REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 
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  1. 1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 1 Volume 15 - Número 2 - 2º Semestre 2015 SCREENING FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TÓXICA SOBRE Artemia salina DAS FOLHAS DE Vismia guianensis (AUBL.) PERS. HIPERIACACEAE. Suelen da Silva Santos1; Sheylla Susan Moreira da Silva de Almeida2 RESUMO Esta pesquisa objetivou realizar a caracterização fitoquímica preliminar e avaliação da atividade citotóxica em Artemia salina Leach. (Artemiidae) das folhas da espécie Vismia guianensis (Aubl.), conhecida como lacre, utilizada na medicinal tradicional para o tratamento, em especial, de dermatoses. A triagem fitoquímica foi realizada através de reações químicas de caráter qualitativo, os testes foram realizados para ácidos orgânicos, fenóis, taninos, alcalóides, depsídeos, depsidonas, flavonóides, esteróides, triterpenoides, resinas, antraquinonas, polissacarídeos, açúcares redutores e saponinas espumídicas. A avaliação da atividade de citotoxicidade em A. salina L. foi realizada pelo método tradicional descrito pela literatura, com algumas modificações, usando concentrações de 50, 100, 250, 500, 750 e 1000 μg.mL-1. O resultado da triagem fitoquímica demonstrou positividade para ácidos orgânicos, fenóis, taninos, depsídeos, depsidona e saponinas espumídicas. Na avaliação da análise de toxicidade em A. salina L. foi possível verificar que o extrato apresenta um moderado grau de toxicidade, possuindo CL50=266 μg.mL-1, podendo esta atividade estar relacionada à presença de saponinas. Os resultados demonstram a atuação do extrato como agente tóxico, sendo o uso popular justificado, parcialmente, pela presença de fenóis, taninos, depsídeos e depsidonas. Assim, novos estudos devem ser realizados no intuito de isolar as substâncias bioativas e elucidação da atividade biológica. Palavras-chave: Lacre, Vismia guianensis, Artemia salina L., triagem fitoquímica. PHYTOCHEMICAL SCREENING AND EVALUATION OF THE TOXIC ACTIVITY AGAINST Artemia salina LEAVES Vismia guianensis (AUBL.) PERS. HIPERIACACEAE. ABSTRACT This study aimed to perform the preliminary phytochemical characterization and evaluate the cytotoxic activity in Artemia salina Leach. (Artemiidae) of the leaves of the species Vismia guianensis (Aubl.), known as “lacre” and used in traditional medicine for treatment in particular of dermatoses. Phytochemical screening was performed by chemical qualitative, tests conducted to organic acids, phenols, tannins, alkaloids, depsides, depsidonas, flavonoids, steroids, triterpenoides, resins, anthraquinones, polysaccharides, sugars and foaming saponins. The evaluation of cytotoxic activity in A. salina L. was made by the traditional method described in the literature with some modifications, using concentrations of 50, 100, 250, 500, 750 and 1000 μg.mL-1. The result of the phytochemical screening showed positivity for organic acids, phenols, tannins, depsides, depsidones and foaming saponins. In evaluating the cytotoxicity in A. salina L. we found that the extract had a moderate degree of toxicity, having LC50=266 μg.mL-1, which may be related to the presence of saponins. The results demonstrate the performance of the extract as a toxic agent, with the popular use justified, in part, by the presence of phenols, tannins, depsides and depsidones. Thus, further studies should be undertaken in order to isolate the bioactive substances and elucidate the biological activity. Keywords: “Lacre”, Vismia guianensis, Artemia salina L., phytochemical screening.
  2. 2. 2 INTRODUÇÃO Desde os primórdios, o homem buscou na natureza os recursos necessários para a sua sobrevivência, utilizando as plantas na proteção contra pragas, alimentação e na cura de enfermidades (OLIVEIRA, 2009; PEREIRA; CARDOSO, 2012). Assim, o uso terapêutico das plantas medicinais na saúde humana difundiu-se ao longo dos tempos envolvendo cultura e saúde, uma vez que esses aspectos não ocorrem de maneira isolada, mas inseridos em um contexto histórico previamente determinado (ALVIM et al., 2006; OTTOBELLI et al., 2011), passando este conhecimento às gerações, não se dissociando dos mitos e rituais que são parte integrante deste processo (AGUIAR; BARROS, 2012). As espécies da família Hyperiacaceae, também conhecida como Clusiaceae (Lindl.) são amplamente difundidas devido à capacidade de biossíntese de compostos polifenóis, o que contribui para que grande parte de suas espécies apresente atividade antifúngica, antimalárica, citotóxica e propriedades antioxidantes (LAVAUD et al., 2012), compreendendo aproximadamente 1370 espécies, distribuídas em 45 gêneros (OLIVEIRA, 2009) com ocorrência em especial nas regiões tropicais do globo (OLIVEIRA, 2009; LAVAUD et al., 2012), em que se destaca o interesse econômico pela produção de frutos comestíveis, madeiras, derivados químicos de interesse farmacêutico, tintas, gomas, pigmentos, óleos essenciais e resina (OLIVEIRA, 2009; CAMELO, 2010). O gênero Vismia compreende 52 espécies, sendo as antraquinonas os metabólitos típicos, apresentando propriedades laxativas e também consideradas corantes naturais (MULLER et al., 2013). Muitas espécies têm sido utilizadas na medicina tradicional para o tratamento de algumas doenças, em particular o uso do látex de coloração avermelhada, utilizado para tratar feridas infectadas e úlceras, doenças fúngicas da pele, herpes nos lábios, como purgante e febrífugo, entre outros (ÁLVAREZ et al., 2008; CAMELO, 2010). Destaca-se no gênero a espécie Vismia guianensis A., conhecida popularmente como lacre, árvore da febre, goma-lacre, pau-de-lacre (MOURÃO; BELTRATE, 2001; OLIVEIRA, 2008; CAMELO, 2010), utilizada principalmente no tratamento de dermatoses, em especial impinges e micoses (FENNER et al., 2006), apresentando-se como um potente laxativo (OLIVEIRA, 2009; CAMELO, 2010), além de suas folhas serem empregadas como tônico (SEO et al., 2000), possuem propriedades antipiréticas e anti-reumáticas (MONACELLI et al., 1999; OLIVEIRA, 2009; CAMELO, 2010). Estudos fitoquímicos evidenciam a presença de açúcares redutores, catequinas, esteroides e tritepernoides, alcaloides, depsídeos e depsidonas (CAMELO, 2010), saponinas espumídicas, taninos (OLIVEIRA, 2009; CAMELO, 2010) antraquinonas e flavonoides (OLIVEIRA, 2009). Deste modo, o objetivo deste estudo foi de realizar a prospecção fitoquímica preliminar das folhas de V. guianensis A., com a finalidade de identificar de forma qualitativa as classes de metabólitos secundários presente na espécie responsáveis pela atividade alegada pela população, bem como avaliar a atividade citotóxica em modelo experimental utilizado Artemia Salina L., sendo que este método demostra-se eficaz na determinação da concentração letal (CL50). MATERIAL E MÉTODO Coleta e identificação do Material vegetal A coleta do material vegetal foi realizada em área de mata fechada localizada no bairro Brasil Novo, BR 156, zona norte do município de Macapá-AP. A identificação botânica foi efetuada pela Curadora do Herbário da Universidade Federal do Amapá Profa. Dra. Wegliane Campelo da Silva Aparício e uma exsicata depositada sobre registro de número 447. Preparo, secagem do material vegetal e obtenção do extrato etanólico O material vegetal foi separado obtendo-se apenas as folhas da espécie que passaram por um processo de lavagem em água corrente para a retirada de resíduos, posteriormente foi seco em bancada e em estufa à 45°C por 3 dias. O material seco foi triturado obtendo o pó das folhas da espécie V. guianensis A., estes que foram
  3. 3. 3 utilizados para a obtenção do extrato, através de extração à quente sob-refluxo em sistema fechado utilizando com solvente etanol. O extrato etanólico foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo, obtendo-se o extrato bruto etanólico da espécie que foi seco em capela de exaustão. Análise fitoquímica preliminar A triagem fitoquímica foi realizada com o extrato bruto etanólico seco, utilizando as metodologias descritas por Barbosa et al. (2004), por métodos de reações químicas, identificando a presença do metabólico por meio do aparecimento de precipitados e/ou mudança de coloração. A identificação qualitativa foi realizada para os seguintes grupos de metabólitos secundários: ácidos orgânicos, fenóis, taninos, alcaloides, depsídeos, depsidonas, flavonóides, esteroides, triterpernoides, resinas, antraquinonas, polissacarídeos, açúcares redutores e saponinas espumídicas. Toxicidade em Artemia salina L. A análise de toxicidade em A. salina L. foi realizado através das metodologias descritas na literatura (LHULLIER et al., 2006; COSTA et al., 2009; ARAÚJO et al., 2010; FREITAS et al., 2011; AMARANTE et al., 2011) com algumas adaptações, utilizando concentrações de 50, 100, 250, 500, 750 e 1000 μg.mL-1, sendo o experimento realizado em triplicada. Os ovos de A. salina L. foram incubados em solução salina por um período de 24 horas sobre iluminação artificial, para a obtenção de larvas no estágio larval de náuplios (FREITAS et al., 2011). Em cada tubo de ensaio foram colocados 10 náuplios e testados as diferentes concentrações, após 24 horas foi feita a contagem de larvas mortas e vivas, sendo possível calcular a CL50, considerando como altamente tóxico os valores de CL50 inferior a 100 μg.mL-1, moderadamente tóxico com os valores de CL50 entre 100 μg.mL- 1 e 500 μg.mL-1, e considerado não tóxicos aqueles com valores de CL50 acima de 1000 μg.mL-1 (FERRAZ FILHA et al., 2012). RESULTADOS E DISCUSSÕES Os metabólicos secundários são substâncias biologicamente ativas presentes nas plantas responsáveis pelas atividades terapêuticas alegada pela população e representam uma fonte rica em pesquisa para o desenvolvimento de novos fármacos, sendo produzidas a partir de rotas biosintéticas diversas, tento como precursores os metabólicos primários, estes que são essenciais para as funções vitais da planta (POSER; MENTZ, 2007). Através da triagem fitoquímico, foi possível detectar algumas classes de metabólitos secundários responsáveis pelas atividades terapêuticas alegadas pela população, evidenciando reação positiva para a presença de saponinas espumídicas, depsídeos e depsidonas, fenóis, taninos e ácidos orgânicos. As saponinas são glicosídeos de esteróides ou terpenos policíclicos, amplamente distribuídos na maioria das espécies vegetais e constituem um grupo de substâncias caracterizada pelas propriedades anfifílicas, parte da estrutura com características lipofílica e outra hidrofílica (SCHENKEL et al., 2007), possuindo grande destaque na indústria, sendo utilizada como adjuvante farmacêutico na preparação de medicamento, cosméticos e reagentes. Nas espécies vegetais as saponinas agem protegendo contra os ataques de patógenos, tais como fungos, bactérias e vírus, o que justifica a alta concentração com que são encontradas em diferentes espécies de plantas (GUTERRES, 2005). A função terapêutica e tóxica das saponinas está diretamente ligada a capacidade de complexar com esteroides de membrana favorecendo assim a destruição, tal ação pode estar relacionada a atividade antifúngica da espécie, constantemente relatada pela população. Além disto, as saponinas apresentam outras atividades terapêuticas que incluem: expectorante (relacionda a cacapacidade de causar irritação da mucosa), antiinflamatória, antiviral, hipocolesrolemicca, sedativa, aleopatica e inseticida (OLIVEIRA, 2009; SCHENKEL et al., 2003; RODRIGUES et al., 2010). Os fenóis são metabólitos secundários pertencentes a classe dos compostos fenólicos, caracterizada pela presença do anel benzênico e por apresentar uma vasta diversidade de estruturas, podendo ser formados partir de duas rotas biogenéticas distintas, a via do ácido
  4. 4. 4 chiquímico ou do acetato-polimalato. Os compostos fenólicos estão amplamente distribuídos no reino vegetal e nos microrganismos, além disso, fazem parte do metabolismo animal (CARVALHO et al., 2007). No caso dos animais, os compostos fenólicos são adquiridos por meio da alimentação, uma vez que não são, a princípio, capazes de sintetiza-los, por essa razão a ingestão de insuficiente deste composto esta diretamente relacionada a doenças crônicas não transmissíveis, pois intervém em alvos fisiológicos, atuando principalmente na defesa antioxidante, processos inflamatórios e mutagênicos (OLIVEIRA; BASTOS, 2011). A ação antioxidante relacionada aos compostos fenólicos é baseada na capacidade que estas substâncias possuem de oxido-redução, desempenhando função importante na absorção e neutralização de radicais livres, por atuarem quelando o oxigênio triplete e singlete ou decompondo peróxidos, produzindo uma ação protetora sobre os processos oxidativos que constantemente ocorrem no organismo e que estão relacionadas à uma série de doenças dentre as quais destaca-se o câncer, doenças do coração, aterosclerose e ao próprio envelhecimento (DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004). Cabe destaque, a atividade antimicrobiana frequentemente relatada dos compostos fenólicos, no entanto, o mecanismo de ação ainda não está totalmente elucidado, havendo um consenso de que pode estar relacionado a atuação dos compostos fenólicos na membrana citoplasmática, o que proporciona a mudança da estrutura e função, alterando o transporte ativo e coagulando o conteúdo celular (ALMEIDA, 2007). A reação positiva para a presença de taninos na espécie V. guianensis, contribuir significante para com a atividade antifúngica referido pela população. Os taninos são compostos polifenóis com distribuição em plantas, alimentos e bebidas, solúveis em água e solventes orgânicos polares, tendo como função principal a capacidade de precipitar proteínas, característica esta responsável pelo sabor adstringente de algumas plantas e frutos, sendo a base de algumas das propriedades biológicas. São empregadas na medicina tradicional contra diversas moléstias, tais como diarreia, hipertensão arterial, reumatismo, hemorragias, feridas, queimaduras, problemas estomacais, (azia, náusea, gastrite e úlceras), problemas renais, processos inflamatórios em geral, além de apresentar ação antifúngica, bactericida, antiviral, moluscicida e sequestrador de radicais livres (SANTOS; MELLO, 2007). Os taninos são comumente descritos devido a atividade antimicrobiana, atuando com inibidor do crescimento de fungos e bactérias, através da inibição de enzimas e/ou complexão dos substratos das enzimas, modificação do metabolismo celular pela atuação nas membranas e complexão dos taninos com íons metálicos, o que resulta na diminuição da sua disponibilidade para o metabolismo dos microorganismos. A capacidade dos taninos de complexarem com proteínas e poliscarideos, contribuem ainda para com a cura de feridas e queimaduras através da formação uma película de polifenóis associados a proteínas ou a polissacarídeos sob a qual ocorre o processo natural de cura (SANTOS; MELLO, 2007). Os depsídeos e depsidonas fazem parte do grupo de compostos fenólicos, e são obtidos a partir do acetil-CoA, sendo que essa via é responsável por produzir o ácido hidroxibenzóico, que dará origem aos depsídeos que posteriormente será utilizado na síntese de depsidonas (GOMES, 2009). Esses metabólicos são conhecidos por possuírem atividade antioxidante, antiviral, antitumoral, analgésico e antipirético (MACEDO et al., 2007). A atividade antiviral demostrada por esses compostos pode esta relacionada a capacidade de inibição das enzinas dos vírus, responsáveis pela manutenção do ciclo viral (NEAMATI et al., 1997). Os Ácidos orgânicos são sustâncias com grande utilização na indústria de alimentos e cosméticos. Nos alimentos são utilizados como aditivos atuando na regulação do pH e como conservantes devido as suas propriedades antioxidante e antimicrobiana. Na indústria de cosmético é usado como constituinte de composições de cremes de rejuvenescimento facial, agindo como esfoliante da pele, promovendo sua escamação superficial e consequentemente, ativando mecanismos biológicos que estimulam a renovação e o crescimento celular (FIORUCCI et al., 2002). Além disto, aos ácidos orgânicos também promovem a inibição do desenvolvimento de
  5. 5. 5 fungos nas matérias-primas e rações e diminuem a proliferação de enterobactérias no intestino (FARIA et al., 2009). Muito embora não se tenha evidenciado a presença de flavonóides, alcalóides, antraquinonas, esteróides e triterpernóides, pesquisas realizadas por Oliveira (2009) e Camelo (2010), apontam a presença destas substâncias destacando as suas funções e contribuição para a ação da espécie na terapêutica popular. As diferenças na presença de metabólicos podem ser justificadas devido aos diversos fatores que influenciam no conteúdo, tais como: sazonalidade, ritmo circadiano, desenvolvimento, temperatura, disponibilidade hídrica, entre outros (GOBBO-NETO; LOPES, 2007), evidenciando que estes metabólicos podem estar presentes na espécie, porém em quantidade reduzida, interferindo a identificação através do método utilizado. Na análise da atividade de toxicidade em A. salina L., observou-se que o extrato bruto de V. guianensis A. apresenta moderada toxidade apresentando CL50=266 μg.mL-1 (FERRAZ FILHA et al., 2012). A atividade citotóxica da espécie, pode está relacionada em particular, a presença de saponinas espumídicas, isto porque este metabólico secundário possui característica anfipática e assim a capacidade de forma complexo com esteróides, proteínas e fosfolipídios de membranas, destacando a ação sobre as células, alterando a sua permeabilidade, ou causando sua destruição (SCHENKEL et al., 2007). Relacionado com essa ação estão às atividades hemolíticas, ictiotóxica e molusquicida, frequentemente observadas e relatadas (SCHENKEL et al., 2007). Tal relação com a atividade tóxica pode ser evidenciada em alguns estudos que relatam a ação espermicida das saponinas, e que sugere como mecanismo a ruptura da membrana plasmática da célula do espermatozoide (SCHENKEL et al., 2007). Evidências da citotóxicidade foram descritas por Salas et al. (2007), relatando que a atividade é frequente nas espécies pertencentes ao gênero Vismia e que este potencial tem sido amplamente estudado contra células cancerígenas, obtendo resultados favoráveis no diz respeito ao efeito antiproliferativo. De acordo com a literatura os resultados obtidos sugerem que a espécie Vismia guianensis A. possa apresentar atividade antitumoral, tripanossomicida, antibacteriano e antifúngico, uma vez que extratos com toxicidade para A. salina L. apresentam potencial para essas atividades (COSTA et al., 2009; LEITE et al., 2009). Esses resultados demonstram o potencial da espécie V. guianensis A. como agente tóxico, necessitando de estudos mais delineados para estabelecimento de tal atividade. Além disto, permitir sugerir que a espécie apresente atuação sobre dermatoses, ação antirreumático e antipirético, pela presença de fenóis, taninos, depsídeos e depsidonas, corroborando e justificando, parcialmente, o uso popular havendo a necessidade de estudos para o isolamento de substâncias bioativas e elucidação das atividades biológicas. AGRADECIMENTOS Ao Programa de Educação Tutorial (PET), Universidade Federal do Amapá (UNIFAP), Ministério da Educação (MEC). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, L. C. G. G.; BARROS, R. F. M. Plantas medicinais cultivadas em quintais de comunidades rurais no domínio do cerrado piauiense (Município de Demerval Lobão, Piauí, Brasil). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 3, p. 419-434, 2012. ALMEIDA, A. A. P. Atividade antimicrobiana de extratos e compostos fenólicos e nitrogenados do café: avaliação in vitro e em modelo alimentar. 2007. 135p. Tese (Doutorado - Ciências de Alimentos) - Programa de Pós- Graduação em Ciências de Alimentos da Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais. ÁLVAREZ, R. E.; et al. Actividad antioxidante y contenido fenólico de los extractos provenientes de las bayas de dos especies del género Vismia (Guttiferae). Vitae, Revista de la Facultad de Química Farmacêutica, v. 15, n. 1, p. 165-172, 2008.
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