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REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228
Volume 18 - Número 2 - 2º Semestre 2018
MODELAGEM E DOCKING MOLECULAR DA GLUTATIONA S-TRANSFERASE
EPSILON 2 DE AEDES AEGYPTI
Izabela Cristina Pereira Campos1
; Rosilândia Silva de Almeida1
; Luana Camilla Cordeiro Braz1
;
Rafael Trindade Maia2
RESUMO
A dengue é uma das arboviroses mais preocupantes e é transmitida pelo mosquito Aedes aegypti.
Devido a isto, este vetor tem sido combatido há várias décadas no Brasil no mundo. O uso intenso e
indiscriminado de inseticidas químicos para o controle deste mosquito, bem como os inseticidas de
uso doméstico, veio ao longo dos anos selecionando populações resistentes. Um dos principais
mecanismo de resistência a inseticidas químicos é através da ação das glutationa S-transferases,
uma superfamília de enzimas responsáveis por reações de desintoxicação celular. Na classe epsilon
desta superfamília, a AaGSTE2 (Glutationa S-transferase epsilon 2 de Aedes aegypti) tem sido
associada com a resistência a inseticidas químicos, entre eles o DDT. No entanto, apesar de haver
sequências desta enzima disponíveis em bancos de dados a sua estrutura tridimensional não foi
elucidada. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi construir um modelo para esta enzima,
através do uso de técnica computacional, usando o método de modelagem por homologia. Foi usado
uma sequência de referência (molde) de uma GSTs classe Epsilon do Anopheles gambiae por
possuir um percentual de similaridade de 88%. Por conseguinte, foi realizado estudo de docking
molecular contra três compostos, DDT, Carbaril e CDNB. O modelo obtido apresentou ótima
qualidade estereoquímica, global e local sendo considerado um modelo confiável e estável. As
simulações de docking resultaram em complexos nos quais os ligantes situaram-se nos sítios de
catálise da enzima, o que representa uma evidência in silico de atividade contra estes compostos
pela AaGSTE2.
Palavras-chave: GST, atracamento molecular, dengue, modelagem comparativa.
MOLECULAR MODELLING AND DOCKING OF GLUTATHIONA S-TRANSFERASE
EPSILON 2 FROM AEDES AEGYPTI.
ABSTRACT
Dengue fever is one of the most important tropical disease and it is transmitted by Aedes aegypti
mosquito. Chemical insecticides had been used for many decades to control the mosquito and were
the reason of the emergence of resistant populations. A notable insecticide resistance activity is
performed by glutathione S-transferases (GSTs) enzymes. An epsilon class GST, the AaGSTE2,
had been associated with chemical insecticide. However, despite the primary AaGSTE2 sequence is
available, its 3D structure have not been solved. Then, the objectives of this study were to built and
validate a theoretical model for the AaGSTE2 and run molecular docking simulations against DDT,
carbaril and CDNB. The predicted model displayed good stereochemichal, global and local quality,
which means that the model is reliable and stable. Docking results showed complexes in which
these compounds bound to the catalytic site of the AaGSTE2. These results suggest that the enzyme
is capable to metabolize the DDT, Carbaril and CDNB.
Keywords: GST, molecular docking, dengue fever, comparative modelling.
80
1 INTRODUÇÃO
A dengue é uma doença infecciosa e
febril aguda causada por um vírus pertencente à
família Flaviviridae, do gênero Flavivírus
Caracteriza-se como uma doença reemergente,
tornando-se um dos principais problemas de
saúde pública mundialmente. Afeta de 50 a 100
milhões de pessoas por ano e é responsável pela
morte de mais de 22 mil pessoas,
principalmente entre crianças.
Tem ampla distribuição em áreas
tropicais, ocorrendo de forma endêmica e
eventualmente epidêmica. É transmitida por
mosquitos do gênero Aedes, principalmente
Aedes aegypti cuja distribuição e adaptação em
ambientes urbanos e peridomiciliares explica a
predominância da dengue em cidades (Pesaro et
al., 2007). O Aedes aegypti caracteriza-se como
um mosquito doméstico, antropofílico, com
atividade hematofágica diurna (Tauil, 2002).
Sendo assim, o homem o principal hospedeiro
vertebrado e fonte de alimentação.
Considerando que nenhuma vacina está
disponível para minimizar o impacto das
doenças, o Programa Nacional de Controle da
Dengue (PNCD) tem como uma das principais
estratégias o controle de Aedes aegypti baseado
quase que exclusivamente no uso de inseticidas
químicos (Paiva, 2013). Porém, o uso
indiscriminado de pesticidas tem levado ao
desenvolvimento contínuo da resistência. Hoje,
ela é a principal ameaça na prevenção e controle
de doenças (Oliveira, 2014). A resistência a
inseticidas pode ser pensada como um processo
de evolução acelerada de uma população que
responde a uma intensa pressão seletiva, com a
conseqüente sobrevivência dos indivíduos que
possuem alelos que conferem resistência. A
resistência é pré-adaptativa, resultado de
mutações fortuitas (Braga e Valle, 2007).
Diferentes mecanismos podem estar
envolvidos na redução da sensibilidade aos
inseticidas, a exemplo, a via metabólica. A
resistência por via metabólica é baseada na
metabolização acelerada de compostos químicos
por enzimas de detoxificação, como as
glutationa S-transferases (GSTs) (Paiva, 2013).
Por definição, as glutationa S-transferases ou
GSTs (Enzyme Comission Number (EC):
2.5.1.18) compreendem uma complexa e bem
distribuída superfamília de proteínas que
compõem o sistema de detoxificação de fase II,
envolvida no metabolismo de compostos
endógenos e exógenos em organismos
eucariotos. As enzimas GSTs possuem amplo
espectro de especificidade, sendo capazes de
metabolizar diversos componentes tóxicos
hidrofílicos e hidrofóbicos, tais como: drogas,
inseticidas e substratos tóxicos endógenos pela
catálise da conjugação da GSH ao centro
hidrofílico dos substratos (Oliveira, 2014).
Assim, tendo em vista que a enzima
glutationa s-transferase epsilon 2 (AaGSTE2)
ainda não tinha sua estrutura elucidada, mas sua
sequência primária está disponível no NCBI. O
presente trabalho teve como objetivo construir
um modelo tridimensional e válido para a
AaGSTE2. Através da técnica de modelagem
comparativa ou modelagem por homologia,
como assim também pode ser chamada. Onde,
esta técnica consiste na predição da proteína de
interesse (alvo), utilizando uma outra sequência
de uma outra proteína similar como referência
(também chamada de molde), sendo que esta
sequência molde tem que ter sua estrutura já
resolvida (elucidada). Posteriormente, também
foi realizado o docking molecular com alguns
inseticidas.
Um dos principais mecanismos de
resistência ocorre através das vias de
metabolização de inseticidas, em decorrência da
superexpressão de enzimas de detoxificação.
Uma das mais importantes famílias de enzimas
envolvidas com a resistência é a família de
proteínas das glutationa-S-transferase (GSTs),
enzimas que catalisam vários compostos
xenobióticos em produtos solúveis (Hayes,
2005). Em eucariontes, essa família gênica é
subdividida em três classes superiores: GSTs
citosólicas, GSTs microssomais (associadas às
membranas) e GSTs mitocondriais (Sheehan et
al., 2001). Em mosquitos, há presença apenas de
duas das três classes: as citosólicas e
microssomais, não sendo encontrada nenhuma
GST da classe mitocondrial em insetos até o
momento (Lumjuan et al., 2005).
As GSTs citosólicas são compostas de
duas subunidades, podendo ser homodiméricas
ou heterodiméricas. Cada subunidade apresenta
um sítio de ligação especifico para glutationa
(sitio G), próximo a um sítio eletrofílico não
específico (sítio H). O sítio G fica situado na
terminação N da proteína e é uma região
altamente conservada nas GSTs. Já os resíduos
do sítio H, que interagem com os substratos
hidrofóbicos, são encontrados na terminação C.
A diversidade no sítio H faz as GSTs
apresentarem diferentes especificidades em
relação aos substratos que metabolizam
(Mannervik e Danielson, 1988; et al., 1998). A
reação catalisada pelas GSTs consiste em
promover a conjugação do tripeptídeo glutationa
reduzida a um composto específico e
geralmente citotóxico, que ao ligar-se a tal
grupamento eletrofílico, passará do estado
reduzido para o estado oxidado, e formará um
composto mais solúvel e mais fácil de ser
excretado.
As GSTs classe Epsilon (GSTE)
constituem uma das classes citosólicas mais
importantes no papel de conferir resistência à
organoclorados e organofosforados, e
recentemente foi comprovado um papel na
resistência à piretróides em culicídeos, como
Anopheles culicifacies, An. stephensi e An.
fluviatilis. Estudos de modelagem e docking
molecular vêm sendo utilizados para se
desvendar o papel de proteínas detoxificadoras
na resistência a inseticidas, como Glutationa
transferases e monooxigenases (Chiu et al,
2008, Baudry et al, 2003).
Em um estudo Ayres et al. (2011)
caracterizaram seis membros da classe epsilon
em três diferentes espécies de Anopheles. Neste
trabalho foram feitos testes para detecção de
seleção positiva sobre estes genes e os autores
identificaram que o gene GSTE5 continha
códons que haviam sofrido efeito de seleção
positiva. Isto sugere que possivelmente, a
proteína codificada por este gene, pode estar
atuando em substratos diferentes da proteína
GSTE2, a qual se mostrou bem mais conservada
entre as diferentes espécies estudadas.
Em Aedes aegypti as sequencias da
classe epsilon já foram anotadas (Lunjuam et al,
2005) e encontram-se disponíveis em bases de
dados como genbank e vectorbase.
MODELAGEM POR HOMOLOGIA OU
MODELAGEM COMPARATIVA
Depois que uma estrutura homóloga
conhecida for identificada poderá ser modelada
utilizando-se uma variedade de procedimentos
denominados modelagem por homologia (Dias e
Taveira; 2011).
A modelagem por homologia é uma
metodologia adequada à predição de estruturas
tridimensionais de proteínas a partir da estrutura
cristalográfica de uma proteína homóloga com
identidade sequencial >30 % e boa resolução.
Esta técnica computacional baseia-se nas
observações empíricas que proteínas
compartilhando seqüências com uma alta
identidade de aminoácidos exibem estruturas
tridimensionais com o mesmo enovelamento e
que a estrutura tridimensional de proteínas é
mais conservada que a estrutura primária (Maia,
2013). Deste modo, um modelo 3D de uma
proteína alvo pode ser construído a partir de
proteínas que possuem relação de similaridade
estrutural (Dias e Taveira; 2011).
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 MODELAGEM DA AaGSTE2
Seleção da proteína de referência
Um critério utilizado e definitivo para a
escolha da molécula molde que servirá de
referência para a construção do modelo
tridimensional da nova molécula é o percentual
de identificação. Para isso, foi feito uma busca
no PDB, através da ferramenta online BLAST.
Foi selecionada como template (molde) uma
enzima GSTs classe Epsilon do Anopheles
gambiae.
Alinhamento das Sequências de
Resíduos
Selecionado a sequência de referência, o
próximo passo realizado foi o alinhamento da
sequência molde com a sequência alvo. A
sequência alvo (AaGSTE2) foi obtida no NCBI
(número de acesso: AAEL007951-PA) e
alinhada com a sequência de referência (PDB
2IL3). A comparação entre as sequências
primárias, foi obtida pelo programa BLASTP,
que consiste num alinhamento local. O BLAST
pode comparar uma sequência em formato
FASTA (em forma de texto) de entrada com o
banco de dados pronto.
O objetivo do alinhamento é alinhar
resíduos sequencialmente equivalentes levando
em conta características estruturais comuns, tais
como, elementos de estrutura secundária e
resíduos catalíticos (Filho e Alencastro, 2003).
Construção e validação do modelo
Através do servidor online SWISS
MODEL foi realizada a modelagem da
AaGSTE2. Obtivemos como resultado no
programa um gráfico (Ramachandran), para a
validação. O gráfico mostra quantos
aminoácidos estão situados em regiões
energicamente mais favoráveis e se há algum
aminoácido em região desfavorável
participando da estrutura secundária das
proteínas.
Caracterização dos sítios de ligação
Para a caracterização dos sítios ativos,
foi utilizado a ferramenta GHECOM, um
servidor online disponível em
(http://strcomp.protein.osaka-u.ac.jp/ghecom/).
O servidor utiliza um algoritmo que identifica
bolsões profundos e rasos numa estrutura
proteíca através da morfologia da superfície e de
ferramentas de probabilidade.
2.2 DOCKING
Obtenção da estrutura dos ligantes
As estruturas dos respectivos inseticidas
(ligantes) foram obtidas do banco de dados
ZINC, disponível em (http://zinc.docking.org/)
com formato de arquivo mol2.
Tabela 1. Estruturas dos ligantes usados no
docking.
Inseticida DDT Carbaril CDNB
Estrutura
Código de
acesso
ZINC0153
0011
ZINC00001
090
ZINC01540
301
Fonte: ZINC database (http://zinc.docking.org/).
Os arquivos em formato .mol2 foram
convertidos pra o formato .pdbqt usando o
software Autodock 1.5.6 (Referências). Cargas
Gasteiger necessário aos cálculos de potência
foram adicionados ao ligante e os hidrogênios
polares foram retirados. O modelo da AaGSTE2
em formato pdb também foi convertido para o
formato pdbqt, adicionou-se cargas Kollman e
hidrogênios.
Simulação de docking
Para as simulações de docking receptor-
ligante foi utilizado o programa AutoDock
1.5.6. Para escolha da melhor conformação
utilizou-se o Algoritmo Genético (GA)
Lamarckiano. GAs são algoritmos estocásticos
que se baseiam nos mecanismos evolutivos
naturais para solucionar problemas de
otimização, neste caso, em termos práticos, para
hierarquizar as conformações, onde as que
possuírem maior escore serão consideradas as
mais favoráveis. Durante o processo de busca, a
enzima foi mantida rígida, e os ligantes foram
mantidos flexíveis. As simulações obedeceram
os seguintes parâmetros: 10 000 réplicas,
população de 150 indivíduos, 2500000
avaliações de energia, 27000 gerações, taxas de
mutação e cruzamento de 0,02 e 0,8
respectivamente. Os complexos de menor
energia foram escolhidos e analisados.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 MODELAGEM DA AaGSTE2
Alinhamento das Sequências
A comparação, ou seja, alinhamento
através do programa BLASTP, entre as
sequências alvo (AaGSTE2) e a sequência
molde (PDB 2IL3) com resolução de 2.2 Å,
resultou num percentual de identidade de 71%
e similaridade de 88%. O que possibilitou o uso
da estrutura de referência (PDB 2IL3), como
molde para a construção do modelo estrutural da
sequência da AaGSTE2. Através do pareamento
entre as sequências, ainda foi possível obter os
resultados do e-value 1e-123, indicando que há
probabilidade de (1x10-123
) ter sido apenas
casual. E em se tratando de uma sequência
curta, o valor do e-value é bom, visto que
quanto mais próximo de zero for o valor, maior
é a confiabilidade da predição (mais confiável o
resultado do alinhamento). Os resultados
mostraram 0 gaps, não havendo nenhuma
deleção, e o hit de score de 353 bits.
Figura 1. Alinhamento entre as sequências alvo e a
sequência molde, obtidos através do BLASTP. O sinal (+)
indica aminoácidos similares.
Construção e Validação do modelo
Realizado a construção do modelo
AaGSTE2 no programa SWISS MODEL,
obtivemos o gráfico de Ramachandran
apresentado na figura 5, que identifica quais
resíduos encontram-se em regiões de
conformações energicamente desfavoráveis e
mais favoráveis.
Para ser considerado um bom modelo, o
resultado do gráfico de Ramachandran deve
apresentar, na região mais favorável (A, B, L),
mais de 90% dos resíduos, desconsiderando os
resíduos de glicina (não possuem cadeia lateral),
prolina (o Cα está ligado a cadeia lateral) e os
resíduos das extremidades (C-terminal e N-
terminal) que apresentam padrões
estereoquímicos diferentes dos outros resíduos
(Laskowski, et al., 1993). Da análise do gráfico
(figura 2), 91.1% dos resíduos se encontram em
regiões favoráveis (A, B, L) e apenas 0.5% dos
resíduos encontram-se em regiões não
permitidas.
Sendo assim, pode-se considerar que
alguns resíduos que se encontram fora das
regiões consideradas favoráveis, são resíduos
como glicina, prolina, leucina. Entretanto, estes
constituem regiões importantes na proteína,
como exemplo, as alças.
O gráfico de Ramachandran (figura 2)
indica que o modelo teórico obtido tem uma
qualidade estereoquímica ótima, o que significa
que não há problemas de choque estérico.
Figura 2. Gráfico de Ramachandran para a AaGSTE2,
obtido através da ferramenta PROCHECK, no servidor
SWISS MODEL. Onde, 91.1% dos resíduos se encontram
em regiões mais favoráveis (vermelho), 8,4% em regiões
permitidas (amarelo), 0% em regiões generosamente
permitidas (bege) e 0.5% em regiões não permitidas
(branca).
Caracterização dos sítios ativos
Através da análise no GHECOM,
identificamos os resíduos que constitui os sítios
catalíticos da AaGSTE2. Explorando os sítios
em potencial nos permite uma maior
visualização de regiões de hidrofobicidade da
proteína. As regiões hidrofóbicas tendem a ficar
no interior da proteína, enquanto que as
hidrofílicas ficam na superfície, há uma
tendência dos sitio ativos se situarem em regiões
de alta hidrofobicidade, como ficam no interior
da proteína é onde possibilita menos exposição
ao solvente ou a outras interferências. A
contagem dos sítios estão evidenciados nas
tabelas abaixo (tabela 2 e 3):
Tabela 2- Resíduos que constituem os sítios catalíticos da
cadeia A da AaGSTE2, obtido do GHECOM.
Cadeia A (219)
Sítio 1 Sítio 2 Sítio 3 Sítio 4 Sítio 5
T8 –
V18
D82-
N97
V18-
k32
V163 K23-
L27
V34 –
T43
V146-
I157
E197-
N200
V166-
V172
L75-
S77
M49-
V57
- - W186-
D188
Y79-
S87
M49-
V57
- - L190-
A192
L155
V34 –
T43
- - - F160
M49-
V57
- - - L193
V65-
Y74
- - - -
L96-
A98
- - - -
L100 –
A121
- - - -
F160 –
C162
- - - -
S164-
V166
- - - -
S168-
I169
- - - -
Q206 –
L212
- - - -
Tabela 3- Resíduos que constituem os sítios catalíticos da
cadeia B da AaGSTE2, obtido do GHECOM.
Cadeia B (220)
Sítio 1 Sítio 2 Sítio 3 Sítio 4 Sítio 5
T8 –
A17
D82 –
97
A131 –
L141
L6 – T8 M1 – I5
V34 –
T43
D147 –
A158
V172 –
P181
Q31 –
L36
G26 –
E30
M49 –
V5
- - K39 –
N50
D59-
I64
V65 –
Y74
- - - I 73 –
L75
L96 –
F120
- - - S77 –
G80
S167 –
I169
- - - -
Q206 –
Q214
- - - -
.
3.2 DOCKING
Realizado o ancoramento com a
AaGSTE2 contra os ligantes estudados: DDT,
Carbaril e CDNB, no programa autodock,
obtivemos como resultado dez possíveis
complexos.
Esta é uma etapa, que tem por finalidade
permitir identificar as energias de ligação, os
scores de energias intermoleculares, e permitir a
identificação dos possíveis resíduos e átomos,
tanto da proteína quanto do ligante que estariam
se interagindo, (Morris et al., 2009).
Para o estudo, foi feito a análise dos
primeiros complexos para cada inseticida: DDT,
Carbaril e CDNB, como mostra na tabela 4:
Tabela 4: Valores das energias de ligação, energias
intermoleculares e caracterização dos resíduos e sua
posições.
Composto Energia
livre de
ligação
(kcal/mol)
Energia
intermolecular
(kcal/mol)
Resíduos
de
interação
e posições
Carbaril -4.81 -5.40
SER-77
TYR-86
LYS -88
GLN- 93
ILE- 73
ASP- 83
CDNB -6.70 -7.29 TYR- 86
LYS- 92
LYS-95
LEU-96
VAL-151
ASN-153
SER-154
THR-156
DDT -5.65 -6.54 GLU-116
PHE-120
ALA-121
ASP-129
LEU-132
LYS-136
A menor energia de interação dos
complexos formados foi para o CDNB, contudo,
este é um composto que é utilizado como
modelo padrão para pesquisas com GST de
diversas classes (BRASIL-Ministério da Saúde,
2006).
A segunda menor energia observada, foi
no complexo AaGSTE2-DDT (-5.65), o que
indica que esta enzima tem uma afinidade por
este inseticida, combinando com os resultados
evidenciado por Maia (2013). Onde, o mesmo
realizou um estudo usando uma AgGSTE2 do
Anopheles gambiae, e seus resultados também
mostraram que AgGSTE2 apresenta capacidade
de metabolizar o DDT e Carbaril.
Para o carbaril, o complexo formado
apresentou a menor energia de ligação dentre os
inseticidas estudados, mesmo assim, a
proximidade do carbaril (4 angstrons) com os
resíduos da glutationa, indica que este pode
formar conjugação enzima-substrato.
Nos três estudos de simulação de
docking, com a AaGSTE2 contra o DDT,
Carbaril e CDNB, a proximidade destes
inseticidas com AaGSTE2, sugere que estes
ligantes podem formar o GSH-conjugado com
os substratos, evidenciando o DDT e o Carbaril.
Analisando os resultados dos possíveis
resíduos de interação, realizado através do
docking, com resultados obtidos através do
GHECOM, podemos observar que os resíduos
analisados no autodock foram os mesmos
observados no GHECOM. Assim, é possivel
que estes sejam resíduos âncoras, e que estão
participando dos sítios catalíticos.
O primeiro complexo formado com o
Carbaril, pode ser observado na figura 3. Em
vermelho está representado a estrutura da
glutationa S transferase; em azul, os átomos que
estão próximos aos resíduos de aminoácidos que
estão interagindo com o ligante, em laranja, em
um raio de 4 angstrons.
Figura 3. Complexo proteína-ligante, obtido através do
programa autodock.
Fonte: Imagem obtida no programa VMD
(Visual Molecular Dynamics).
Na figura 4, podemos observar mais
detalhado o ligante Carbaril sobreposto no sítio
ativo, com identificação dos resíduos. Os
átomos dos resíduos de aminoácidos se
encontram dentro de um raio de 4 Å do ligante.
.
Figura 4. Identificação dos resíduos conjugado
com o ligante Carbaril.
Fonte: Imagem obtida no programa VMD
(Visual Molecular Dynamics).
Também, podemos observar na figura 5,
o complexo formado contra o CDNB. Em
vermelho está representado a estrutura da
glutationa s transferase; em amarelo,
Figura 5. Complexo proteína-ligante, obtido
através do programa autodock.
Fonte: Imagem obtida no programa VMD
(Visual Molecular Dynamics).
O complex da AaGSTE2 com o CDNB
pode ser observado na figura 6, inserido no sítio
ativo da enzima, com identificação dos resíduos
que circundam dentro de um raio de 4 angstrons
de distância do ligante.
Figura 6. Identificação dos resíduos conjugado com o
ligante CDNB.
Fonte: Imagem obtida no programa VMD
(Visual Molecular Dynamics).
Na figura 7 podemos observar o
complexo formado com o DDT. Em vermelho
está representado a estrutura da glutationa s
transferase; em amarelo.
Figura 7. Complexo proteína-ligante, obtido através do
programa autodock.
Fonte: Imagem obtida no programa VMD
(Visual Molecular Dynamics).
Na figura 8, podemos observar mais
detalhado o ligante DDT sobreposto no sítio
ativo, com identificação dos resíduos. Os
resíduos estão a uma distância maxima de 4
angstrons do ligante.
Figura 8. Identificação dos resíduos conjugado
com o ligante DDT.
Fonte: Imagem obtida no programa VMD (Visual
Molecular Dynamics).
4. CONCLUSÃO
Com os resultados da modelagem e
validação do modelo pode-se concluir que o
modelo construído é válido e confiável, e tem
uma boa qualidade e estabilidade estrutural.
As simulações de docking mostraram que
a enzima apresenta potencial de ligação aos
inseticidas estudados.
Com o modelo da AaGSTE2 construído, é
possível realizar outros estudos com esta
enzima; análise de docking contra outros
inseticidas; além de que, por se tratarem de
enzimas envolvidas com mecanismos de
resistência, as GSTs são candidatas promissoras
a alvos de inibição gênica e, portanto os dados
levantados a respeito de suas dinâmicas
estruturais e funcionais poderão ser utilizados
futuramente no campo da biotecnologia para o
desenvolvimento de futuramente no campo da
biotecnologia para o desenvolvimento de novas
técnicas de controle de vetores.
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Magalhães–CPqAM, Recife, 2013.195 f (tese de
doutorado).
PESARO, A E; AMICO, E D; ARANHA, L F
C. Dengue: Manifestações Cardíacas e
Implicações na Terapêutica Antitrombótica.
Universidade Federal de São Paulo –
UNIFESP.São Paulo, SP – Brasil, p. 12-15,
2007.
SHEEHAN, D; MEADE; FOLEY, V.M;
DOWD, C.A. 2001. Structure, function and
evolution of glutathione transferases:
implications for classification of non-
mammalian members of an ancient enzyme
superfamily. Biochem. J. 360, 1–16.
TAUIL, P L. Aspectos críticos do controle do
dengue no Brasil. Cad. Saúde Pública, Rio de
Janeiro, p. 867-871, 2002.
[1]- Graduandas do curso de Engenharia de
Bioprocessos e Biotecnologia da UFCG.
[2]-Rafael Trindade Maia
Doutor em Biologia Animal pela UFPE.
Mestre em Genética, Conservação e biologia
Evolutiva pelo INPA.
Licenciado em Ciências Biológicas pela
UFRPE.
Docente da UFCG. rafael.rafatrin@gmail.com
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Artigo bioterra v18_n2_09

  • 1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 Volume 18 - Número 2 - 2º Semestre 2018 MODELAGEM E DOCKING MOLECULAR DA GLUTATIONA S-TRANSFERASE EPSILON 2 DE AEDES AEGYPTI Izabela Cristina Pereira Campos1 ; Rosilândia Silva de Almeida1 ; Luana Camilla Cordeiro Braz1 ; Rafael Trindade Maia2 RESUMO A dengue é uma das arboviroses mais preocupantes e é transmitida pelo mosquito Aedes aegypti. Devido a isto, este vetor tem sido combatido há várias décadas no Brasil no mundo. O uso intenso e indiscriminado de inseticidas químicos para o controle deste mosquito, bem como os inseticidas de uso doméstico, veio ao longo dos anos selecionando populações resistentes. Um dos principais mecanismo de resistência a inseticidas químicos é através da ação das glutationa S-transferases, uma superfamília de enzimas responsáveis por reações de desintoxicação celular. Na classe epsilon desta superfamília, a AaGSTE2 (Glutationa S-transferase epsilon 2 de Aedes aegypti) tem sido associada com a resistência a inseticidas químicos, entre eles o DDT. No entanto, apesar de haver sequências desta enzima disponíveis em bancos de dados a sua estrutura tridimensional não foi elucidada. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi construir um modelo para esta enzima, através do uso de técnica computacional, usando o método de modelagem por homologia. Foi usado uma sequência de referência (molde) de uma GSTs classe Epsilon do Anopheles gambiae por possuir um percentual de similaridade de 88%. Por conseguinte, foi realizado estudo de docking molecular contra três compostos, DDT, Carbaril e CDNB. O modelo obtido apresentou ótima qualidade estereoquímica, global e local sendo considerado um modelo confiável e estável. As simulações de docking resultaram em complexos nos quais os ligantes situaram-se nos sítios de catálise da enzima, o que representa uma evidência in silico de atividade contra estes compostos pela AaGSTE2. Palavras-chave: GST, atracamento molecular, dengue, modelagem comparativa. MOLECULAR MODELLING AND DOCKING OF GLUTATHIONA S-TRANSFERASE EPSILON 2 FROM AEDES AEGYPTI. ABSTRACT Dengue fever is one of the most important tropical disease and it is transmitted by Aedes aegypti mosquito. Chemical insecticides had been used for many decades to control the mosquito and were the reason of the emergence of resistant populations. A notable insecticide resistance activity is performed by glutathione S-transferases (GSTs) enzymes. An epsilon class GST, the AaGSTE2, had been associated with chemical insecticide. However, despite the primary AaGSTE2 sequence is available, its 3D structure have not been solved. Then, the objectives of this study were to built and validate a theoretical model for the AaGSTE2 and run molecular docking simulations against DDT, carbaril and CDNB. The predicted model displayed good stereochemichal, global and local quality, which means that the model is reliable and stable. Docking results showed complexes in which these compounds bound to the catalytic site of the AaGSTE2. These results suggest that the enzyme is capable to metabolize the DDT, Carbaril and CDNB. Keywords: GST, molecular docking, dengue fever, comparative modelling. 80
  • 2. 1 INTRODUÇÃO A dengue é uma doença infecciosa e febril aguda causada por um vírus pertencente à família Flaviviridae, do gênero Flavivírus Caracteriza-se como uma doença reemergente, tornando-se um dos principais problemas de saúde pública mundialmente. Afeta de 50 a 100 milhões de pessoas por ano e é responsável pela morte de mais de 22 mil pessoas, principalmente entre crianças. Tem ampla distribuição em áreas tropicais, ocorrendo de forma endêmica e eventualmente epidêmica. É transmitida por mosquitos do gênero Aedes, principalmente Aedes aegypti cuja distribuição e adaptação em ambientes urbanos e peridomiciliares explica a predominância da dengue em cidades (Pesaro et al., 2007). O Aedes aegypti caracteriza-se como um mosquito doméstico, antropofílico, com atividade hematofágica diurna (Tauil, 2002). Sendo assim, o homem o principal hospedeiro vertebrado e fonte de alimentação. Considerando que nenhuma vacina está disponível para minimizar o impacto das doenças, o Programa Nacional de Controle da Dengue (PNCD) tem como uma das principais estratégias o controle de Aedes aegypti baseado quase que exclusivamente no uso de inseticidas químicos (Paiva, 2013). Porém, o uso indiscriminado de pesticidas tem levado ao desenvolvimento contínuo da resistência. Hoje, ela é a principal ameaça na prevenção e controle de doenças (Oliveira, 2014). A resistência a inseticidas pode ser pensada como um processo de evolução acelerada de uma população que responde a uma intensa pressão seletiva, com a conseqüente sobrevivência dos indivíduos que possuem alelos que conferem resistência. A resistência é pré-adaptativa, resultado de mutações fortuitas (Braga e Valle, 2007). Diferentes mecanismos podem estar envolvidos na redução da sensibilidade aos inseticidas, a exemplo, a via metabólica. A resistência por via metabólica é baseada na metabolização acelerada de compostos químicos por enzimas de detoxificação, como as glutationa S-transferases (GSTs) (Paiva, 2013). Por definição, as glutationa S-transferases ou GSTs (Enzyme Comission Number (EC): 2.5.1.18) compreendem uma complexa e bem distribuída superfamília de proteínas que compõem o sistema de detoxificação de fase II, envolvida no metabolismo de compostos endógenos e exógenos em organismos eucariotos. As enzimas GSTs possuem amplo espectro de especificidade, sendo capazes de metabolizar diversos componentes tóxicos hidrofílicos e hidrofóbicos, tais como: drogas, inseticidas e substratos tóxicos endógenos pela catálise da conjugação da GSH ao centro hidrofílico dos substratos (Oliveira, 2014). Assim, tendo em vista que a enzima glutationa s-transferase epsilon 2 (AaGSTE2) ainda não tinha sua estrutura elucidada, mas sua sequência primária está disponível no NCBI. O presente trabalho teve como objetivo construir um modelo tridimensional e válido para a AaGSTE2. Através da técnica de modelagem comparativa ou modelagem por homologia, como assim também pode ser chamada. Onde, esta técnica consiste na predição da proteína de interesse (alvo), utilizando uma outra sequência de uma outra proteína similar como referência (também chamada de molde), sendo que esta sequência molde tem que ter sua estrutura já resolvida (elucidada). Posteriormente, também foi realizado o docking molecular com alguns inseticidas. Um dos principais mecanismos de resistência ocorre através das vias de metabolização de inseticidas, em decorrência da superexpressão de enzimas de detoxificação. Uma das mais importantes famílias de enzimas envolvidas com a resistência é a família de proteínas das glutationa-S-transferase (GSTs), enzimas que catalisam vários compostos xenobióticos em produtos solúveis (Hayes, 2005). Em eucariontes, essa família gênica é subdividida em três classes superiores: GSTs citosólicas, GSTs microssomais (associadas às membranas) e GSTs mitocondriais (Sheehan et al., 2001). Em mosquitos, há presença apenas de duas das três classes: as citosólicas e microssomais, não sendo encontrada nenhuma GST da classe mitocondrial em insetos até o momento (Lumjuan et al., 2005). As GSTs citosólicas são compostas de duas subunidades, podendo ser homodiméricas ou heterodiméricas. Cada subunidade apresenta um sítio de ligação especifico para glutationa (sitio G), próximo a um sítio eletrofílico não
  • 3. específico (sítio H). O sítio G fica situado na terminação N da proteína e é uma região altamente conservada nas GSTs. Já os resíduos do sítio H, que interagem com os substratos hidrofóbicos, são encontrados na terminação C. A diversidade no sítio H faz as GSTs apresentarem diferentes especificidades em relação aos substratos que metabolizam (Mannervik e Danielson, 1988; et al., 1998). A reação catalisada pelas GSTs consiste em promover a conjugação do tripeptídeo glutationa reduzida a um composto específico e geralmente citotóxico, que ao ligar-se a tal grupamento eletrofílico, passará do estado reduzido para o estado oxidado, e formará um composto mais solúvel e mais fácil de ser excretado. As GSTs classe Epsilon (GSTE) constituem uma das classes citosólicas mais importantes no papel de conferir resistência à organoclorados e organofosforados, e recentemente foi comprovado um papel na resistência à piretróides em culicídeos, como Anopheles culicifacies, An. stephensi e An. fluviatilis. Estudos de modelagem e docking molecular vêm sendo utilizados para se desvendar o papel de proteínas detoxificadoras na resistência a inseticidas, como Glutationa transferases e monooxigenases (Chiu et al, 2008, Baudry et al, 2003). Em um estudo Ayres et al. (2011) caracterizaram seis membros da classe epsilon em três diferentes espécies de Anopheles. Neste trabalho foram feitos testes para detecção de seleção positiva sobre estes genes e os autores identificaram que o gene GSTE5 continha códons que haviam sofrido efeito de seleção positiva. Isto sugere que possivelmente, a proteína codificada por este gene, pode estar atuando em substratos diferentes da proteína GSTE2, a qual se mostrou bem mais conservada entre as diferentes espécies estudadas. Em Aedes aegypti as sequencias da classe epsilon já foram anotadas (Lunjuam et al, 2005) e encontram-se disponíveis em bases de dados como genbank e vectorbase. MODELAGEM POR HOMOLOGIA OU MODELAGEM COMPARATIVA Depois que uma estrutura homóloga conhecida for identificada poderá ser modelada utilizando-se uma variedade de procedimentos denominados modelagem por homologia (Dias e Taveira; 2011). A modelagem por homologia é uma metodologia adequada à predição de estruturas tridimensionais de proteínas a partir da estrutura cristalográfica de uma proteína homóloga com identidade sequencial >30 % e boa resolução. Esta técnica computacional baseia-se nas observações empíricas que proteínas compartilhando seqüências com uma alta identidade de aminoácidos exibem estruturas tridimensionais com o mesmo enovelamento e que a estrutura tridimensional de proteínas é mais conservada que a estrutura primária (Maia, 2013). Deste modo, um modelo 3D de uma proteína alvo pode ser construído a partir de proteínas que possuem relação de similaridade estrutural (Dias e Taveira; 2011). 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 MODELAGEM DA AaGSTE2 Seleção da proteína de referência Um critério utilizado e definitivo para a escolha da molécula molde que servirá de referência para a construção do modelo tridimensional da nova molécula é o percentual de identificação. Para isso, foi feito uma busca no PDB, através da ferramenta online BLAST. Foi selecionada como template (molde) uma enzima GSTs classe Epsilon do Anopheles gambiae. Alinhamento das Sequências de Resíduos Selecionado a sequência de referência, o próximo passo realizado foi o alinhamento da sequência molde com a sequência alvo. A sequência alvo (AaGSTE2) foi obtida no NCBI (número de acesso: AAEL007951-PA) e alinhada com a sequência de referência (PDB 2IL3). A comparação entre as sequências primárias, foi obtida pelo programa BLASTP, que consiste num alinhamento local. O BLAST pode comparar uma sequência em formato FASTA (em forma de texto) de entrada com o banco de dados pronto. O objetivo do alinhamento é alinhar resíduos sequencialmente equivalentes levando
  • 4. em conta características estruturais comuns, tais como, elementos de estrutura secundária e resíduos catalíticos (Filho e Alencastro, 2003). Construção e validação do modelo Através do servidor online SWISS MODEL foi realizada a modelagem da AaGSTE2. Obtivemos como resultado no programa um gráfico (Ramachandran), para a validação. O gráfico mostra quantos aminoácidos estão situados em regiões energicamente mais favoráveis e se há algum aminoácido em região desfavorável participando da estrutura secundária das proteínas. Caracterização dos sítios de ligação Para a caracterização dos sítios ativos, foi utilizado a ferramenta GHECOM, um servidor online disponível em (http://strcomp.protein.osaka-u.ac.jp/ghecom/). O servidor utiliza um algoritmo que identifica bolsões profundos e rasos numa estrutura proteíca através da morfologia da superfície e de ferramentas de probabilidade. 2.2 DOCKING Obtenção da estrutura dos ligantes As estruturas dos respectivos inseticidas (ligantes) foram obtidas do banco de dados ZINC, disponível em (http://zinc.docking.org/) com formato de arquivo mol2. Tabela 1. Estruturas dos ligantes usados no docking. Inseticida DDT Carbaril CDNB Estrutura Código de acesso ZINC0153 0011 ZINC00001 090 ZINC01540 301 Fonte: ZINC database (http://zinc.docking.org/). Os arquivos em formato .mol2 foram convertidos pra o formato .pdbqt usando o software Autodock 1.5.6 (Referências). Cargas Gasteiger necessário aos cálculos de potência foram adicionados ao ligante e os hidrogênios polares foram retirados. O modelo da AaGSTE2 em formato pdb também foi convertido para o formato pdbqt, adicionou-se cargas Kollman e hidrogênios. Simulação de docking Para as simulações de docking receptor- ligante foi utilizado o programa AutoDock 1.5.6. Para escolha da melhor conformação utilizou-se o Algoritmo Genético (GA) Lamarckiano. GAs são algoritmos estocásticos que se baseiam nos mecanismos evolutivos naturais para solucionar problemas de otimização, neste caso, em termos práticos, para hierarquizar as conformações, onde as que possuírem maior escore serão consideradas as mais favoráveis. Durante o processo de busca, a enzima foi mantida rígida, e os ligantes foram mantidos flexíveis. As simulações obedeceram os seguintes parâmetros: 10 000 réplicas, população de 150 indivíduos, 2500000 avaliações de energia, 27000 gerações, taxas de mutação e cruzamento de 0,02 e 0,8 respectivamente. Os complexos de menor energia foram escolhidos e analisados. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 MODELAGEM DA AaGSTE2 Alinhamento das Sequências A comparação, ou seja, alinhamento através do programa BLASTP, entre as sequências alvo (AaGSTE2) e a sequência molde (PDB 2IL3) com resolução de 2.2 Å, resultou num percentual de identidade de 71% e similaridade de 88%. O que possibilitou o uso da estrutura de referência (PDB 2IL3), como molde para a construção do modelo estrutural da sequência da AaGSTE2. Através do pareamento
  • 5. entre as sequências, ainda foi possível obter os resultados do e-value 1e-123, indicando que há probabilidade de (1x10-123 ) ter sido apenas casual. E em se tratando de uma sequência curta, o valor do e-value é bom, visto que quanto mais próximo de zero for o valor, maior é a confiabilidade da predição (mais confiável o resultado do alinhamento). Os resultados mostraram 0 gaps, não havendo nenhuma deleção, e o hit de score de 353 bits. Figura 1. Alinhamento entre as sequências alvo e a sequência molde, obtidos através do BLASTP. O sinal (+) indica aminoácidos similares. Construção e Validação do modelo Realizado a construção do modelo AaGSTE2 no programa SWISS MODEL, obtivemos o gráfico de Ramachandran apresentado na figura 5, que identifica quais resíduos encontram-se em regiões de conformações energicamente desfavoráveis e mais favoráveis. Para ser considerado um bom modelo, o resultado do gráfico de Ramachandran deve apresentar, na região mais favorável (A, B, L), mais de 90% dos resíduos, desconsiderando os resíduos de glicina (não possuem cadeia lateral), prolina (o Cα está ligado a cadeia lateral) e os resíduos das extremidades (C-terminal e N- terminal) que apresentam padrões estereoquímicos diferentes dos outros resíduos (Laskowski, et al., 1993). Da análise do gráfico (figura 2), 91.1% dos resíduos se encontram em regiões favoráveis (A, B, L) e apenas 0.5% dos resíduos encontram-se em regiões não permitidas. Sendo assim, pode-se considerar que alguns resíduos que se encontram fora das regiões consideradas favoráveis, são resíduos como glicina, prolina, leucina. Entretanto, estes constituem regiões importantes na proteína, como exemplo, as alças. O gráfico de Ramachandran (figura 2) indica que o modelo teórico obtido tem uma qualidade estereoquímica ótima, o que significa que não há problemas de choque estérico. Figura 2. Gráfico de Ramachandran para a AaGSTE2, obtido através da ferramenta PROCHECK, no servidor SWISS MODEL. Onde, 91.1% dos resíduos se encontram em regiões mais favoráveis (vermelho), 8,4% em regiões permitidas (amarelo), 0% em regiões generosamente permitidas (bege) e 0.5% em regiões não permitidas (branca). Caracterização dos sítios ativos Através da análise no GHECOM, identificamos os resíduos que constitui os sítios catalíticos da AaGSTE2. Explorando os sítios em potencial nos permite uma maior visualização de regiões de hidrofobicidade da proteína. As regiões hidrofóbicas tendem a ficar no interior da proteína, enquanto que as hidrofílicas ficam na superfície, há uma tendência dos sitio ativos se situarem em regiões de alta hidrofobicidade, como ficam no interior da proteína é onde possibilita menos exposição ao solvente ou a outras interferências. A contagem dos sítios estão evidenciados nas tabelas abaixo (tabela 2 e 3):
  • 6. Tabela 2- Resíduos que constituem os sítios catalíticos da cadeia A da AaGSTE2, obtido do GHECOM. Cadeia A (219) Sítio 1 Sítio 2 Sítio 3 Sítio 4 Sítio 5 T8 – V18 D82- N97 V18- k32 V163 K23- L27 V34 – T43 V146- I157 E197- N200 V166- V172 L75- S77 M49- V57 - - W186- D188 Y79- S87 M49- V57 - - L190- A192 L155 V34 – T43 - - - F160 M49- V57 - - - L193 V65- Y74 - - - - L96- A98 - - - - L100 – A121 - - - - F160 – C162 - - - - S164- V166 - - - - S168- I169 - - - - Q206 – L212 - - - - Tabela 3- Resíduos que constituem os sítios catalíticos da cadeia B da AaGSTE2, obtido do GHECOM. Cadeia B (220) Sítio 1 Sítio 2 Sítio 3 Sítio 4 Sítio 5 T8 – A17 D82 – 97 A131 – L141 L6 – T8 M1 – I5 V34 – T43 D147 – A158 V172 – P181 Q31 – L36 G26 – E30 M49 – V5 - - K39 – N50 D59- I64 V65 – Y74 - - - I 73 – L75 L96 – F120 - - - S77 – G80 S167 – I169 - - - - Q206 – Q214 - - - - . 3.2 DOCKING Realizado o ancoramento com a AaGSTE2 contra os ligantes estudados: DDT, Carbaril e CDNB, no programa autodock, obtivemos como resultado dez possíveis complexos. Esta é uma etapa, que tem por finalidade permitir identificar as energias de ligação, os scores de energias intermoleculares, e permitir a identificação dos possíveis resíduos e átomos, tanto da proteína quanto do ligante que estariam se interagindo, (Morris et al., 2009). Para o estudo, foi feito a análise dos primeiros complexos para cada inseticida: DDT, Carbaril e CDNB, como mostra na tabela 4: Tabela 4: Valores das energias de ligação, energias intermoleculares e caracterização dos resíduos e sua posições. Composto Energia livre de ligação (kcal/mol) Energia intermolecular (kcal/mol) Resíduos de interação e posições Carbaril -4.81 -5.40 SER-77 TYR-86 LYS -88 GLN- 93 ILE- 73
  • 7. ASP- 83 CDNB -6.70 -7.29 TYR- 86 LYS- 92 LYS-95 LEU-96 VAL-151 ASN-153 SER-154 THR-156 DDT -5.65 -6.54 GLU-116 PHE-120 ALA-121 ASP-129 LEU-132 LYS-136 A menor energia de interação dos complexos formados foi para o CDNB, contudo, este é um composto que é utilizado como modelo padrão para pesquisas com GST de diversas classes (BRASIL-Ministério da Saúde, 2006). A segunda menor energia observada, foi no complexo AaGSTE2-DDT (-5.65), o que indica que esta enzima tem uma afinidade por este inseticida, combinando com os resultados evidenciado por Maia (2013). Onde, o mesmo realizou um estudo usando uma AgGSTE2 do Anopheles gambiae, e seus resultados também mostraram que AgGSTE2 apresenta capacidade de metabolizar o DDT e Carbaril. Para o carbaril, o complexo formado apresentou a menor energia de ligação dentre os inseticidas estudados, mesmo assim, a proximidade do carbaril (4 angstrons) com os resíduos da glutationa, indica que este pode formar conjugação enzima-substrato. Nos três estudos de simulação de docking, com a AaGSTE2 contra o DDT, Carbaril e CDNB, a proximidade destes inseticidas com AaGSTE2, sugere que estes ligantes podem formar o GSH-conjugado com os substratos, evidenciando o DDT e o Carbaril. Analisando os resultados dos possíveis resíduos de interação, realizado através do docking, com resultados obtidos através do GHECOM, podemos observar que os resíduos analisados no autodock foram os mesmos observados no GHECOM. Assim, é possivel que estes sejam resíduos âncoras, e que estão participando dos sítios catalíticos. O primeiro complexo formado com o Carbaril, pode ser observado na figura 3. Em vermelho está representado a estrutura da glutationa S transferase; em azul, os átomos que estão próximos aos resíduos de aminoácidos que estão interagindo com o ligante, em laranja, em um raio de 4 angstrons. Figura 3. Complexo proteína-ligante, obtido através do programa autodock. Fonte: Imagem obtida no programa VMD (Visual Molecular Dynamics). Na figura 4, podemos observar mais detalhado o ligante Carbaril sobreposto no sítio ativo, com identificação dos resíduos. Os átomos dos resíduos de aminoácidos se encontram dentro de um raio de 4 Å do ligante. . Figura 4. Identificação dos resíduos conjugado com o ligante Carbaril. Fonte: Imagem obtida no programa VMD (Visual Molecular Dynamics).
  • 8. Também, podemos observar na figura 5, o complexo formado contra o CDNB. Em vermelho está representado a estrutura da glutationa s transferase; em amarelo, Figura 5. Complexo proteína-ligante, obtido através do programa autodock. Fonte: Imagem obtida no programa VMD (Visual Molecular Dynamics). O complex da AaGSTE2 com o CDNB pode ser observado na figura 6, inserido no sítio ativo da enzima, com identificação dos resíduos que circundam dentro de um raio de 4 angstrons de distância do ligante. Figura 6. Identificação dos resíduos conjugado com o ligante CDNB. Fonte: Imagem obtida no programa VMD (Visual Molecular Dynamics). Na figura 7 podemos observar o complexo formado com o DDT. Em vermelho está representado a estrutura da glutationa s transferase; em amarelo. Figura 7. Complexo proteína-ligante, obtido através do programa autodock. Fonte: Imagem obtida no programa VMD (Visual Molecular Dynamics). Na figura 8, podemos observar mais detalhado o ligante DDT sobreposto no sítio ativo, com identificação dos resíduos. Os resíduos estão a uma distância maxima de 4 angstrons do ligante. Figura 8. Identificação dos resíduos conjugado com o ligante DDT. Fonte: Imagem obtida no programa VMD (Visual Molecular Dynamics).
  • 9. 4. CONCLUSÃO Com os resultados da modelagem e validação do modelo pode-se concluir que o modelo construído é válido e confiável, e tem uma boa qualidade e estabilidade estrutural. As simulações de docking mostraram que a enzima apresenta potencial de ligação aos inseticidas estudados. Com o modelo da AaGSTE2 construído, é possível realizar outros estudos com esta enzima; análise de docking contra outros inseticidas; além de que, por se tratarem de enzimas envolvidas com mecanismos de resistência, as GSTs são candidatas promissoras a alvos de inibição gênica e, portanto os dados levantados a respeito de suas dinâmicas estruturais e funcionais poderão ser utilizados futuramente no campo da biotecnologia para o desenvolvimento de futuramente no campo da biotecnologia para o desenvolvimento de novas técnicas de controle de vetores. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRAGA, I, A; VALLE, D. Aedes aegypti: inseticidas, mecanismos de ação e resistência. Brasília-DF, 2007. BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Oswaldo Cruz. Metodologia para qualificação de atividades de enzimas relacionados com a resistência a inseticidas em Aedes aegypti. Brasília: Ministério da Saúde, 2006. (Série A. Normas e Manuais Técnicos). CHIU T, WEN Z, RUPASINGHE SG, and SCHULER M A. 2008. Comparative molecular modeling of Anopheles gambiae CYP6Z1, a mosquito P450 capable of metabolizing DDT. PNAS July1, vol.105 no.26. DIAS, S F; TAVEIRA, C C. Homologia de proteínas como ferramenta na construção de novos fármacos. Cenarium Pharmacêutico, Novembro, 2011. 17p. FILHO, O A S; ALECASTRO, R, B. Modelagem de Proteínas por Homologia. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. Quim. Nova, Vol. 26, No. 2, 253-259, 2003. HAYES, J D; FLANAGAN, J U; JOWSEY, I.R. 2005. Glutathione transferases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 45, 51–88. LUMJUAN, N; McCARROLL, L; PRAPANTHADARA, L; HEMINGWAY, J; RANSON, H. 2005. Elevated activity of an Epsilon class glutathione transferase confers DDT resistance in the dengue vector, Aedes aegypti. Insect biochemistry and molecular biology, 35(8), 861–71. doi:10.1016/j.ibmb.2005.03.008. MAIA, R T. Análise in silico e Polimorfismo Genético das Glutationas S-transferases da Classe Epsilon de Anopheles gambiae (Disptera: Culicidae): Possíveis Implicações na Resistência a Inseticidas Químicos. Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2014. 157 f. (tese de doutorado). MANNERVIK, B; DANIELSON, U H. 1988. Glutathione transferases: structure and catalytic activity. CRC Crit. Rev. Biochem. 23, 283–337. MORRIS GM, et al. 2009. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem; 30 (16):2785-2791. OLIVEIRA, R G. et al., A influência da piperina na biodisponibilidade de fármacos: uma abordagem molecular. Química nova, vol. 37. São Paulo, 2014. PAIVA, M H S. Caracterização molecular da resistência a inseticidas químicos em Aedes aegypti. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães–CPqAM, Recife, 2013.195 f (tese de doutorado). PESARO, A E; AMICO, E D; ARANHA, L F C. Dengue: Manifestações Cardíacas e Implicações na Terapêutica Antitrombótica. Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP.São Paulo, SP – Brasil, p. 12-15, 2007. SHEEHAN, D; MEADE; FOLEY, V.M; DOWD, C.A. 2001. Structure, function and evolution of glutathione transferases: implications for classification of non-
  • 10. mammalian members of an ancient enzyme superfamily. Biochem. J. 360, 1–16. TAUIL, P L. Aspectos críticos do controle do dengue no Brasil. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, p. 867-871, 2002. [1]- Graduandas do curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da UFCG. [2]-Rafael Trindade Maia Doutor em Biologia Animal pela UFPE. Mestre em Genética, Conservação e biologia Evolutiva pelo INPA. Licenciado em Ciências Biológicas pela UFRPE. Docente da UFCG. rafael.rafatrin@gmail.com 89