O slideshow foi denunciado.
Utilizamos seu perfil e dados de atividades no LinkedIn para personalizar e exibir anúncios mais relevantes. Altere suas preferências de anúncios quando desejar.
واکنش زنجیره ای پل یمراز )پی س یآر( 
تکثیر د یان ا با اهداف 
متعدد 
بسمه تعالی 
سعید حسین زاده 
دانشجوی دکتر باکتری شناس ی...
عناوین مورد بحث 
مقدمه ای بر پی س ی آر 
فرآیند پ یس ی آر  
• پ یس یآر چیست؟ 
• اجزای معمول و عمومی پ یس یآر 
• چگونه پ ی...
مقدمه ای بر 
پی س ی آر 
پی س ی آر: برای اولین بار در دهه 1980 توسط مولیس معرفی شد که در سال 1993 به خاطر 
این اختراع برنده...
پ یس ی آر چیست؟ 
ً 
یک روش نسبتا قطعه دلخواه 
واکنش زنجیره ای پلی مراز )پی س ی آر( ساده برای تکثیر 
از رشته د یا نا در شرا...
فرآیند پی س یآر- اجزای معمول و عمومی پی س ی آر 
اجزای متشکله یک فرآیند پی س ی آر: 
)0.5 - 50 ng( د یا نا الگو: برای ساختن ...
چگونه پی س ی آر د یان ا را تکثیر می کند؟ 
Vierstraete 
1999 
مرحله اول : 
واسرشتسازی 
تبدیل دورشته به تک رشته 
مرحله دوم: ...
چگونه پی س ی آر د یان ا را تکثیر می کند؟ 
7 
یک برنامه عمومی پی س یآر 
4o C or 10 mM hold 
EDTA 
Stop reaction 
5 – 10 
mi...
بهینه سازی پی س ی آر 
بسیاری از پارامترهای پی س ی آر برای افزایش مقدار و اختصاصیت 
محصول پی س ی آر باید بهینه شونداین پارا...
بهینه سازی پی س ی آر- غلظت منیزیوم 
یون منیزیوم اثرات زیادی بر عوامل پی س ی آر دارد. این یون کوفاکتور آنزیم پلی مراز 
است ...
بهینه سازی پی س ی آر- دمای اتصال آغازگر 
پایین ترین دما در چرخه پی س ی آر دمای اتصال است و تنها فرصت اتصال 
آغازگر به الگو...
بهینه سازی پی س ی آر- طراحی آغازگر 
در طراحی آغازگرها باید به ساختارهای ثانویه، مکمل بودن بازها و دمای اتصال جفتباز 
نسبت ...
بهینه سازی پی س ی آر- طراحی آغازگر 
بسیاری از مشکلات پی س ی آر با طراحی مناسب آغازگر ها قابل پیشگی ری هستند 
محتوای گوانین...
بهینه سازی پی س ی آر- طراحی آغازگر 
طول آغازگر 
طول مناسب برای آغازگرها بین 20 تا 30 باز است چون : 
با افزایش طول احتمال ت...
بهینه سازی پی س ی آر- کیفیت د یان ا 
دی ان ا مورد استفاده به عنوان الگو باید یکپارچه )خرد شده نباشد( و 
عاری از آلودگی های...
بهینه سازی پی س ی آر- کمیت د یان ا 
خوب نیست 
ً 
دی ان ا الگوی زیاد الزاما . 
•غلظت بالای الگو باعث تکثیر غیر اختصاص ی می ...
بهینه سازی پی س ی آر- باندی مشاهده نمی کنیم 
مارکر یا لکه های زایلن و برموفنل بلو دیده می شود. 
• پی س ی آر عمل نکرده است ...
بهینه سازی پی س ی آر- باندی مشاهده نمی کنیم 
مناسب نیست: MgCl غلظت 2  
MgCl با شیب غلظت 2 PCR با انجام واکنش MgCl تنظیم 2...
18 
بهینه سازی پی س ی آر- باندی مشاهده نمی کنیم 
خالص نیست: DNA • 
تمیز بودن آنرا با اسپکتوفتومتر چک کنید. 
Template رقیق ...
19 
بهینه سازی پی س ی آر- باند غیر اختصاص ی داریم 
• آلودگی وجود دارد: 
را چک کنید. Template • تیوب کنترل منفی بدون 
• پرا...
•یکی از رایج ترین دلایل این مشکل استفاده از پلی مراز معمولی است چون : 
• بعد از اضافه کردن رشته های الگو، حتی در دمای پایی...
21 
بهینه سازی پی س ی آر- باند غیر اختصاص ی داریم 
راههای حل این مشکل: 
•جدا کردن فیزیکی، ریختن الگو در درب تیوب 
•گذاشتن ...
22 
بهینه سازی پی س ی آر- در کنترل منفی باند داریم 
•واکنش را یک بار دیگر تکرار کنید. 
•پیپت را استریل کنید. 
را با کمترین...
23 
بهینه سازی پی س ی آر- غیر از باند اصلی باند غیر اختصاص ی دیگری 
داریم 
واکنش بهینهنیست.  
بهینه نیست. annealing • دما...
24 
بهینه سازی پی س ی آر- باند ضعیف است 
بهینه نیست. annealing دمای  
 MgCl تنظیم غلظت 2 
بافر واکنش مناسب نیست.  
استف...
25 
بهینه سازی پی س ی آر- باند ضعیف است 
• الگو دارای ساختار ثانویه بالا است. 
بالا است. GC • الگو دارای درصد 
استفاده کنی...
انواع آنزیم پلی مراز 
Hot Start Taq 
این نوع از آنزیم بعد از حرارت دادن فعال می شود و قبل از این مرحله هیچ فعالیتی ندارد ب...
27 
انواع آنزیم پلی مراز 
Long PCR 
روش های متعددی برای تکثیر قطعات بلند وجود دارد، برای موفقیت در تکثیر قطعات بلند دو جزء...
Thanks for your attention
Questions?
Próximos SlideShares
Carregando em…5
×

PCR procedure and troubleshooting

4.917 visualizações

Publicada em

This presentation discuss about PCR history, procedure and troubleshooting.

Publicada em: Ciências

PCR procedure and troubleshooting

  1. 1. واکنش زنجیره ای پل یمراز )پی س یآر( تکثیر د یان ا با اهداف متعدد بسمه تعالی سعید حسین زاده دانشجوی دکتر باکتری شناس ی دانشگاه تربیت مدرس s.hoseinzadeh@rocketmail.com
  2. 2. عناوین مورد بحث مقدمه ای بر پی س ی آر فرآیند پ یس ی آر  • پ یس یآر چیست؟ • اجزای معمول و عمومی پ یس یآر • چگونه پ یس ی آر د یان ا را تکثیر می کند؟ بهینه سازی پی س ی آر • غلظت یون منیزیوم • دمای اتصال آغازگر به الگو • طراحی آغازگر برای پ یس یآر • کیفیت و کمیت د یا نا )الگو( مشکلات در پی س ی آر  2
  3. 3. مقدمه ای بر پی س ی آر پی س ی آر: برای اولین بار در دهه 1980 توسط مولیس معرفی شد که در سال 1993 به خاطر این اختراع برنده جایزه نوبل شد. دانشمندان برای درک فرآیندهای سلولی، به طور غالب رخدادهای سلولی را مورد بررس ی قرار می دهند. برای این منظور دانشمندان نیازمند..  آنالیز مولکول های د یا نا، آ را نا و پروتئین هستند.  از مولکول های دی ان ا نشاندار به عنوان ابزاری برای ردیابی مولکول های زیستی استفاده می کنند. بنابراین دانشمندان نیازمند روش ی آسان و سریع برای تولید مقدار زیاد دی ان ا هستند تا بتوانند از آنها برای مطالعاتشان بهره ببرند یا اینکه از این دی ان ا ها برای تولید کاوشگرهایی استفاده کنند تا بتوانند برخی از مولکول های زیستی را ردیابی کنند. 3
  4. 4. پ یس ی آر چیست؟ ً یک روش نسبتا قطعه دلخواه واکنش زنجیره ای پلی مراز )پی س ی آر( ساده برای تکثیر از رشته د یا نا در شرایط درون شیشه ای است. پ یس ی آر به علت حساسیت بالا و سرعت بالا یکی از کلیدی ترین تکنیکهای مورد استفاده در آزمایشگاه های دنیاست. پی س ی آر می تواند به طور اختصاص ی یک ترادف هدف را در میان مقادیر زیادی از ترادف الگو به طور اختصاص ی تکثیر کند )برای مثال یک ترادف 1000 جفت بازی را در ژنوم انسان به طول 3 گیگا باز(. پی س ی آر تکثیر تصاعدی یک ترادف هدف را امکان پذیر می کند تا در نهایت مقادیر زیادی دی ان ا به دست آید. 4
  5. 5. فرآیند پی س یآر- اجزای معمول و عمومی پی س ی آر اجزای متشکله یک فرآیند پی س ی آر: )0.5 - 50 ng( د یا نا الگو: برای ساختن رشته های جدید .)0.5 – 2.5 U/rxn( د یا نا پلی مراز: آنزیمی که رشته های جدید را می سازد آغازگرها: یک جفت آغازگر برای تعیین محل تکثیر و فراهم کردن انتهای هیدروکسیلی باز )0.1 – 2.0 μM( دئوکس ی نوکلئوتید تری فسفات: اجزای سازنده رشته های جدید که براساسترادف الگو .)20 –250 μM( توسط پلی مراز کنار هم چیده می شوند بافر واکنش: یک محلول شیمیایی که شرایط بهینه برای فعالیت آنزیم و فرآیند پ یس ی آر فراهم می دهد. )1 – 5 mM( منیزیوم: کوفاکتور ضروری برای فعالیت آنزیم dNTPs Buffer Primers Taq polymerase DNA template A C T G + + MgCl2 5
  6. 6. چگونه پی س ی آر د یان ا را تکثیر می کند؟ Vierstraete 1999 مرحله اول : واسرشتسازی تبدیل دورشته به تک رشته مرحله دوم: اتصال آغازگر به الگو مرحله سوم: طویل سازی استفاده از تری فسفات نوکلئوتیدها برای تولید رشته جدید محصول یک چرخه برای چرخه بعدی به عنوان الگو عمل می کند. 6
  7. 7. چگونه پی س ی آر د یان ا را تکثیر می کند؟ 7 یک برنامه عمومی پی س یآر 4o C or 10 mM hold EDTA Stop reaction 5 – 10 min Final 70o – 75o C extension 0.5 – 2 min Primer 70o – 75o C extension 0.5 – 1 min Primer 45o – 65o C annealing 0.5 – 1 min Denature 90o – 95o C 1 – 3 min Initial 90o – 95o C denaturation 25 – 40 cycles
  8. 8. بهینه سازی پی س ی آر بسیاری از پارامترهای پی س ی آر برای افزایش مقدار و اختصاصیت محصول پی س ی آر باید بهینه شونداین پارامتر ها شامل موارد زیر هستند: غلظت منیزیوم  دمای اتصال آغازگر طراحی برنامه پی س یآر کیفیت دی ا نا الگو کمیت د یا نا الگو  8
  9. 9. بهینه سازی پی س ی آر- غلظت منیزیوم یون منیزیوم اثرات زیادی بر عوامل پی س ی آر دارد. این یون کوفاکتور آنزیم پلی مراز است و برای فعالیت آن حیاتی است. این یون به دی ا نا متصل می شود )به اکسیژن گروه فسفات( لذا برهمکنشآغازگر به الگو را تحت تاثیر قرار می دهد. یون منیزیوم در برهمکنش پلی مراز با مجموعه الگو/آغازگر اثر می گذارد. غلظت بالای منیزیوم باعث شل شدن این اتصال می شود. MgCl2 (mM) 1.5 2 3 4 5 9
  10. 10. بهینه سازی پی س ی آر- دمای اتصال آغازگر پایین ترین دما در چرخه پی س ی آر دمای اتصال است و تنها فرصت اتصال آغازگر به الگو می باشد. در صورت انتخاب دمای نامناسببه علت عدم اتصال، محصولی نیز نخواهیم داشت. براساس طول و نوع بازهای آغازگر تعیین می )annealing( دمای بهینه اتصال (Tm) شود و دمای انتخاب شده باید در دامنه 5 درجه سلسیوس ی دمای ذوب آن باشد. 10
  11. 11. بهینه سازی پی س ی آر- طراحی آغازگر در طراحی آغازگرها باید به ساختارهای ثانویه، مکمل بودن بازها و دمای اتصال جفتباز نسبت به هم توجه داشته باشیم. در نهایت آغازگر را با تارنمای زیر بررس ی کنید: • Pair of Primers 5’-ACGGATACGTTACGCTGAT-3’ 5’-TCCAGATGTACCTTATCAG-3’ • Complementarity of primer 3’ ends 5’-ACGGATACGTTACGCTGAT-3’ 3’-GACTATTCCATGTAGACCT-5’ • Results in PCR product Primer 1 5’-ACGGATACGTTACGCTGATAAGGTACATCTGGA-3’ 3’-TGCCTATGCAATGCGACTATTCCATGTAGACCT-5’ Primer 2 http://eu.idtdna.com Hairpin 11
  12. 12. بهینه سازی پی س ی آر- طراحی آغازگر بسیاری از مشکلات پی س ی آر با طراحی مناسب آغازگر ها قابل پیشگی ری هستند محتوای گوانین 0سیتوزین اصولا تمام آغازگرهای مورد استفاده در یک برنامه پی س ی آر محتوای گوانین- سیتوزین مشابهی باید داشته باشند تا دمای ذوب مشابهی نیز داشته باشند. 70 درجه سلسیوس انتخاب می کنند. - بطور غالب دمای ذوب را بین 45 در مورد محتوای گوانین-سیتوزین: باید توجه داشت که این بازها بطور یکنواخت در طول آغازگر پراکنده باشند. بهتر است 3 باز انتهای هیدروکسیلی از نوع گوانین و سیتوزین باشند. 12
  13. 13. بهینه سازی پی س ی آر- طراحی آغازگر طول آغازگر طول مناسب برای آغازگرها بین 20 تا 30 باز است چون : با افزایش طول احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه و مکمل افزایش می یابد. با کاهش طول احتمال اتصال غیر اختصاص ی بیشتر می شود. برنامه های زیادی برای طراحی آغازگرها وجود دارند که عبارتند از: Oligo, PrimerQuest, PRIMER, Oligo Explorer, Oligo Analyzer 13
  14. 14. بهینه سازی پی س ی آر- کیفیت د یان ا دی ان ا مورد استفاده به عنوان الگو باید یکپارچه )خرد شده نباشد( و عاری از آلودگی های بازدارنده پی س ی آر باشد. آلودگی: •برخی از آلودگی ها از ابتدا وجود دارند و با خالص سازی برطرف می شوند مثل پلی ساکاریدها در نمونه های گیاهی. •برخی از آلودگی ها در هنگام خالص سازی اضافه می شوند مانند فنل، الکل، سدیم دودسیل سولفاتو ... 14 غلظت سديم پلی آنتول سولفات
  15. 15. بهینه سازی پی س ی آر- کمیت د یان ا خوب نیست ً دی ان ا الگوی زیاد الزاما . •غلظت بالای الگو باعث تکثیر غیر اختصاص ی می شود. •در مقابل غلظت پایین نیز تکثیر بسیار پایین یا بدون تکثیر خواهد بود. غلظت مناسب دی ان ا الگو به طول دی ان ا بستگی دارد. 15
  16. 16. بهینه سازی پی س ی آر- باندی مشاهده نمی کنیم مارکر یا لکه های زایلن و برموفنل بلو دیده می شود. • پی س ی آر عمل نکرده است و اجزای پی س ی آر را تغییر می دهیم. مشکل در لود کردن ژل است )حتی مارکر نیز مشاهده نشود(: • لود کردن ژل را بررس ی کنید. • بافر تانک الکتروفورز را چک کنید. • اتیدیوم بروماید را به ژل اضافه کنید. ژل داک را چک کنید. UV • نور • جهت الکترود ها اشتباه است. 16
  17. 17. بهینه سازی پی س ی آر- باندی مشاهده نمی کنیم مناسب نیست: MgCl غلظت 2  MgCl با شیب غلظت 2 PCR با انجام واکنش MgCl تنظیم 2  مناسب نیست: Template غلظت Template افزایش غلظت غلظت پرایمر کافی نیست )پرایمر دایمر هم دیده نمی شود(:  افزایش غلظت پرایمر طراحی پرایمر اشکال دارد:  پرایمر را بلاست کرده و در صورت اشتباه بودن دوباره طراحی کنید. دارید )خصوصا در مورد پی س ی آر کمی(: Primer dimer  – پرایمرها را جهت هومولوژی چک کنید. – غلظت پرایمر را کاهش دهید. را بالا ببرید. Annealing – دمای
  18. 18. 18 بهینه سازی پی س ی آر- باندی مشاهده نمی کنیم خالص نیست: DNA • تمیز بودن آنرا با اسپکتوفتومتر چک کنید. Template رقیق کردن DNA خالص کردن دارای ساختار ثانویه بالا است: Template • استفاده کنید. touchdown PCR از بعد از خالص سازی قبل از خالص سازی استفاده کنید. betain یا ،BSA ،DMSO ترکیبات کمک کننده مثل استفاده کنید. Termo-start DNA polymerase از
  19. 19. 19 بهینه سازی پی س ی آر- باند غیر اختصاص ی داریم • آلودگی وجود دارد: را چک کنید. Template • تیوب کنترل منفی بدون • پرایمر یا الگو را اشتباه اضافه کرده اید. • ژن مورد نظر را برای تک فرم یا چند فرم بودن چک کنید.
  20. 20. •یکی از رایج ترین دلایل این مشکل استفاده از پلی مراز معمولی است چون : • بعد از اضافه کردن رشته های الگو، حتی در دمای پایین آنزیم شروع به فعالیت می کند، چون در این دما آغازگر امکان اتصال غیراختصاص ی آغازگر وجود دارد درنتیجه رشته های غیر اختصاص ی طویل سازی خواهند شد. • در چرخه های بعدی رشته های غیر اختصاص ی ساخته شده به عنوان الگو قرار گرفته و تکثیر می شوند. 20 بهینه سازی پی س ی آر- باند غیر اختصاص ی داریم Temp Extension Rate 55o C 24 nt/sec 37o C 1.5 nt/sec 22o C 0.25 nt/sec 150 nucleotides in 10 min
  21. 21. 21 بهینه سازی پی س ی آر- باند غیر اختصاص ی داریم راههای حل این مشکل: •جدا کردن فیزیکی، ریختن الگو در درب تیوب •گذاشتن نمونه ها روی یخ Hot Start •استفاده از پلی مراز •اضافه کردن پلی مراز در مراحل آخر Touch-down PCR ، •دمای اتصال بالا در چرخه های اولیه
  22. 22. 22 بهینه سازی پی س ی آر- در کنترل منفی باند داریم •واکنش را یک بار دیگر تکرار کنید. •پیپت را استریل کنید. را با کمترین سمپلینگ تهیه کنید. Master mix •از تیپ های فیلتردار استفاده کنید و •درب تیوبها را فقط در مراحل ضروری باز کرده و دستکش را عوض کنید. •آلودگی تک تک مواد واکنش را چک کنید )به ترتیب مواد را جایگزین کنید تا منبع آلودگی را پیدا کنید(.
  23. 23. 23 بهینه سازی پی س ی آر- غیر از باند اصلی باند غیر اختصاص ی دیگری داریم واکنش بهینهنیست.  بهینه نیست. annealing • دمای بهینه نیست. MgCl • غلظت 2 بافر مناسب نیست  برای اختصاصیت بیشتر استفاده کنید. NH4 base به جای بافر KCL base • از بافر • پرایمر اختصاص ی نیست. • زیاد بودن غلظت پرایمر استفاده کنید. hot-start • از آنزیم زیاد است. Template • غلظت بسیار طولانی است. Annealing • زمان
  24. 24. 24 بهینه سازی پی س ی آر- باند ضعیف است بهینه نیست. annealing دمای   MgCl تنظیم غلظت 2 بافر واکنش مناسب نیست.  استفاده بکنید. KCL base به جای بافر NH4 base • از بافر  کافی نیست. Template غلظت غلظت پرایمرها کافی نیست. تعداد سیکل ها کم است.
  25. 25. 25 بهینه سازی پی س ی آر- باند ضعیف است • الگو دارای ساختار ثانویه بالا است. بالا است. GC • الگو دارای درصد استفاده کنید. betain یا ،BSA ،DMSO ترکیبات کمک کننده مثل  استفاده کنید. Termo-start DNA polymerase از  • زمان طویل سازی نهایی کم است. • زمان واسرشت سازی بسیار طولانی است که پلیمراز را غیر فعال کرده است.
  26. 26. انواع آنزیم پلی مراز Hot Start Taq این نوع از آنزیم بعد از حرارت دادن فعال می شود و قبل از این مرحله هیچ فعالیتی ندارد بنابراین باند غیر اختصاص ی کمتر می شود. این نوع پلی مراز چگونه کار می کند؟! .....در واقع آنزیم مورد استفاده همان آنزیم است ولی آنزیم را با آنتی بادی اختصاص ی بلوکه می کنند بنابراین آنزیم نمی تواند قبل از جدا شدن آنتی بادی فعالیتی داشته باشد و با حرارت دادن آنتی بادی از آن جدا می شود. 26
  27. 27. 27 انواع آنزیم پلی مراز Long PCR روش های متعددی برای تکثیر قطعات بلند وجود دارد، برای موفقیت در تکثیر قطعات بلند دو جزء اهمیت زیادی دارد: بافر مورد استفاده: تا حد امکان از بافرهای با غلظت نمکی پایین استفاده می کنیم. آنزیم مورد استفاده: آنزیم های مورد استفاده برای این منظور مهندس ی شده اند تا سرعت بسیار بالایی داشته باشند به 1 کیلوباز / طوری که در یک ثانیه قابلیت سنتز یک کیلوباز را دارند در حالی که آنزیم های معمولی در حدود یک دقیقه 1تا 5 تکثیر می کنند.
  28. 28. Thanks for your attention
  29. 29. Questions?

×