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A chaperona ClpB/HSP104 de Trypanosoma cruzi



        Roberta Alvares Campos

        Turán Péter Ürményi

        Lab. Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro

        Programa de Biologia Molecular e Estrutural

        IBCCF/UFRJ
O modelo de estudo Trypanosoma cruzi

                                                                                        Tripanossomatídeos
                                         Protozoário flagelado
                                              Agente Etiológico                            Trypanosoma cruzi (CL Brener)
                                          da Doença de Chagas                              The TIGR Genome Project - Julho de 2003
                                                                                           T. cruzi (Esmeraldo) - J. Craig Venter Institute
                                                                                           Afeta 18 milhões de pessoas em 21 países.
                                                Organismo Eucarioto
                                                     unicelular
                                                                                                             Trypanosoma brucei
                                                  Ordem: Kinetoplastida                                Agente Etiológico Doença do Sono




                                                  - Mitocôndria única e alongada.                             Leischmania sp.
                                                 - organelas especializadas, ricas em
                                                       kDNA = cinetoplastos.                                      Leishmaniose.
                                                                                           Doenças Extremamene Negligenciadas, segundo a OMS.


Forma Epimastigota. (Docampo et al., 1975).
Doenças Globais:
Doenças crônicas como o câncer, doenças cardiovasculares, distúrbios neurológicos e a AIDS.

Doenças Negligenciadas:
Como a malária, provocam um interesse “marginal” na indústria farmacêutica.

Doenças Extremamente Negligenciadas:
Doença do sono, Chagas e Leishmaniose, afetam populações de extrema pobreza.
                                    Fonte: DNDi – Drugs for Neglected Diseases 2007 (http://www.dndi.org.br/)
A Doença de Chagas

        Vetorial         Transfusão                           Via oral
                                          Transplantes                           Acidentes
        silvestre       sanguínea ou
                        Congênita, da
                                            de órgãos       leite materno
      domiciliar ou                                                         em laboratórios
                        mãe para feto.     infectados        ou alimentos
      peridomiciliar




                       O Ciclo de vida do T. cruzi. (Modificado do CDC, 2009).
As peculiaridades moleculares do T. cruzi




      Organismos evolutivamente antigos


      Transcrição multigênica


      Trans-splicing


      Regulação gênica pós-transcricional


      Mecanismos de resposta ao estresse diferenciado
Estresse no ciclo biológico do T. cruzi




Hospedeiro mamífero

Baixo pH
Enzimas proteolíticas
Produtos oxidativos

Temperatura = 37⁰




  Pontos potenciais de estímulos de stress no ciclo biológico do T. cruzi. Rondinelli, E. 1994.
Estresse & desnaturação protéica
As Chaperonas moleculares e sua importância




Proteínas
imunogênicas
Clp/HSP100




 ATPases - Superfamília de Proteínas AAA+ Clp/HSP100

 Controle de qualidade de enovelamento protéico




 ClpB/HSP104


 ClpA (ClpP, ClpS, ClpX, ClpQ)
Funções da proteína ClpB/HSP104




LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.
Estrutura da proteína Clp/HSP104




LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.
Resultados anteriores com expressão de HSPs em
  tripanossomatídeos
 29   37    40




                         103 kDa

                         92
                                                        GIAMBIAGI DE-MARVAL et al., 1996.
                         75
                         61




CARVALHO et al., 1990.             CLOS et al., 1995.
OBJETIVOS



I.   Caracterizar a estrutura gênica de ClpB/HSP104 de T. cruzi.



II. Investigar a expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque
    térmico.



III. Propor a estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104 por
     modelagem molecular.
ESTRUTURA GÊNICA
Busca da sequência do gene ALVO clpb/hsp104 de
                     T. cruzi



                           Tc00.104705350 HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (pseudogene), putative, serine peptidase (pseudogene),
   T. cruzi    CDS
                           6821.20        putative, 7106.t00002

                           Tc00.104705350
   T. cruzi    CDS                        pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7179.t00009
                           7027.59

                           Tc00.104705350
   T. cruzi    CDS                        ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (HSP100)(pseudogene), putative, 7023.t00008
                           6617.90

                           Tc00.104705350
   T. cruzi    CDS                        HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 8007.t00002
                           9125.20

                           Tc00.104705350
   T. cruzi    CDS                        heat shock protein 100 (clp protein), putative, 7649.t00006
                           8233.60

                           Tc00.104705351
   T. cruzi    CDS                        ATP-dependent Clp protease subunit heat shock protein 100 (HSP100), putative, 8599.t00005
                           1107.41

                           Tc00.104705350
   T. cruzi    CDS                        pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7147.t00033
                           6941.229

                           Tc00.104705350
   T. cruzi    CDS                        HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 7851.t00010
                           8737.100

                           Tc00.104705350
   T. cruzi    CDS                        HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100, putative, serine peptidase, putative, 5618.t00001
                           8807.10

GeneID: 3532962 Locus tag: Tc00.1047053508665.14 100 (HSP100), putative, 7820.t00005
  T. cruzi CDS
                Tc00.104705350
                8665.14
                               ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein Protein: EAN81877

                           Tc00.104705350 HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78 (pseudogene), putative, serine peptidase, putative,
   T. cruzi    CDS
                           9127.10        8008.t00001

                                                                                                                                                    Agosto 2005
Sequência incompleta do gene ClpB/HSP104 de T. cruzi, no
banco dados do TcruziDB
Estratégia de mapeamento do terço final de Clp/HSP100
Obtenção da sequência completa do gene ClpB/HSP104


                         GAP previsto de 33 pares de bases


                          Região Codificante total do Gene
                          ClpB/HSP104 = 2604 pb
                          Proteína de 868 Aa




                       200 pb
Sequência completa de aminoácidos de ClpB/HSP104 em T.
    cruzi




Identidade de 71,9%
Alinhamento de sequências de Clp/HSP100
Análise filogenética preliminar da Proteína ClpB/HSP104




Modelo radial com calculo da distância genética Jukes-Cantor e Método de construção por Neighbor-Joining.
Obtenção de sonda molecular do gene clpB/hsp104
de T. cruzi




                             980 pb
Análise por padrão de fragmentos genômicos de
clpb/hsp104




               Não-dig.




                                                       Eco0109




                                                                                Hind III

                                                                                           BamHI
                          EcoRI




                                                                        HinfI
                                         XhoI




                                                                 XbaI
                                  PstI



                                                SalI
       5 kb




       2 kb
Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104
Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104
EXPRESSÃO GÊNICA
Expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico




       29°C           37°C             4o°C




         Extrato
                                          RNA Total
         Protéico




SDS-PAGE        2D-IEF              Northern          qRT-PCR
Western blot    Immunobloting       blot
Indução do mRNA ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico
Indução da Proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi em resposta ao
choque térmico




M   29°   37/3 37/6   37/24 40/3   37/6 h   29° 37/3 37/6 37/24 40/3   37/6 horas
Otimização das condições de amostras para 2D-IEF
Isoformas de ClpB/HSP104 de T. cruzi em diferentes temperaturas


150

100

75

50

37



15



      29



                  250

                  150
                  100

                  75



                  50

                  37



                  15



                         29
                         A                          37
                                                    B
MODELAGEM MOLECULAR
Utilização da Modelagem molecular



 Discriminação entre as subfamilias das
  Clps/HSP100.


 Procura por domínios conservados.


 Características estruturais podem ser úteis
 para predizer funções.


 A caracterização estrutural pode nos guiar ao
 estudo de peptídeos candidatos para
 diagnóstico de doença de Chagas.
Construção do modelo tridimensional da proteína
ClpB/HSP104 de T. cruzi por Modelagem Comparativa




  Explora similaridades estruturais entre PTNs

  Pressupõe regiões de conservação evolutiva entre PTNs

  Depende de um molde disponível no banco (PDB)


   Construção do modelo tridimensional da proteína


  Análise e validação do modelo gerado
Escolha do Molde/Template no PDB



              Domínios Conservados – NCBI conserved domain




 Moldes disponíveis no banco de dados - PDB

Proteína    Organismo        ID PDB    Identidade     Similaridade    Cobertura

 ClpB      T. thermophilus   1QVR     53% (457/858)   72% (613/858)    98,84%

 ClpA          E. coli       1KSF     43% (150/347)   61% (215/347)    39,94%

 ClpB          E. coli       1JBK     66% (128/192)   84% (162/192)    22,11%

 ClpB       P. falciparum    2P6S     62% (116/187)   81% (152/187)    21,54%

 ClpB       S. cerevisiae    2QR9     27% (56/204)    46% (94/204)     23,50%
Modelo tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi




 Modelo “868” construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi
 com o programa Modeller e visualizados com Pymol (WARREN, 2004).
 É um monômero que constitui a sexta parte do hexâmero da proteína.
Validação do modelo tridimensional proposto da proteína
 ClpB/HSP104 de T. cruzi


Análises utilizando o programa MODELLER:
Todos os 300 modelos obtiveram GA341 = 1.0 indicando a boa escolha do molde
(template) pelo usuário
Os 300 modelos foram ranqueados segundo o Discrete Optimized Protein Energy (DOPE)
quanto menor o DOPE, maior a acurácia do modelo.



Análise utilizando o programa
PROCHECK:
Os 300 modelos foram
ranqueados segundo o Gráfico
de Ramachandran.



Gráfico de Ramachandran

 regiões muito favoráveis – 91.3%,
regiões favoráveis – 7.3%,
generosamente permitidas – 1.2% ,
regiões desfavoráveis – 0.3%
Comparação estrutural T. thermophilus X T. cruzi construído
por modelagem molecular




(A) TClpB104 de T. thermophilus com os principais domínios estruturais da proteína (LEE et al., 2003).

(B) Modelo do monômero construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi.
    Em laranja = L1, em marinho = L2, em rosa = L3, em azul claro = L4.
    Os 2 monômeros foram colocados em eixos semelhantes para esta comparação.
    Programa Pymol (Yao & Warren, 2004).
Estudo de peptídeos candidatos da chaperona ClpB/HSP104 de T.
cruzi para diagnóstico da doença de Chagas




(A) Modelo “868” de ClpB/HSP104 de T. cruzi (verde) fitado com o modelo de ClpP Humana (1TG6).
(B) Modelos fitados com detalhes para os 2 peptídeos propostos para futuros alvos de diagnóstico.
Conclusões



Foi obtida a sequência completa do gene clpb/hsp104 de T. cruzi que dá origem a
 uma proteína de 868 aminoácidos, com identidade de 71,9% quando comparados
 aos genes ortólogos dos demais tripanossomatídeos.

Análises de Southern blot sugerem que o gene clpB/hsp104 está presente no
 genoma de T. cruzi em cópia única.

Análises do teor relativo do mRNA mostraram que ocorre indução dos níveis de
 mRNAs clpB/hsp104 de T. cruzi após o choque térmico, com um aumento de 4
 vezes a 37 ºC e de 2 vezes a 40ºC.

Análises de indução por choque térmico com a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi,
 mostraram que ela está presente tanto na temperatura normal de cultivo 29ºC,
 como em choque térmico, levando a um acúmulo da proteína à 37 ºC quanto a à
 40ºC, sendo mais evidente ao final de 24 horas de incubação à 37 ºC.
Conclusões




A proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi está presente em uma única
isoforma à 29ºC com pI aproximado de 6.5, e o número de
isoformas parece aumentar com o choque térmico a 37ºC.


Foi proposta uma estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104
de T. cruzi por modelagem molecular de boa qualidade e que definiu
que a proteína de T. cruzi é uma ClpB/HSP104.
RAC - Tese 24/07/2009




Perspectivas




-Mapeamento do tamanho e da meia vida do mensageiro de
ClpB/HSP104 utilizando RNA Poly A+


-Análises proteômicas dos spots encontrados dos géis 2D-IEF em
MALDI-TOF.


- Estudo detalhado dos 2 peptídeos funcionais propostos neste
trabalho, ligados a uma molécula de avidina no N-terminal para
ensaios de captura em placas de Elisa para testes de
imunogenicidade da proteína contra soros Chagásicos.
RAC - Tese 24/07/2009




Agradecimentos especial as colaborações




 Proteômica 2D-IEF
 Lab. de Diagnóstico de Doenças Infecciosas
 Líder: José Mauro Peralta
 Giovani Veríssimo
 Inst. de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/UFRJ


 Modelagem molecular
 Lab. de Física Biológica
 Líder: Paulo Bisch
 Manuela Leal
 IBCCF/UFRJ
MUITO OBRIGADO!

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Presentation TESE BIOF UFRJ 2009

  • 1. A chaperona ClpB/HSP104 de Trypanosoma cruzi Roberta Alvares Campos Turán Péter Ürményi Lab. Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro Programa de Biologia Molecular e Estrutural IBCCF/UFRJ
  • 2. O modelo de estudo Trypanosoma cruzi Tripanossomatídeos Protozoário flagelado Agente Etiológico Trypanosoma cruzi (CL Brener) da Doença de Chagas The TIGR Genome Project - Julho de 2003 T. cruzi (Esmeraldo) - J. Craig Venter Institute Afeta 18 milhões de pessoas em 21 países. Organismo Eucarioto unicelular Trypanosoma brucei Ordem: Kinetoplastida Agente Etiológico Doença do Sono - Mitocôndria única e alongada. Leischmania sp. - organelas especializadas, ricas em kDNA = cinetoplastos. Leishmaniose. Doenças Extremamene Negligenciadas, segundo a OMS. Forma Epimastigota. (Docampo et al., 1975).
  • 3. Doenças Globais: Doenças crônicas como o câncer, doenças cardiovasculares, distúrbios neurológicos e a AIDS. Doenças Negligenciadas: Como a malária, provocam um interesse “marginal” na indústria farmacêutica. Doenças Extremamente Negligenciadas: Doença do sono, Chagas e Leishmaniose, afetam populações de extrema pobreza. Fonte: DNDi – Drugs for Neglected Diseases 2007 (http://www.dndi.org.br/)
  • 4. A Doença de Chagas Vetorial Transfusão Via oral Transplantes Acidentes silvestre sanguínea ou Congênita, da de órgãos leite materno domiciliar ou em laboratórios mãe para feto. infectados ou alimentos peridomiciliar O Ciclo de vida do T. cruzi. (Modificado do CDC, 2009).
  • 5. As peculiaridades moleculares do T. cruzi Organismos evolutivamente antigos Transcrição multigênica Trans-splicing Regulação gênica pós-transcricional Mecanismos de resposta ao estresse diferenciado
  • 6. Estresse no ciclo biológico do T. cruzi Hospedeiro mamífero Baixo pH Enzimas proteolíticas Produtos oxidativos Temperatura = 37⁰ Pontos potenciais de estímulos de stress no ciclo biológico do T. cruzi. Rondinelli, E. 1994.
  • 8. As Chaperonas moleculares e sua importância Proteínas imunogênicas
  • 9. Clp/HSP100 ATPases - Superfamília de Proteínas AAA+ Clp/HSP100 Controle de qualidade de enovelamento protéico ClpB/HSP104 ClpA (ClpP, ClpS, ClpX, ClpQ)
  • 10. Funções da proteína ClpB/HSP104 LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.
  • 11. Estrutura da proteína Clp/HSP104 LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.
  • 12. Resultados anteriores com expressão de HSPs em tripanossomatídeos 29 37 40 103 kDa 92 GIAMBIAGI DE-MARVAL et al., 1996. 75 61 CARVALHO et al., 1990. CLOS et al., 1995.
  • 13. OBJETIVOS I. Caracterizar a estrutura gênica de ClpB/HSP104 de T. cruzi. II. Investigar a expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico. III. Propor a estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104 por modelagem molecular.
  • 15. Busca da sequência do gene ALVO clpb/hsp104 de T. cruzi Tc00.104705350 HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (pseudogene), putative, serine peptidase (pseudogene), T. cruzi CDS 6821.20 putative, 7106.t00002 Tc00.104705350 T. cruzi CDS pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7179.t00009 7027.59 Tc00.104705350 T. cruzi CDS ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (HSP100)(pseudogene), putative, 7023.t00008 6617.90 Tc00.104705350 T. cruzi CDS HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 8007.t00002 9125.20 Tc00.104705350 T. cruzi CDS heat shock protein 100 (clp protein), putative, 7649.t00006 8233.60 Tc00.104705351 T. cruzi CDS ATP-dependent Clp protease subunit heat shock protein 100 (HSP100), putative, 8599.t00005 1107.41 Tc00.104705350 T. cruzi CDS pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7147.t00033 6941.229 Tc00.104705350 T. cruzi CDS HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 7851.t00010 8737.100 Tc00.104705350 T. cruzi CDS HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100, putative, serine peptidase, putative, 5618.t00001 8807.10 GeneID: 3532962 Locus tag: Tc00.1047053508665.14 100 (HSP100), putative, 7820.t00005 T. cruzi CDS Tc00.104705350 8665.14 ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein Protein: EAN81877 Tc00.104705350 HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78 (pseudogene), putative, serine peptidase, putative, T. cruzi CDS 9127.10 8008.t00001 Agosto 2005
  • 16. Sequência incompleta do gene ClpB/HSP104 de T. cruzi, no banco dados do TcruziDB
  • 17. Estratégia de mapeamento do terço final de Clp/HSP100
  • 18. Obtenção da sequência completa do gene ClpB/HSP104 GAP previsto de 33 pares de bases Região Codificante total do Gene ClpB/HSP104 = 2604 pb Proteína de 868 Aa 200 pb
  • 19. Sequência completa de aminoácidos de ClpB/HSP104 em T. cruzi Identidade de 71,9%
  • 20. Alinhamento de sequências de Clp/HSP100
  • 21. Análise filogenética preliminar da Proteína ClpB/HSP104 Modelo radial com calculo da distância genética Jukes-Cantor e Método de construção por Neighbor-Joining.
  • 22. Obtenção de sonda molecular do gene clpB/hsp104 de T. cruzi 980 pb
  • 23. Análise por padrão de fragmentos genômicos de clpb/hsp104 Não-dig. Eco0109 Hind III BamHI EcoRI HinfI XhoI XbaI PstI SalI 5 kb 2 kb
  • 24. Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104
  • 25. Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104
  • 27. Expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico 29°C 37°C 4o°C Extrato RNA Total Protéico SDS-PAGE 2D-IEF Northern qRT-PCR Western blot Immunobloting blot
  • 28. Indução do mRNA ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico
  • 29. Indução da Proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi em resposta ao choque térmico M 29° 37/3 37/6 37/24 40/3 37/6 h 29° 37/3 37/6 37/24 40/3 37/6 horas
  • 30. Otimização das condições de amostras para 2D-IEF
  • 31. Isoformas de ClpB/HSP104 de T. cruzi em diferentes temperaturas 150 100 75 50 37 15 29 250 150 100 75 50 37 15 29 A 37 B
  • 33. Utilização da Modelagem molecular  Discriminação entre as subfamilias das Clps/HSP100.  Procura por domínios conservados.  Características estruturais podem ser úteis para predizer funções.  A caracterização estrutural pode nos guiar ao estudo de peptídeos candidatos para diagnóstico de doença de Chagas.
  • 34. Construção do modelo tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi por Modelagem Comparativa Explora similaridades estruturais entre PTNs Pressupõe regiões de conservação evolutiva entre PTNs Depende de um molde disponível no banco (PDB) Construção do modelo tridimensional da proteína Análise e validação do modelo gerado
  • 35. Escolha do Molde/Template no PDB Domínios Conservados – NCBI conserved domain Moldes disponíveis no banco de dados - PDB Proteína Organismo ID PDB Identidade Similaridade Cobertura ClpB T. thermophilus 1QVR 53% (457/858) 72% (613/858) 98,84% ClpA E. coli 1KSF 43% (150/347) 61% (215/347) 39,94% ClpB E. coli 1JBK 66% (128/192) 84% (162/192) 22,11% ClpB P. falciparum 2P6S 62% (116/187) 81% (152/187) 21,54% ClpB S. cerevisiae 2QR9 27% (56/204) 46% (94/204) 23,50%
  • 36. Modelo tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi Modelo “868” construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi com o programa Modeller e visualizados com Pymol (WARREN, 2004). É um monômero que constitui a sexta parte do hexâmero da proteína.
  • 37. Validação do modelo tridimensional proposto da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi Análises utilizando o programa MODELLER: Todos os 300 modelos obtiveram GA341 = 1.0 indicando a boa escolha do molde (template) pelo usuário Os 300 modelos foram ranqueados segundo o Discrete Optimized Protein Energy (DOPE) quanto menor o DOPE, maior a acurácia do modelo. Análise utilizando o programa PROCHECK: Os 300 modelos foram ranqueados segundo o Gráfico de Ramachandran. Gráfico de Ramachandran  regiões muito favoráveis – 91.3%, regiões favoráveis – 7.3%, generosamente permitidas – 1.2% , regiões desfavoráveis – 0.3%
  • 38. Comparação estrutural T. thermophilus X T. cruzi construído por modelagem molecular (A) TClpB104 de T. thermophilus com os principais domínios estruturais da proteína (LEE et al., 2003). (B) Modelo do monômero construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi. Em laranja = L1, em marinho = L2, em rosa = L3, em azul claro = L4. Os 2 monômeros foram colocados em eixos semelhantes para esta comparação. Programa Pymol (Yao & Warren, 2004).
  • 39. Estudo de peptídeos candidatos da chaperona ClpB/HSP104 de T. cruzi para diagnóstico da doença de Chagas (A) Modelo “868” de ClpB/HSP104 de T. cruzi (verde) fitado com o modelo de ClpP Humana (1TG6). (B) Modelos fitados com detalhes para os 2 peptídeos propostos para futuros alvos de diagnóstico.
  • 40. Conclusões Foi obtida a sequência completa do gene clpb/hsp104 de T. cruzi que dá origem a uma proteína de 868 aminoácidos, com identidade de 71,9% quando comparados aos genes ortólogos dos demais tripanossomatídeos. Análises de Southern blot sugerem que o gene clpB/hsp104 está presente no genoma de T. cruzi em cópia única. Análises do teor relativo do mRNA mostraram que ocorre indução dos níveis de mRNAs clpB/hsp104 de T. cruzi após o choque térmico, com um aumento de 4 vezes a 37 ºC e de 2 vezes a 40ºC. Análises de indução por choque térmico com a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi, mostraram que ela está presente tanto na temperatura normal de cultivo 29ºC, como em choque térmico, levando a um acúmulo da proteína à 37 ºC quanto a à 40ºC, sendo mais evidente ao final de 24 horas de incubação à 37 ºC.
  • 41. Conclusões A proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi está presente em uma única isoforma à 29ºC com pI aproximado de 6.5, e o número de isoformas parece aumentar com o choque térmico a 37ºC. Foi proposta uma estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi por modelagem molecular de boa qualidade e que definiu que a proteína de T. cruzi é uma ClpB/HSP104.
  • 42. RAC - Tese 24/07/2009 Perspectivas -Mapeamento do tamanho e da meia vida do mensageiro de ClpB/HSP104 utilizando RNA Poly A+ -Análises proteômicas dos spots encontrados dos géis 2D-IEF em MALDI-TOF. - Estudo detalhado dos 2 peptídeos funcionais propostos neste trabalho, ligados a uma molécula de avidina no N-terminal para ensaios de captura em placas de Elisa para testes de imunogenicidade da proteína contra soros Chagásicos.
  • 43. RAC - Tese 24/07/2009 Agradecimentos especial as colaborações Proteômica 2D-IEF Lab. de Diagnóstico de Doenças Infecciosas Líder: José Mauro Peralta Giovani Veríssimo Inst. de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/UFRJ Modelagem molecular Lab. de Física Biológica Líder: Paulo Bisch Manuela Leal IBCCF/UFRJ