidad principal es
poner de manifiesto la movilidad de la bacteria en este caso la
siembra se realiza con un asa recta, por picadura y se observa si la
bacteria presenta turbidez móvil en el tubo y si no solo se ve el
crecimiento a lo largo de la picadura.----Ejplo. Agar SIM.
agarMIA, agar PCA.medios sólidos. también son utilizados como
pruebas bioquímicas, donde el crecimiento se observa en la
superficie o pico de flauta (si es un tubo), si se trata de una placa (la
siembra puede ser masiva o estría cruzada), es comúnmente utilizada
para la obtención de colonias aisladas del microorganismo de interés.
• Existen diferentes tipos de estos
medios, diferenciales, selectivos, nutritivos, etc.

Nutrición microbiana

 Nutrientes: compuestos químicos necesarios para formar las macromoléculas.

• Nos centraremos en los organismos heterótrofos.

 No todos se requieren en iguales cantidades y distintos procariotas requieren
algunos más específicos.

- Macronutrientes: se precisan en grandes cantidades:
C, N, P, S, K, Mg, Ca, Na

- Micronutrientes: en menores cantidades o en cantidades trazas.

Macronutrientes

• Carbono
-puede obtenerse de:
compuestos orgánicos carbonados (heterótrofos)
CO2 (autótrofos)
- C es el 50% del peso seco.
- Requerido para proteínas, lípidos y azúcares.

• Nitrógeno
- es 12% del peso seco.
- En la naturaleza esta en forma:
- orgánica (menor parte): compuestos orgánicos nitrogenados.
- inorgánica: amoníaco (NH3), nitratos (NO3-) o N2.

• Se utiliza para amino acidos y ácidos nucleicos.
• La mayoría de los procariotas usan amoníaco, y algunas nitratos.
• El N2 gaseoso puede ser usado por las bacterias fijadoras de N2.

Macronutrientes

• S (azufre)
- se necesita en algunos amino ácidos y vitaminas.
- Disponible mayormente como S inorgánico:
sulfatos (SO4=) o sulfuros (HS-).
- Algunas bacterias degradan proteínas.

• Fósforo P
- El fósforo se encuentra como ion fosfato (PO4-3) en fosfatos
orgánicos o inorgánicos.
- Se utiliza en ácidos nucleicos y fosfolípidos.

• Magnesio
- estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos.
- importante para la actividad de enzimas

• Potasio (K)
- es necesario en algunas enzimas.

Macronutrientes

• Calcio (Ca), importante para algunos en membranas y endosporas.
• Sodio (Na) necesario para organismos marinos.

• El hierro (Fe) fundamental en respiración (citocromos y proteinas Fe-S)

- en condiciones anaeróbicas:
hierro en estado de oxidación +2 (ferroso)
es soluble.

- en condiciones aeróbicas:
en estado de oxidación +3 (férrico)
forma minerales insolubles.

Sideróforos: son agentes quelantes producidos por procariotas, que solubilizan el
hierro de los minerales y lo transportan dentro de la célula.

Micronutrientes
 Son metales.
 Muchos tienen función estructural en enzimas.

Factores de crecimiento:

• Compuestos orgánicos que se requieren en pequeñas cantidades.
• Ej. vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas.
• Muchos microorganismos son capaces de sintetizarlos, otros no.

COMPONENTES DE LOS MEDIOS

• Fuente de carbono
• Fuente de nitrógeno
• Micro nutrientes
• Suplementos
• Colorantes e indicadores

1. Fuentes de carbono
1. Carbohidratos.
• Monosacáridos.
• Dextrosa. Presente en jugos de frutas. Hidrólisis de lactosa, sacarosa, almidón.
• Oligosacáridos.
• Lactosa (suero de leche)
• Sacarosa.
• Dextrina.
• Polisacáridos.
• Almidón
• agar
2. alcoholes.
• Glicerol.
• Etanol
• Metanol
3 Lípidos.

4 hidrocarburos

2. Fuentes de nitrógeno

• Nitratos
• Sales de amonio
• Hidrolizados. Peptonas. Digeridos, extractos.

Fuentes de nitrógeno

• 1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas)
son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas
fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y
animales, pescado, caseína, gelatina, harina de
soja, algodón, girasol, etc..
Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y variando
tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena
de polipéptidos.
• 2) Extracto de carne, que se obtiene por extracción acuosa y
concentración posterior variando su tipo de acuerdo a la
calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la
misma.

Fuentes de N
• 3) Extracto de levadura, puede ser obtenida mediante
autólisis o plasmólisis de la levadura, es básicamente una
mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en H2 O
y carbohidratos.
• 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de
la malta de la cebada
• 5) "Cornsteep", el agua de maceración de la industria del
maíz tiene mucha importancia por su utilización como
componente esencial de los medios para la producción de
varios antibióticos y enzimas.
• Deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema
de impurezas que puede acompañar a las distintas materias
primas utilizadas.

3. Micronutrientes
• Según la cantidad pueden ser:
• Macronutrientes. En cantidades de gr/l. C, O2, H2, N2, P, S, K,
Na, Ca, Mg
• Micronutrientes.oligoelementos, en mg/l o µg/l
• Son activadores enzimaticos. Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, B.
• Se usan sales como: NaCl, KH2PO4, NH4(SO4), MnSO4,
ZnSO4, CaCl2
• El Na en altas concentraciones inhibe el crecimiento de
algunos m.o y favorece a otros. Ejplo. Agar manitol salado
(7.5% de ClNa) se usa para el crecimiento de staphilococcus.
• Agar streptococcus KF (6.5% ClNa) para crecimiento de
streptococcus

4. Suplementos
A. inhibidores.

• Antibióticos. Como penicilina, estreptomicina, cloranfenicol
(amplio espectro).
• Ejm. Agar saboraoud-glucosa. Contiene cloranfenicol.
• Fungicidas: fungizona, amphotericina (mohos y levaduras).
• Metales pesados.
• Ejmplo. Agar sulfito-bismuto. Contiene Bi y colorante verde
brillante e inhiben a bacterias Gram (+) y mayoría de Gram (-
), excepto a salmonella.
• Compuestos orgánicos inhibidores.
• Agar salmonella-shigella. Contiene altas concentraciones de
sales biliares y citrato de sodio que inhibe a las Gram (+) y
mayoría de gram(-) incluyendo a las coliformes, excepto
salmonella y shigella.

Suplementos

• B. factores de crecimiento.
• Compuestos orgánicos que se suministran en
bajas concentraciones.
• No son sintetizados por los m.o que se desea
favorecer, pero son necesarios para su
desarrollo.
• Vitaminas, aminoácidos, ácidos grasos.

Suplementos
C. colorantes e indicadores.
• Indicadores de reacción, indicadores de potencial oxido-
reductor, indicadores selectivos.
• Indicadores de la reacción del medio.
• Verde malaquita:
• pH muy ácido: amarillo
• pH =2 : verde
• pH = 11.5: azúl
• pH = 14: incoloro
• Rojo-fenol.
• pH = 7.8: azúl
• pH =7.8: púrpura.
• pH = 7.4: rojo
• oH = 7.0: naranja
• pH =6.5: amarillo.
• Para indicar producción de acidos; láctico, cítrico, acético

Suplementos

• Indicadores del potencial de oxido-reducción.
• Azul de metileno:
• Medio oxidante: azul
• Medio reductor: incoloro
• Indicadores selectivos.
• Verde malaquita, cristal violeta: inhiben bacterias gram(+)
• Colorantes básicos: inhiben bacterias.
• Ejplo. Agar Mc-Conkey. Contiene sales biliares y cristal violeta
que inhibe a las gram(+)
• Agar EMB. Para determinación de coliformes fecales. Contiene
eosina y azul de metileno que inhiben gram(+) y facilita el
desarrollo de enterobacterias.

PREPARACION
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio:
• a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o
• por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente
(medios de cultivo deshidratados).
Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados
porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor
probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica
y fisicoquímica adecuada.
• Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua
destilada o desmineralizada.
• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su
esterilización.
• Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.
• Cuidados : rehidratación, estado del material, esterilización,
almacenamiento.

Preparación
• 1. Rehidratación: El agua debe ser destilada o desionizada
• Los agares se añaden sobre el agua a temperatura ambiente, se dejan
embeber unos minutos, se agita enérgicamente y se calienta el
conjunto a 98-100 ºC durante el mínimo tiempo necesario para que,
agitando y volteando secuencialmente, la disolución sea total
(homogeneidad y transparencia al trasluz, excepto en algunos medios
opacos).
• En los medios con azúcares (glucosa, lactosa...) un excesivo
calentamiento lleva a caramelización, detectada por un
oscurecimiento del color del medio.
• Los medios agarizados cuyo pH es inferior a 5 son muy delicados
porque la acidez sumada al calor hidroliza las moléculas de agar,
haciéndose el medio friable y quebradizo. En tal caso puede añadirse
agar-agar fundido (15-20g/l) para restablecer las condiciones de
dureza necesarias, pero no se debe recalentar el conjunto.
• La homogeneidad de la disolución deberá ser total, no admitiéndose
el menor grumo ni heterogeneidad

Preparación
• 2. Secado de las placas.
• Para obtener colonias bien aisladas resulta fundamental
sembrar sobre placas cuya superficie no esté húmeda.
• Para ello, se pone la placa boca abajo (con el medio
colgando), se coloca la tapa de la placa abajo, se abre la
placa y se coloca la parte de arriba, con el medio
colgando, apoyada sobre la tapa, todo ello sobre papel
secante, preferiblemente estéril, esperando unos
minutos hasta que la superficie del medio deje de
mostrar agua condensada.
• Todo medio preparado debe almacenarse en la más
completa oscuridad, para evitar la formación de
peróxidos bacteriostáticos o bactericidas.

Preparación
• 3- Esterilización-----La esterilización en autoclave se hará siempre en
volúmenes inferiores o iguales a 1 litro, pues de lo contrario los
tiempos de autoclavado estándares no son válidos porque el calor de
esterilización no penetra hasta el centro del recipiente.
• Se controlará siempre el correcto funcionamiento del autoclave (no
es lo mismo 15' a 121 ºC que 14'a 121 ºC, por ejemplo).
• El excesivo calor durante el autoclavado y la posterior lentitud (o
excesiva rapidez) en el enfriamiento son las principales causas de
alteraciones en la calidad del medio final.
• Los medios con componentes grasos deben enfriarse en agitación
para evitar la formación de grumos.
• Los medios fluidos, con poca proporción de agar, debe enfriarse muy
suavemente y mantenerse por encima de 10 ºC para que el agar no
forme nubes opalescentes que podrían confundirse con una falsa
contaminación.
• Los medios con azúcares se esterilizan mejor por debajo de 118 ºC
(116 ºC, 30', por ejemplo), para evitar la caramelización, que se
detecta por oscurecimiento del medio y olor a azúcar tostada.
• El resto de medios en general se esteriliza a 121 ºC durante 15
minutos.

•
Preparación
4. Almacenamiento de medios deshidratados
• Los medios deshidratados almacenados bajo condiciones óptimas
tienen una caducidad media de 3 a 5 años desde su fabricación.
• Una vez abierto el bote no deben usarse después de 6 meses, de ahí la
importancia de registrar en el bote su fecha de apertura y de utilizar
envases de 100 gramos en todos los medios de uso infrecuente.
• Los medios deshidratados deben permanecer en un armario cerrado,
lejos de toda fuente de luz, humedad o calor (lámparas, autoclaves,
estufas).
• Conviene un lugar fresco, pero no un refrigerador, porque condensaría
agua.
• No almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o
vapor.
• Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se
hidraten o decoloren.
• Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se
debe almacenar entre 2 y 8C, a menos que el medio requiera alguna
condición diferente.

Ejms. Medio: Algas Clorofíceas

• Conjunto de nutrientes NPK y oligoelementos
en solución acuosa estéril necesarios para
provocar "Blooms algales".
• Se añade a razón de 5 ml por litro final de
medio base (Agar Algas, caldo Algas), antes o
después de la esterilización (para evitar
precipitados, en el caldo se añade después de
esterilizar éste por filtración).

Medio complejo para organismos
heterótrofos
Nutrientes Cantidad
Agua 1L
Peptona 5g
Extracto de levadura 3g
NaCl 8g

Medio Sólido
Agar 15g

Medio Complejo para el Crecimiento de Bacterias Fastidiosas
Componente Cantidad Función del componente
Extracto de Carne 1.5 g Fuente de vitaminas y
otros factores de crecimiento
extracto de Levadura 3.0 g Fuente de vitaminas y
otros factores de crecimiento
Peptona 6.0 g Fuente de aminoácidos,
N, S, y P
Glucosa 1.0 g Fuente de C y energía
Agar 15.0 g Agente de solidificación
Inerte
Agua 1000 ml pH 6.6

Agar McConkey:
• Medio diferencial para detección, aislamiento y enumeración de bacterias
coliformes y patógenas intestinales.
• Acción diferencial. Los microorganismos capaces de fermentar lactosa
producen una caída de pH, junto con una absorción del colorante, apareciendo
en la colonia el color rojo, las colonias de microorganismos que no fermentan
la lactosa permanecen incoloras.
• Composición por Litro:
Peptona de gelatina- 17g
Peptona de caseína- 1.5g
Peptona de carne - 1.5g
Lactosa- 10g
Sales Biliares- 1.5g
Cloruro Sódico- 5g
Rojo Neutro- 0.03g
Cristal Violeta- 0.001g
Agar- 13.5g
pH 7.1+- 0.2

Agar Nutritivo

• Medio para fines generales que promueve el
crecimiento de la mayoría de los
microorganismos poco exigentes.
• Extracto de Carne de buey- 3g
• Peptona trípsica de gelatina- 5g
• Agar- 15g
• Cloruro sódico y glucosa- 5 g
• Agua destilada hasta 1000 ml

Agar Papa Dextrosa:

• Medio para el cultivo y enumeración de levaduras y
mohos a partir de alimentos y otros materiales. Los
hidratos de carbono y la infusión de papa favorecen
el crecimiento de levaduras y hongos, en tanto que
por el bajo rango de pH, la flora acompañante se
reduce significativamente.
• Agar -15g
• Dextrosa - 20g
• Infusión papa - 4g

Agar Sabouraud

• Medio para la detección y aislamiento de hongos.
• Para que ocurra el crecimiento selectivo de hongos
sobre bacterias en la muestra depende tan solo de la
reacción ácida (pH 5.6).
• Digestivo pancreático de caseína- 5g
• Peptona de tejido digestivo -5 g
• Dextrosa -40g
• Agar- 15g

Preparación de Agares, en laboratorio
• Agar McConkey …. 50 g/l
• Agar nutritivo ……. 20 g/l
• Agar LIA …………. 32 g/l
• Agar TSI …………. 65 g/l
• Agar EMB ………. 36 g/l

MEDIOS INDUSTRIALES
• La preparación de medios para el desarrollo
de procesos de fermentación es una etapa
fundamental para asegurar la productividad
de los mismos.
• Se usan siempre medios complejos
• Es conveniente considerar:
– diseño
– formulación y
– optimización de los mismos.

1. Diseño del medio
• tiene como finalidad la elección de los componentes
necesarios para lograr el crecimiento y la formación de
productos correspondientes al proceso a desarrollar.
• Tener en cuenta todos los aspectos relacionados a:
– los requerimientos nutricionales del microorganismo.
– y algunos específicos del proceso
– la disponibilidad real de los componentes y
– consideraciones sobre las materias primas.
• Otros aspectos importantes son:
• Los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de
fermentación y
• El conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan
la formación de algunos productos.

Requerimientos nutricionales
• Están determinados por
• Tipo de metabolismo celular:
• autotrófico, como las algas y algunas bacterias,
• heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de
carbono.
• condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. En la ausencia
del 0 2 , el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones
por algunas bacterias.
• Las bacterias metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan
H2 para reducir el C02 a CH4 para obtener energía.
• las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza inorgánica
u orgánica.
• P y el S son suministrados en forma de P04 H y S04 (o aminoácidos
azufrados).
• El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares.
• El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados, y
además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros
componentes.

Requerimientos nutricionales
• K y Mg son también esenciales. Una parte importante del
primero está unida al RNA de manera que los requerimientos
de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del
RNA de las células, como la velocidad de crecimiento.
• micronutrientes se distinguen 2 categorías:
• a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento
como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y
• b) los que son raramente esenciales como
B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn.
• Factores de crecimiento comprenden ciertos aminoácidos y
vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido
pantotético, niacina, etc., que representan para muchas
bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los
cuales no se produce crecimiento celular.
• Otros factores de crecimiento son las
purinas, poliamidas, putrescinas.
• Considerar también: Otros requerimientos y biodisponibilidad
de nutrientes,

Otros agregados
• Son nutrientes requeridos por los microorganismos de
manera específica según el proceso considerado.
• Los precursores que constituye la base de una molécula
que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el
ácido fenil acético para la penicilina.
• El sulfato, en el proceso de fermentación alcohólica, que
favorece la formación de glicerol.
• La producción de ácido cítrico debe considerar la
influencia negativa que para el proceso tiene un exceso
de hierro en su composición; por lo tanto dicho medio
debe diseñarse de manera tal que su preparación (a partir
de diversas materias primas) considere una eliminación
total del hierro y posterior agregado del mismo en
cantidades controladas.

Costo
• El costo de los nutrientes representa del 10 al 60% del
costo total de los productos obtenidos por fermentación.
• Las materias primas más importantes corresponden a
fuentes de carbono y de nitrógeno.
• Las fuentes de carbono pueden ser:
• 1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa,
sacarosa, lactosa, almidón, dextrina;
• 2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y
• 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.
• Son muy importantes también por su disponibilidad y
costo reducido otras materias primas que contienen
hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas,
suero de queso, etc

2. Formulación
• Tiene que ver con los aspectos cuantitativos del medio, es
decir debe establecer las concentraciones de cada
componente.
• Una primera aproximación con respecto a las cantidades a
utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la
composición de biomasa del microorganismo a ser
empleado.
• Es decir, que si queremos formular un medio para producir
una determinada cantidad de biomasa debemos proveer
las distintas fuentes que aseguren como mínimo las
cantidades de elementos que deben ser suministrados.
• Una composición elemental y típica de la biomasa es (%
peso seco): Carbono, 46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-3;
Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%.

3. Optimización
• Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la
optimización de los medios de cultivo.
• Entre ellas podemos mencionar las siguientes:
• 1) No existencia de información respecto a coeficientes de
rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del
microorganismo determinado.
• 2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de
microelementos y factores de crecimiento.
• 3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso
respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en
cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.
• 4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del
crecimiento y formación del producto.
• 5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
• La metodología más elemental consiste en realizar experimentos, en
los cuales se varía la concentración del componente a ensayar
manteniéndose constante las concentraciones de los demás
ingredientes.

Optimización
• Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que
hace falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el
operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante
del crecimiento.
• Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el método
resulta poco práctico.
• Por otra parte puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar
la concentración de un componente referida de los niveles de
los otros, se produzca interacción entre componentes.
• Se puede mejorar mucho la optimización en batch empleando
técnicas estadísticas.
• Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo
limitado por un sólo factor o sustrato a lo largo de todo el
experimento, pudiéndose conocer por lo tanto el efecto que su
variación ejerce sobre el cultivo al mantenerse los demás
componentes constantes.

4. Cuidados en la esterilización
• Existen datos, en bibliografía, de cálculo de tiempo de mantenimiento para
la esterilización de 45,000 lt. de medio (con un valor de No = 2 x 10 7
esp/ml) que demuestra que son necesarios solamente 8.8 min como tiempo
de mantenimiento a 120 C.

• Debe tenerse en cuenta que estas consideraciones son válidas para el
cálculo del tiempo de esterilización mínimo, a 120 C, en fermentadores
industriales del volumen considerado.
• Lo que es importante en este caso es el tipo de recipiente, su geometría y el
volumen de medio a esterilizar.
• El tiempo de esterilización (o sea el tiempo de mantenimiento a 120 C)
requerido por ejemplo para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min
y para tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de 2000 ml
requieren de 30-35 min mientras que si son de 125 ml el tiempo es de 12-14
min.
• En cambio un frasco pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y una
botella de suero de 9000 ml 50-55 min.
• Estos tiempos aseguran la eliminación de esporos bacterianos de las
especies más resistentes

4. fundamental,en la esterilización
Es
Cuidados además de esterilizar correctamente los medios, conservar al
máximo la calidad nutriente de los mismos.
• Los medios de fermentación utilizados en la industria son casi siempre
complejos y a menudo con sólidos en suspensión, de manera tal que los
cambios que se producen durante la esterilización pueden ser
importantes….A veces puede haber modificaciones beneficiosas o
perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización.
• La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes
de un medio, durante la esterilización por calor, dependerá no solamente
de la naturaleza de los componentes sino también de la temperatura,
duración del calentamiento, pH del medio, y de la agitación.
• Un ejemplo típico de interacción es la reacción de Maillard que tiene lugar
entre los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de
proteínas, aminoácidos, etc. …Se forman así productos de condensación
con lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y
nitrógeno amínico.
• Por ese motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por
separado de los compuestos nitrogenados orgánicos.
• Las sales de NH4 + se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se
volatiliza

4. Cuidados en la esterilización
• En medios químicamente definidos se puede observar pérdida
importante de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por
precipitación de sales poco solubles como MgNH 4PO4 , MgKP04
y MgNaP04.
• Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y
magnesio aparte de los fosfatos.
• Los aminoácidos y factores de crecimiento son muy lábiles al calor.
Entre los aminoácidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre
las vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son
las más susceptibles de sufrir descomposición.
• En todos estos casos es aconsejable disolverlas separadamente
en pequeños volúmenes de H2 O y luego esterilizarlas por
filtración.
• En la misma forma que la inactivación de microorganismos puede
ser considerada una reacción cinética de primer orden, también la
destrucción de algunos compuestos sensibles al calor puede ser
tratada en la misma forma.

Casolas primeras épocas se utilizaba la levadura obtenida de la fabricación
• En
aplicativo: Cultivo de Levaduras
de cerveza primero y de las destilerías después, hasta que finalmente se
establecieron las plantas de producción de levadura durante el siglo 19.
• La primera planta de producción comenzó a operar en Holanda en
1780 con el llamado proceso Dutch que era anaerobio y que tenía
sólo rendimiento del 4 al 6% con respecto a la materia prima
usada.
• Posteriormente se mejoró el rendimiento, que pasó a ser del 12-
22% con el proceso Vienna, también conducido sin aire, en 1846.
• Con la introducción de la aireación en el proceso de
producción, que tiene lugar en 1879, se aumentan
considerablemente los rendimientos, que pasan a ser del 50 al
60% del teórico.
• La última etapa importante de modificación de la tecnología tiene
lugar con la alimentación controlada de azúcar a los mostos en
fermentación, cambio introducido por un científico danés, Sak, y
un alemán, Hayduck, en 1919.
• Con melazas de remolacha o de caña pueden alcanzarse
rendimientos cercanos al 100% del teórico.
• Actualmente se está tratando de encontrar otras fuentes de
materias primas alternativas a las melazas, como el suero de
leche hidrolizado

CULTIVO DE LEVADURAS
• La producción mundial de levadura prensada (27-30% de materia
seca) es considerable

• Consumo anual per cápita de levadura prensada (27-30% de materia
seca) está en el rango de 1.5 a 2.1 Kg para los países europeos,
mientras que en países de Sud América como Chile es de 1 Kg y en
Argentina 0.6 Kg.

• Cepas y medios de mantenimiento empleados

• Inicialmente fue la levadura de cerveza, el Saccharomyces uvarum,
S.carlsbergensis, el empleado con fines de panificación.
• Se han ensayado también muchas otras cepas, no sólo del mismo
género sino también las pertenecientes a distintas especies de
Candida, Hansenula y Zygosaccharomyces, aunque ninguna de ellas
demostró poseer ventajas sobre el Saccharomyces cerevisiae.

Requerimientos nutricionales de Levaduras
• Fuentes de carbono y energía que puedan emplear la
Saccharomyces cerevisiae figuran en primer lugar la glucosa y la
sacarosa, aunque también pueden emplearse
fructuosa, galactosa, maltosa y suero hidrolizado, ya que la
levadura de cerveza no puede asimilar lactosa.
• El nitrógeno asimilable debe administrarse en forma de
amoníaco, urea o sales de amonio, aunque también se pueden
emplear mezclas de aminoácidos. Ni el nitrato ni el nitrito pueden
ser asimilados.
• Los macroelementos indispensables son el fósforo que se emplea
comúnmente en forma de ácido fosfórico y el Mg como sulfato de
magnesio, que también provee S.
• Son también necesarios el Ca, Fe, Cu y Zn como elementos
menores.
• Por ejemplo, se ha establecido que S. cerevisiae requiere 200 ug
de Zn, 75 ug de Fe y 12-15 ug de Cu por litro de medio para
crecimiento óptimo.

Requerimientos nutricionales de Levaduras
• Un requerimiento esencial está constituido por las vitaminas del
grupo B como biotina, ácido pantoténico, inositol, tiamina,
pyridoxina y niacina.

• Se ha estimado que los requerimientos de la biotina son de 100
ug de biotina por 100 g de azúcar suministrados para el
crecimiento de la levadura.

• El ácido pantoténico, que es un componente de la coenzima A, es
también requerido por muchas especies, mientras pocas especies
requieren inositol.

• Con respecto a la tiamina se ha demostrado que aumenta la
actividad fermentativa de la levadura.

Medio de producción de Levaduras
• La materia prima elemental de elección es la melaza de remolacha o de caña o
ambas en conjunto, cuando se las dispone.
• Los aspectos fundamentales a considerar son la disponibilidad y la composición de
la melaza incluyendo la presencia de inhibidores o substancias extrañas que
pueden contener.
• La sacarosa es el azúcar predominante en ambas melazas. La materia orgánica no
azúcares en la melaza de caña está compuesta fundamentalmente por gomas
solubles y ácidos orgánicos sobre todo aconítico y compuestos nitrogenados.
• En el caso de la melaza de remolacha los no azúcares están constituidos por un
mayor porcentaje de compuestos nitrogenados como betaína y ácido glutámico y
algunos ácidos orgánicos como láctico, málico, acético y oxálico.
• En las cenizas predomina en ambas melazas el K, teniendo mayor porcentaje de
fósforo la melaza de caña que la de remolacha.
• Es interesante comparar el contenido de las vitaminas de ambas melazas por la
importancia que tienen estos compuestos en la producción de levadura.
• Como puede verse el contenido de biotina es superior en la melaza de caña y el de
pantotenato de Ca en la remolacha.
• La melaza de remolacha tiene mayor cantidad de compuestos nitrogenados
asimilables.
• Es por ello que los fabricantes prefieren, si tienen disponibilidad suficiente, utilizar
mezclas de ambas melazas.

• Con respecto a componentes extraños (que pueden afectar el
rendimiento) se han detectado en las melazas algunos pesticidas
en el caso de melazas de caña como
lindane, aldrin, heptaclor, dieldrin, etc. en cantidades variables
desde trazas hasta 0.21 mgKg 1 en el caso del lindane en melazas
de cañas de Honolulu.
• Las melazas se utilizan generalmente diluídas al 50%.
• Como los compuestos coloidales de la melaza de caña pueden
causar problemas en varias etapas del proceso de
fermentación, el mosto es casi siempre clarificado. La clarificación
puede hacerse antes o después de la esterilización, que se realiza
en la última etapa por inyección de vapor directa, a la presión
atmosférica en la mayor parte de los casos.
• La clarificación se realiza fundamentalmente con la ayuda de
centrífugas intermitentes.
• Se han mencionado como ventajas de utilizar mostos clarificados
que la levadura es más fácil para prensar y secar y que además, la
clarificación probablemente facilita la transferencia de O2 y
reduce la formación de espuma.

• La melaza es deficiente en algunos macroelementos como
N, P, S, Mg, y también Zn en la mayoría de los casos, por lo
cual es necesario su agregado a los mostos.
• La cantidad de nitrógeno y fósforo a ser agregado depende
de las prácticas comerciales.
• El nitrógeno puede representar entre el 6.5 y el 10% de la
levadura seca y el P expresado como P 2O5 varía entre 1.5 y
3.5%.
• Ambos valores, sobre todo el contenido de nitrógeno, está
relacionado con el poder fermentativo y la estabilidad de la
levadura en el almacenamiento.
• El nitrógeno que se suministra generalmente como agua
amoniacal y el P como ácido fosfórico, son alimentados
durante el proceso de acuerdo a programas de
alimentación que dependen de las prácticas comerciales.

• El Mg, S, y Zn son incorporados en forma de sulfatos
• El MgS04 se suele incorporar a razón de 1 g de la sal
heptahidratada y el Zn en una proporción de 10 mg
del sulfato tetrahidratado por Kg de melaza a
fermentar.
• Si se utiliza melaza de remolacha es indispensable
agregar biotina
• Es a menudo indispensable agregar tiamina y ácido
pantoténico

COMPOSICIÓN DE LA MELAZA DE CAÑA Y REMOLACHA

Separación, lavado y empaquetado de Levaduras
• Al final de la etapa de producción comercial las células de levaduras son
separadas por centrifugación y lavadas en una o más etapas.
• Las operaciones de lavado son realizadas para reducir los sólidos no debidos a
levaduras que pueden dificultar la filtración y oscurecer el color de la
levadura prensada.
• La eficiencia del sistema de lavado está determinada por la concentración de
los sólidos de levadura, la cantidad del agua usada y el contenido de sólidos
del agua de dilución que tiene importancia cuando el agua de lavado se
utiliza en contracorriente a la crema de levadura.
• El proceso de separación produce una crema de levadura ligeramente
coloreada conteniendo hasta 22% de sólidos debidos a células y
prácticamente libres de otros materiales.
• La crema es almacenada en tanque agitados a 2-4 °C con ajuste de pH a 2.5-
3.5.
• Como la mayor parte de la levadura se vende como levadura prensada
conteniendo entre 27 y 30% de materia seca, es necesario realizar una etapa
de deshidratación de la crema (que contiene un 18-22% de sólido) hasta esos
valores, lo que se efectúa con filtros prensas o filtros rotatorios.
• Finalmente la levadura es extrudida en forma de panes de peso variable
según las exigencias del mercado, que son envueltos en papel celofán o en
otro tipo adecuado de papel

Separación, lavado y empaquetado de Levaduras
• Otra forma de terminar el proceso de producción es someter la
crema de levadura a un filtrado y extrudido para producir partículas
de 0.5 a 2 mm que son secadas en equipos de lecho fluidizado, lo
que da origen a las llamadas levaduras secas activas o levaduras
instantáneas con bajo contenido de humedad, que se envasan al
vacío o en atmósfera de nitrógeno y que pueden conservarse por
períodos prolongados a temperatura ambiente.
Control de calidad
• La levadura prensada producida por el proceso descrito debe cumplir con las
exigencias impuestas al cual está destinada, o sea para la panificación.
• La función fundamental que debe cumplir es levar las masas preparadas con
harina y conservar esas cualidades durante un tiempo adecuado.
• Existen diversas técnicas de control que se utilizan para verificar la calidad de
la levadura comercial.
• Todas se basan en la preparación de una masa con harina, agua y sal, además
de levadura.
• En algunos casos se mide el tiempo en minutos que tarda en levar una masa
preparada en una mezcladora en condiciones estandarizadas, que es colocada
en un molde a temperatura de 30 C tomando como referencia un tope que
esta conectado a una alarma que suena cuando es alcanzado por la masa

Proceso
de
Produccion

Escalas:

120 Kg intermedio
240 Kg stock
2500 kg pitch
15000 a 100000 kg
final

Procesos posteriores a la producción de Levaduras

Centrifugación- Secado (por filtración, hasta 30 % de
sólidos) - Mezclado (con agregado de emulsificantes
y aceites vegetales)- Extrusión- Envasado-
Conservación en frió
• Levadura seca activa
• Se somete a un proceso de secado en túnel con aire
caliente forzado luego de la extrusión durante un
periodo total de 6 horas.
• Se envasa a vació o en ambiente de nitrógeno. El
agregado de antioxidantes y surfactantes no iónicos
permiten aumentar su estabilidad.

MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOS
Para conseguir una recuperación óptima de bacterias anaerobias es
fundamental elegir correctamente los medios de cultivo primarios.
La mayoría de estas bacterias requieren para su crecimiento
vitamina K1 y hemina.
Para su aislamiento e identificación presuntiva se aconseja utilizar
una combinación de medios enriquecidos no selectivos, selectivos y
diferenciales, entre los que se incluyen:
- Un medio de agar sangre para anaerobios como agar Brucella
o agar Schaedler con un 5% de sangre de carnero, a los que se
añaden vitamina K1 (1 µg/ml) y hemina (5 µg/ml).
En estos medios crecen tanto las bacterias anaerobias
facultativas como las anaerobias obligadas.


•Agar con yema de huevo (AYE). Cuando se sospecha la presencia de
clostridios, para detectar la producción de lipasa y/o lecitinasa.
..Un agar selectivo para Clostridium difficile, cuando se investigue la
presencia de esta especie, como agar fructosa-cicloserina-cefoxitina
(CCFA) o agar yema de huevo-cicloserina-cefoxitina (CCEY).

• Como medio líquido de enriquecimiento o de mantenimiento se
recomienda usar caldo de tioglicolato sin indicador, suplementado con
vitamina K1 (200 µl) y hemina (20 µl).
Este medio se utiliza para recuperar las bacterias anaerobias en caso de
que falle la anaerobiosis en la incubación de los cultivos primarios, haya
una inhibición del crecimiento debido a antibióticos o a otros factores, o
bien cuando las bacterias se encuentran en cantidades muy pequeñas.

Sistemas de incubación en anaerobiosis.
Su elección viene determinada por el coste, número de cultivos y
limitaciones de espacio.

Los más comunes son las cámaras, jarras o cajas y bolsas de
anaerobiosis. Con independencia del sistema utilizado es importante
monitorizar el ambiente anaerobio con una tira indicadora de azul de
metileno o de resarzurina, y la temperatura de incubación.

Existen diferentes modelos de cámaras para anaerobios, en las que se
consigue una atmósfera anaerobia mediante una mezcla de gases que
contiene 5% de H2, 5-10% de CO2 y 85-90% de N2.

Poseen un sistema de intercambio que consiste en un compartimento
rígido con una puerta interior y otra exterior.

Las jarras son recipientes cilíndricos, de metal o de plástico rígido, que
deben cerrarse herméticamente y en los que la atmósfera anaerobia se
obtiene entre 1 y 2 horas después de introducir unos sobres
(GasPak®, Becton Dickinson) en los que, al añadir H2O se libera H2 y
CO2El H2 se combina con el oxígeno existente formando agua gracias a la
presencia de un catalizador.

Actualmente existen sistemas en los que no hace falta añadir H2O o
introducir el catalizador (Anaerogen®, Oxoid).

Mediante una técnica automatizada, Anoxomat®, también se puede
lograr una atmósfera anaerobia en las jarras.

Como ya se ha señalado debe introducirse un indicador de oxígeno, que
suelen ser tiras de papel con azul de metileno, que se decoloran al
desaparecer la presencia del oxígeno.

Cultivos en anaerobiosis
•tubos con medio de cultivo llenos por completo.
•medios con sustancias que reaccionan con el oxígeno y lo
excluyen.
•dispositivo especial (cámara anaeróbica)
•cajas o tubos incubados en recipientes con granos
germinados (cebada, centeno)

OBTENCION DE CULTIVOS PUROS
1. Siembra en superficie. Extensión y estría.

2. Vertido en placa. Mezclando los microorganismos con agar fundido a 44ºC, y se
echa luego sobre la placa. Los microorganismos crecen en la superficie y dentro

3. Técnicas de enriquecimiento. Aplicar el elemento adecuado (por ejemplo
benzoato) al tubo de ensayo, se aíslan microorganismos que no se aíslan con los
métodos anteriores y que están en pequeñas cantidades (como pueden ser
aquellos que sólo usan benzoato). Se debe realizar varias veces para asegurarnos
que tenemos un cultivo puro. (Otros ejemplos: elevada temperatura para
termófilos; calentamiento a 80ºC para esporulados y termófilos.)

4. Dilución seriada. Sólo aíslo el microorganismo más abundante. (Lister con
Streptococcus lactis hace diluciones, cada dilución la siembra en 20 tubos, cuando
de un dilución dólo crece el 5% la probabilidad de que en ese tubo crezca 1 aólo
tipo de microorganismo es del 4.8%, así estamos seguros de que sólo existe un tipo
de microorganismo).

OBTENCION DE CULTIVOS PUROS
5. Micromanipulador: aislamos una sola célula utilizando este
aparato.

6. Aislamiento de microorganismos anaerobios.
Micromanipulados. Obtenemos los organismos anaerobios por
una adición de agar a 44ºC, mezclamos y tapamos con parafina
(aceite estéril). Eliminamos el O2 con agentes reductores
(tioglicolato, añadimos un colorante REDOX para ver cuando se
ha reducido), con una vela que consuma el oxígeno, usamos la
jarra de anaerobios (sistema que produce CO2 + H2 y un
catalizador que consume O2). Cuanto más sensibles son más
precauciones tenemos que tomar. PARAFINA

CARACTERIZACIÓN DE CULTIVOS PUROS
•Las colonias deben ser iguales en forma, tamaño y color.

• Que no existan formas inhibidas.

• Al microscopio deben tener un aspecto común.

• Tiene que tener iguales propiedades tintoriales.

• Deben ser bioquímicamente y fisiológicamente iguales.

Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.

Taxonomía Bacteriana Convencional. Identificación de especies

Criterio Metodología de ejemplo

Observación Macroscópica Observación de colonias
(formas, pigmentos, etc.)

Observación Microscópica Tinciones (Gram)
(formas, agrupación)
(esporas, cápsula, flagelos, etc.)

Metabolismo Baterías bioquímicas
(uso de sustratos
[fermentación])
(producción de metabolitos
secundarios)

Otras propiedades Resistencia a antibióticos
(antibiograma, MIC, etc.)

Morfología macroscópica. Colonia Bacteriana

S. aureus

S. aureus

S. aureus

Colonias de
S. aureus

S. aureus

CONSERVACION DE CULTIVOS BACTERIANOS
MANTENIMIENTO

1.- Debemos transferir periódicamente, ya que los tubos de agar se
secan, se evapora el agua.

2.- Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede
hacer más tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer.

3.- Se disminuye la temperatura, congelamos las células. Para proteger
las células y que no se formen cristales que las dañen se usa el glicerol

4.- La liofilización es la sublimación a alto vacío de las muestras
congeladas con rapidez.


FORMAS DE CRECIMIENTO. CULTIVOS
• Según la periodicidad del proceso la
fermentación puede ser continua,
semicontinua o intermitente.

CURVA DE CRECIMIENTO
Fermentación intermitente
• Conocida también como fermentación por lotes o fermentación
Batch, se refiere al crecimiento de células en un sistema cerrado, en el
cual una vez cargada la masa inicial del medio, esta no es alterada por
adiciones o retiros posteriores de nutrientes hasta que culmina la
fermentación.
• Una consecuencia lógica de este proceso es que en él varían el
pH, temperatura y la concentración de nutrientes con el tiempo, lo
cual da lugar a una conducta cíclica en el crecimiento
celular, conocido como ciclo de crecimiento.
• Ciclo de crecimiento microbiano. Cuando un medio de cultivo es
inoculado con un cultivo semilla (inóculo), los microorganismos
toman selectivamente los nutrientes del medio y los convierten en
biomasa y productos metabólicos, produciéndose el crecimiento
celular.
• Sin embargo, ese crecimiento no es lineal y en los cultivos batch sigue
un patrón conocido como ciclo de crecimiento microbiano, el cual
puede ser dividido en etapas o fases de crecimiento. tales fases son;
• a) fase de acostumbramiento, b) fase de aceleración, c) fase
exponencial, d) fase de desaceleración, e) fase estacionaria y f) fase
de muerte

Crecimiento microbiano en medio líquido

Crecimiento en cultivo cerrado (batch)
Luego de la adición de bacterias al medio líquido fresco se observa la
siguiente cinética de crecimiento

• Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun no se dividen
• Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones
particulares, tiempo de generación mínimo

• Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0 ó estadísticamente = 0
cuando: vc=vm (vel. crecimiento es igual a la de muerte)
– nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad
– acumulación de desechos, inhibición del crecimiento

• Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad de división
celular

Desventajas de la fermentación intermitente.
• La mayor ventaja de los procesos de fermentación Batch es su
sencillez.

• presenta grandes desventajas ; alto requerimiento de mano de
obra, y demasiados tiempos muertos.

• En toda fermentación batch existen tiempos muertos o periodos
inútiles, tales son; la fase de adaptación y la fase de decaimiento
durante el desarrollo celular, y el periodo de descarga y
renovación de la carga del reactor para un nuevo batch.

• Las fases de adaptación y decaimiento en el desarrollo microbiano
son exclusivas de los procesos batch y son debidos, como se
explicó anteriormente, al proceso de readaptación de la
maquinaria enzimática por parte de los microorganismos, así
como al agotamiento del sustrato al final del proceso.

Fermentación semicontinua
• Las desventajas indicadas que afectan la eficiencia de los
procesos batch pueden ser subsanadas atacando sus causas, así
por ejemplo se puede evitar la presencia de las fases de
adaptación y de decaimiento, si periódicamente:

• se extrae medio agotado y se repone con medio de cultivo fresco.
– manteniendo la concentración de sustrato lo suficientemente alta como
para que no haya falta de disponibilidad.
– manteniendo la concentración del producto lo suficientemente baja como
para que no sobrepase los límites tolerables por los microorganismos,
– Asimismo si se desea evitar la formación de productos
secundarios se puede hacer las adiciones de medio de cultivo
nuevo siempre antes de alcanzar la fase estacionaria, con lo
cual se mantendrá el cultivo permanentemente en la fase de
desarrollo exponencial en la cual se sintetizan sólo productos
asociados al crecimiento

•
Proceso semicontinuo y el tiempo
Los parámetros de mayor importancia son el volumen
de adición, los cuales serán calculados de modo que el cultivo se
mantenga siempre en la fase logarítmica de crecimiento.
• Si el volumen extraído es muy grande puede diluirse tanto el
medio que la masa microbiana puede volver a la fase de
acostumbramiento, y si el volumen extraído es muy pequeño para
igual tiempo el cultivo puede agotarse y pasar a la fase estacionaria.
• Si el tiempo de renovación es muy grande el cultivo puede
alcanzar a la fase estacionaria y si es muy pequeño el cultivo puede
regresar a la fase de acostumbramiento.
• El proceso se maneja de modo que una vez alcanzada la
concentración X’ de células en la fase exponencial, se extrae un
volumen del medio exhausto igual a:
• V= ( X’ - Xo) d
• Luego se agrega igual cantidad de medio de cultivo nuevo,
diluyendo el producto y las células hasta un valor X’o.

EXPRESION MATEMATICA DE

Parametros Cinéticos

Tiempos de generación en bacterias

CINÉTICA DE CRECIMIENTO
• Como mínimo un modelo de proceso microbiano debe
tener: balances de materia de la biomasa activa y del
sustrato primario que limita la tasa de crecimiento de la
biomasa.
• En La mayoría de los casos el sustrato limitador es el
donante de electrones.

• Debido a la naturaleza auto catalítica del crecimiento
microbiano, es lógico suponer que la concentración de
microorganismos influye en la velocidad con que
aumenta la población., rx
rx=μX

Velocidad específica de crecimiento
• Para un tipo de microorganismo dado depende principalmente:
– La composición y concentración del medio de cultivo.
– Presencia de inhibidores
– Temperatura y pH

x = concentración de microorganismos g/1
t = tiempo, h
μ = velocidad específica de crecimiento h-1

Parámetros estequiométricos
• Durante el crecimiento microbiano se produce un proceso de
reducción de la concentración de sustrato, y de incremento en la
concentración del producto.
• La relación entre estas variables darán una idea clara de la
economía y la eficiencia del proceso.
• Se puede establecer una relación estequiométrica entre estas
variables a través de los siguientes parámetros: balance de
materiales para el sustrato, coeficientes de crecimiento, y
coeficiente de mantenimiento.
• Balance del consumo de sustrato. El sustrato es utilizado por las
células como fuente de energía y como materia prima para la
síntesis de macromoléculas constitutivas necesarias para el
crecimiento celular,
• por tanto en un tiempo cualquiera, el consumo de sustrato (ΔS)
estará dado por:
• S = S asimilado + S convertido + S energía de + S energía
en biomasa en producto crecimiento de manteni-
miento

Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato
• Está dado por la relación entre la variación de la biomasa y la variación del
sustrato, según la expresión.
• Yx/s= - X/ S
• En un cultivo intermitente existe diferencia entre el coeficiente de crecimiento
aparente y el coeficiente de crecimiento verdadero,
• coeficiente de crecimiento aparente se debe a la variación de biomasa y
sustrato al final del proceso.
• coeficiente de crecimiento verdadero es una medida instantánea de
tales variaciones.
• Para organismos aerobios que crecen en un medio de glucosa se
tiene que los Yx/s típicos son:
– para levaduras y bacterias varía entre 0.4 y 0.6 g/g,
– en condiciones anaerobias el valor de Yx/s es substancialmente menor.
• Para substratos mas o menos reductores, el valor del coeficiente
cambiará. Así, si el sustrato es el metano, y los m.o. son bacterias el
Yx/s tendrá valores entre 0.6 y 1.0 g/g

Coeficiente de Rendimiento biomasa-oxígeno.

• Esta dado por la relación de la biomasa producida y
el consumo de oxígeno del medio.
• Yx/o2= - X/ O2
• El valor de Yx/o2 para bacterias y levaduras aerobias
que crecen en un medio de glucosa es de 0.9 a 1.4
g/g, al igual que en el caso del Yx/s, un cambio en el
sustrato ocasionará variaciones en el valor de este
coeficiente, así los mismos microorganismos en las
mismas condiciones, pero en un medio con metano
como sustrato tendrán un Yx/o2 de alrededor de 0.2
g/g.

Coeficiente de formación de producto (qr), o Yp/s.
• Está dado por la relación.
• Yp/s = - P/ S
• Este valor también puede variar según el producto y la forma
como se producen.
• Los productos microbianos pueden ser clasificados en tres
grandes categorías: productos asociados al crecimiento,
productos no asociados, y productos asociados mixtos.
• Los productos asociados al crecimiento son producidos
simultáneamente al crecimiento microbiano, en este caso la
relación específica de formación de producto es
proporcional a la tasa específica de crecimiento (µ). Esto
sucede durante la formación de productos del metabolismo
primario, pero sólo en la fase de crecimiento exponencial.
• La producción de una enzima constitutiva es un ejemplo
típico de un crecimiento asociado.

Coeficientes para m.o aerobios
Yx/s Yx/o2
Organismo Sustrato
g/g g/mol g/g-C g/g
Enterobacteraerógenes Maltosa 0.46 149.2 1.03 1.50
Manitol 0.52 95.2 1.32 1.18
Fructosa 0.42 76.1 1.05 1.46
Glucosa 0.40 72.7 1.01 1.11
Candida utilis Glucosa 0.51 91.8 1.28 1.32
Penicillium chrysogenum glucosa 0.43 77.4 1.08 1.35
Pseudomonas fluorescens glucosa 0.38 68.4 0.95 0.85
Rhodopseudomonas spheroides glucosa 0.45 81.0 1.12 1.46
Saccharomyces cerevisiae Glucosa 0.50 90.0 1.25 0.97
Enterobacter aerógenes Ribosa 0.35 53.2 0.88 0.98
Succinato 0.25 29.7 0.62 0.62
Glycerol 0.45 41.8 1.16 0.97
Lactato 0.18 16.6 0.46 0.37
Piruvato 0.20 17.9 0.49 0.48
Acetato 0.18 10.5 0.43 0.31

Coeficientes para m.o aerobios
Organismo Sustrato Yx/s Yx/o2

g/g g/mol g/g g/mol

Cándida utilis Acetato 0.36 21.0 0.90 0.70

Pseudomonas fluorescens Acetato 0.28 16.8 0.70 0.46

Cándida utilis Etanol 0.68 31.2 1.30 0.61

Pseudomonas fluorescens Etanol 0.49 22.5 0.93 0.42

Klesbiella sp. Metanol 0.38 12.2 1.01 0.56

Metylomonas sp. Metanol 0.48 15.4 1.28 0.53

Pseudomonas sp. Metanol 0.41 13.1 1.09 0.44

Metyloccocus sp. Metano 1.01 16.2 1.34 0.29

Pseudomonas sp. Metano 0.80 12.8 1.06 0.20

Metanol 0.60 9.60 0.80 0.19

Pseudomonas metánica Metano 0.56 9.00 0.75 0.17

e. Coeficiente de mantenimiento (m).

• Se le usa para describir la relación de sustrato
usado para el mantenimiento celular.

MODELOS CINETICOS
Modelos no estructurados. Son modelos
aproximados.
Modelo de Monod,
Modelo de Contois,
Modelo de Mosser,
Modelos estructurados. Estos modelos tienen una
capacidad predictiva mucho mas grande y para
ello tienen en cuenta las interacciones cinéticas
entre los componentes celulares y los
componentes del medio.

Modelo de Monod

S = Concentración del sustrato limitante
μm = Es la velocidad de crecimiento específica máxima
Ks = Constante de saturación
Está inversamente relacionada con la afinidad del microorganismo por el sustrato.
Cuando S > > Ks, μ toma el valor de μm y rx sólo depende de x.
En general Ks tiene valores muy bajos, del orden de los mgl-1 por tanto
concentraciones relativamente bajos de S son suficientes para hacer que μ = μmáx.
En promedio:
Las bacterias poseen valores de μm cercanos a…… 0.9 h-1
Las levaduras…………………………………… 0.45 h-1
Los hongos filamentosos……………………… 0.25 h-1

Modelo de Contois

La ecuación de Contois muestra una dependencia de
la tasa específica de la reacción con respecto a la
concentración de organismos activos presentes.

m S
K sx x [S ]

Ejemplo
• Una cadena de microorganismos estuvo en un cultivo BATCH en
crecimiento, en sustrato de glucosa y los siguientes datos fueron
obtenidos.
TIEMPO CONC. CELULAS (X) ln X CONC. GLUCOSA
(h) (g/l) (g/l)

0 1.25 0.2231 100.00

9 2.45 0.8961 97.00

16 5.10 1.6292 90.40

23 10.50 2.3514 76.90

30 22.00 3.0910 48.10

34 33.00 3.4965 20.60

36 37.50 3.6243 9.38

40 41.00 3.7136 0.63

• a) Calcular la velocidad máxima de crecimiento.
• b) Calcular la variación de sustrato
• c) Cuál es la concentración celular máxima que podría esperarse si 150g de
glucosa fueron usados con la misma cantidad de inoculo.

Rpta. a)

ln X

ln X

t t (h)

y ln X ln 37.5 ln 5.1 1
tg m m 0.1 h
x t 36 16
b) Rpta.
Calcular la variación de sustrato por el crecimiento celular.

X celuar Rango de Conc. Celular
y
S sustrato Rango de Conc. Sustrato
41 1.25
y 0.40 gr de células / gr de sustrato
0.63 100
c) Rpta. X m ax X0 Y .S 0
X m ax 1.25 0.4(150)
g células
X m ax 60.25
lt

Modelo logistico
• Los modelos cinéticos descritos anteriormente
representan el comportamiento de los
microorganismos pero sólo en la fase de crecimiento
exponencial de un cultivo batch (donde es
constante), pero si se quiere representar todo el
proceso del cultivo batch, es necesario recurrir al
modelo logístico.
• Este modelo es capaz de arrojar una curva sigmoidal, y
se le obtiene combinando la ecuación de Monod con la
expresión de la tasa de crecimiento y la ecuación de
rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s).

dX = m(Yx/s.So + Xo – X) . X
dt (Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)

Modelos estructurados.
• Un problema importante al construir un modelo de este tipo es
decidir cuantos componentes celulares deben tomarse en cuenta.
• Hay modelos que consideran dos componentes y otros que
consideran hasta cuarenta componentes. Un resultado aceptable se
puede producir usando por lo menos 3 componentes celulares, sin
embargo, mientras mas componentes se consideren el modelo será
mas preciso, pero también mas complejo.
• En estos modelos es necesario considerar dos factores nuevos: las
concentraciones intrínsecas, que se refieren a la cantidad de un
componente por unidad de masa celular (Ci/X), y las concentraciones
extrínsecas o cantidad de un componente por unidad de volumen del
reactor.

d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt)
dt X.dt X. X

• donde: Ci, es la concentración de cada componente considerado.

• Cuando existe más de un substrato limitante se pueden
usar otros modelos conocidos como modelos
multiplicativos, modelos aditivos y modelos nominativos
• Son desarrollados con amplitud en el libro de Shuler-
Kargi.
• El modelo aditivo toma la siguiente forma:
• = W1. S1 + W2. S2 + ........... + Wn. Sn
• max

• donde W1, W2, ..., Wn son funciones del peso, y sigue
la cinética de Monod.

• Existen modelos desarrollados para cinéticas del
crecimiento en presencia de inhibidores y para
organismos filamentosos

MEDICION DEL CRECIMIENTO
MICROBIANO

TECNICAS DE MEDICION
• Diversos métodos de cuantificación celular
Se pueden agrupar en dos grandes categorías:
– métodos directos y
– los métodos indirectos.
• Los directos obtienen una medida directa de la masa
celular.
- que miden la densidad numérica de las células: técnicas de
conteo,
- que miden la concentración de masa celular: peso celular, y
absorbancia de luz.
• Los métodos indirectos miden la concentración de algún
componente celular (ADN, proteínas, etc) y establecen
una relación entre tal compuesto y las células.

a. Conteo celular
• Se basan en contar directamente en un microscopio las
células, determinando la masa celular por unidad de volumen,
con ese fin se colocan muestras del cultivo adecuadamente
diluidas en porta-objetos y se procede a contar las células en
un microscopio.
• Para facilitar esta labor existen diversos accesorios que hacen
menos tedioso el conteo:
– Cámaras de Neubauer,
– Cámara de Petroff-Hausser,
– el hemocitómetro
– los microscopios graduados como de Helber.
• En ellos se cuenta con rejillas calibradas, de modo que se
pueda contar el número de células por cada uno de los
cuadrantes de la rejilla, que luego se puede multiplicar por el
total de cuadrantes, y por las veces que se diluyó la muestra
para obtener la densidad celular.

Cámaras de recuento
• Identificación

• En las dos superficies laterales, sin trabajar, de la
cámara de conteo están impresas las siguientes
indicaciones:

• El sistema de la red de conteo
• El nombre y la marca registrada del fabricante
• La profundidad de la cámara en milímetros
• La superficie del cuadrado más pequeño en mm2

• Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de
campo claro o al de contraste de fases.
• Se trata de un portaobjetos con una depresión en el
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve
en la imagen.
• Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre
dos lineas consecutivas de 0.25 mm.
• Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a
1 milimetro cuadrado.
• La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1
mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie
marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido
entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro

El gran cuadrado en el centro está
adicionalmente dividido en 5
Cámara de Neubauer
cuadrados en grupos de 5 con una
longitud lateral de 0,2 mm,
respectivamente, y un contenido de
superficie de 0,04 mm2. A su vez, los
cuadrados de los grupos están
subdivididos en 16 cuadrados
pequeños de 0,0025 mm2 cada uno.
Si contamos las cuatro áreas
sombreada (L) observando un total
de x células entre las cuatro áreas, la
concentración en la suspensión
celular será :
concentración en la suspensión
(células / mL) = 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el
aspecto de una de las regiones
marcadas como L y que en el
microscopio se ven como una
cuadrícula de 16 pequeños
cuadrados de 0.25 milímetros de
lado.

Cámara de Neubauer
• Técnica de conteo
•
El recuento presupone un conocimiento exacto de las líneas límite
de las cámaras de conteo utilizadas. Éstas se pueden ver en la
ilustración.
Para que las células, que están en o cerca de las líneas de
limitación, no se cuenten dos veces o se sobrepasen en el conteo,
hay que atenerse a determinadas reglas.
Se cuentan todas las células dentro de una zona de medición
definida.
También se cuentan las células (marcadas en negro), que se
apoyan o tocan en las 2 caras , p.ej. en la línea de medida
izquierda y superior.
Esto también es válido para el tipo de la operación de conteo
propiamente dicha, que debe efectuarse en forma de meandro.

Cámara de Neubauer
• Observaciones sobre el recuento
•
a) En todos los conteos de cámaras, el diafragma del condensador en el
microscopio deberá estar cerrado en gran parte.
b) La diferencia de las células contadas en los cuadrados grandes y en los
cuadrados de grupos no podrá ser superior a 10 células.
c) En todos los conteos de células, han de realizarse dobles determinaciones.
Después del recuento de la red de conteo superior, se recuenta como control
también la red de conteo inferior. Ha de tenerse en cuenta que la cámara no
esté resecada. Esto puede evitarse cuando la cámara inferior se llene justo
poco antes del recuento y se recuente después del tiempo de sedimentación.
d) El valor medio de los conteos se aplica luego en una fórmula de cálculo o se
multiplica por el factor correspondiente.

b) Equipos automáticos de contaje celular
• Existen nuevos instrumentos con contadores automáticos que por
ejemplo usan la alta resistencia eléctrica de las células para contarlas
por pulsos de resistencia
• "Cell Coulter" de Beckman-Coulter
• El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios
en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no
conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño
orificio.
• Una pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a
través de la que pasan las partículas que se encuentran en
suspensión.
• Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio
volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un
pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen
de la partícula.
• controlando la cantidad de la suspensión que circula a través del
orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas.
• Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo,
independientemente de su forma, color y densidad.

c.- Conteo en placas.
• En los métodos anteriores se determina el número de células totales, pero
en muchos casos únicamente interesa contar células viables.
• Se define como célula viable, aquella célula que es capaz de dividirse y
formar una progenie y la manera usual para realizar un recuento de células
viables es determinando el número de células en la muestra, capaces de
formar colonias sobre un medio de cultivo sólido (agar) y esto se conoce
como recuento en placa.
• se puede hacer el conteo usando Placas Petri con un medio en agar-agar.
• Se diluye varias veces la muestra líquida y luego se esparce sobre la
superficie sólida 0.1 ml. de la muestra, incubando hasta que transcurran
unas 25 generaciones, luego de lo cual cada célula dará lugar a colonias, las
cuales pueden ser observadas a simple vista y contadas como tales.
• Diseminación en placa (siembra en placa por extensión).- Se asume que
cada colonia surgió de una simple célula, contando el número de colonias
uno puede calcular el número de células viables en la muestra
• Este método tiene la desventaja de ser muy largo, pues suele requerir unas
24 horas de incubación, y exigir muy buenas técnicas de
esterilización, además puede dar errores cuando se trata de células
agregadas en cuyo caso una colonia no será necesariamente producida por
una célula individual.

Medidas directas del crecimiento bacteriano.

1. Recuento de células totales.
- Microscopia -
2. Recuento de celulas viables.
- Recuento de colonias -

Conteo en placas.
• Se asume que cada colonia proviene de la división sucesiva de
una sola célula, conociendo el volumen sembrado y la dilución de
la cual proviene y contando el número de colonias en la placa
correspondiente se puede calcular el número de células viables
en la muestra
• Debido a que es difícil saber si una sola bacteria dio origen a una
colonia, se expresa usualmente el número de células viables
como unidades formadoras de colonias (UFC).
• Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que
contengan entre 25 y 250 colonias.
• A pesar de las deficiencias que pueda presentar la técnica del
recuento en placas, se usa frecuentemente, y con resultados
satisfactorios, para la estimación de las poblaciones bacterianas
en la leche, agua, y otros productos.
• Es fácil de realizar y se adapta a la medición de poblaciones de
cualquier densidad.

SIEMBRA POR EXTENSION Y VERTIDO EN PLACA

Recuento en filtro de nitrocelulosa

Número mas probable (NMP)
utilizado para microrganismos que no crecen bien en medio sólido.

A) dilución a partir de un alto volumen de inóculo (ex. 10 mL)
•
B) dilución a partir de un volumen medio de inóculo (ex. 1 mL)
•
c) dilución a partir de un bajo volumen de inóculo (ex. 0,1 mL)
•
d) contage de nº de tubos positivos
•
e) estimativa de nº de células/mL de bactérias

Número mas probable (NMP)

10 mL de inóculo
6 tubos positivos (com
crescimento bacteriano)

1 mL de inóculo 3 tubos positivos

1 tubos positivos
0,1 mL de inóculo

d. Peso seco.
• método mas comúnmente usado para la determinación de la concentración
celular, y consiste en secar volúmenes conocidos de medio de cultivo con las
células en crecimiento, hasta obtener un peso constante, expresando la
concentración en g/l.

• Cuando se trata de células de levadura que pueden ser fácilmente
centrifugadas se puede usar una centrífuga con velocidades de 4-6x103rpm
con lo cual se logra obtener una masa húmeda de células, luego esta masa se
lava y seca a 80ºC por 24 horas, para proceder a pesar en un portaobjetos
debidamente destarado.

• Cuando se trata de células bacterianas difíciles de centrifugar se usan filtros de
membranas (ultrafiltros) para obtener la masa celular húmeda, y luego se
procede a secar, como en el caso anterior.

• Esta técnica sólo puede ser usada cuando el medio no contiene sólidos en
suspensión como es el caso de: melazas, celulosa, o licor de maíz.

• Sin embargo, en estos casos se puede intentar corregir el peso final para
considerar la fracción que corresponde a los sólidos del medio. Adicionalmente
el método presenta la desventaja de requerir muestras muy grandes y de ser
sumamente lentos.

e. Absorción de luz.
• En esta técnica se aprovecha la particularidad de las células para desviar la
luz de una celda espectrofotométrica.

• Se puede usar un turbidímetro o un espectrofotómetro para medir la
densidad óptica (OD) a 600- 700 nm de longitud de onda.

• En este caso las células se comportan como simples partículas en
suspensión con capacidad para desviar y absorber la luz.

• En cualquier caso tal efecto sobre el haz incidente de luz será proporcional a
la concentración de células presentes en el cultivo de acuerdo con la ley de
Beer.

• Debe tenerse en cuenta para estos casos que existen algunos factores como;
el tamaño, la forma y el color de las células que pueden variar la relación
entre la absorbancia y el número de células, asimismo, si se usa un tinte
para observar las células viables, el color afectará los resultados.

• Valores altos de OD (mayores a 0.3) afectarán la linealidad en la respuesta.

• Este método es apropiado para medios libres de partículas en suspensión.

Medidas indirectas del crecimiento
bacteriano
• Turbidez. Es un método muy rápido y útil de
medir el crecimiento bacteriano.
- fotómetro -
- espectrofotómetro -

d. Masa de un componente celular.
• Cuando es difícil usar alguno de los métodos
anteriores se puede usar la medida de algún
componente celular que sea parte constante del
peso seco total de las células, entonces se cuantifica
por algún método analítico, el componente
escogido, con lo cual se tendrá una estimación
indirecta de la biomasa presente.

• Tales componentes suelen ser: proteínas,
nitrógeno, ADN, RNA, y ATP celulares, los cuales
están presentes en cantidades mas o menos
constantes por especie.

e. Efectos físicos.

• Se puede también medir la variación
de algún factor externo por efecto
del crecimiento celular, tales como;
el calor generado por el
crecimiento, o el oxígeno captado
por el medio, y que deja un vacío
medible. técnicas son rápidas y
efectivas pero sólo son útiles para
grandes

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