1. Bộ GIÁO
DỤC VÀ ĐÀO
TẠO
TRƯỜNG ĐẠI
HỌC NÔNG
LÂM THÀNH
PHÓ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG
NGHỆ SINH
HỌC
KHÓA LUẬN
TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ
ĐINH DANH
MỘT SÓ VI
SINH VẬT CỔ
KHẢ NĂNG
KÍCH THÍCH
SINH
TRƯỞNG
THựC
VẬT Ở VƯỜN
QUỐC GIA CÁT TIÊN
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003-2007
Sinh viên thực hiện: PHAN TRUNG HẬU
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

2. Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

3. Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SÓ VI SINH VẬT CÓ
KHẢ NĂNG KỈCH THÍCH SINH TRƯỞNG THựC
VẬT Ở VƯỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN
Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ ThS. KIỀU PHƯONG NAM
Sinh viên thực hiện: PHAN TRUNG HẬU
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

4. LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các
thầy cô, các anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
PGS.TS Bùi Văn Lệ , người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điền kiện để em
thực hiện khóa luận này.
Thạc sĩ Kiều Phương Nam , là người thầy hết lòng tận tụy tuyền đạt những
kinh nghiệm quí báo trong suốt quá trĩnh làm đề tài. Em xin cảm ơn thầy rất nhiều!
Quý thầy cô bộ môn công nghệ sinh học, cùng các thầy cô trường Đại học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy và truyền đạt cho chúng em những kiến
thức quý báu suốt 4 năm học qua.
Em cảm ơn anh Bình cùng toàn the các bạn sinh viên năm tư trường ĐH
Khoa học Tự nhiên, ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và động viên tôi những lúc gặp
khó khăn trong đề tài.
Cảm ơn tất cả các thành viên lớp CNSH 29 và các bạn thân đã cùng tôi chia sẻ
những nỗi buồn vui những năm đại học.
Và trên hết, con cảm ơn ba má , và các anh chị đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin
tưởng và khích lệ con những lúc khó khăn nhất để con có thể vững bước trên con
đường đã chọn.

5. Tháng 9/2007 Phan Trung HậuTÓM TẮT
Đề tài “Phân lập và định danh một số vỉ sinh vật có khả năng kích thích
sinh trưởng thực vật ở vườn quốc gia Cát Tiên” được thực hiện tại trại thực
nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí
Minh từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007.
Kết quả:
- Phân lập và làm thuần được 75 chủng vi sinh vật từ vườn Quốc Gia Cát Tiên.
Trong đỏ cỏ 45 chủng trên môi trường chọn lọc MMS (khoáng MS+1% methanol) và
30 chủng trên môi trường chọn lọc MSo (môi trường MS loại bỏ các thành phần chứa
nitrogen).
- Sàng lọc qua 2 hệ thống (khả năng tác động lên chồi thuốc lá trong điều kiện
in vitro và khả năng kích thích hạt nảy mầm của hạt đậu xanh trong điều kiện in vivo),
chúng tôi chọn lọc được 9 chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng trên
thực vật bao gồm: 6012a, 6019a, 6019b, 6021a, 6027a, ONlổa, ON20a, ON28a và
ON29b.
Ket quả định danh:
Chủng 6012a và 6027a được định danh tới cấp độ giống là vi khuẩn thuộc chi
Methylobacterium. Riêng chủng 6012a có thế là một loài mới.
Các chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b là nấm men
và có đặc điểm tưomg đồng với các giống nấm men sau:
- Các chủng 6019b, ONlỗa, ON20a, ON29b có điểm tưomg đồng với giống
Pichia.
- Chủng 6019a có điểm tưomg đồng với giống Cocidiascusc.
- Chủng 602la có điểm tưomg đồng với giống Rhodotorula.
- Chủng ON28a có điểm tưomg đồng với giống Endomycopsis.
MỤC LỤC
CHƯƠNG.......................................................................................................................TRANG
5

6. Chương 1: MỞ ĐẦU.................................................................Error! Bookmark not dellned.
1.1.........................................................................Đặt vấn đề Error! Bookmark
not dellned.
1.2.........................................................................Mục tiêu Error! Bookmark
not dellned.
1.3.........................................................................Yêu cầu Error! Bookmark
not dellned.
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................Error! Bookmark not dellned.
2.1.........................................................................Vườn Quốc gia Cát Tiên
........................................................................Error! Bookmark not dellned.
2.2.......................................................................................Sơ lược sự tương tác
giữa vi sinh vật và thực vật..........................................Error! Bookmark not
dellned.
2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự
tương tác.............................................................................................................................7
2.2.1.1...........................................................................................................Các vi
sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật.................................Error!
Bookmark not dellned.
2.2.1.2...................................................................Vi sinh vật gia tăng dinh dưỡng
cho cây...........................................................Error! Bookmark not dellned.
2.2.2.Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực vật. .Error!
Bookmark not dellned.
2.3. Các phương pháp định danh vi sinh vật...................Error! Bookmark not deilned.
6

7. 2.3.1. Phương pháp truyền
thống Error! Bookmark
not dellned.Phương pháp
hiện đại
7

8. Errorỉ Bookmark not delined.Chương 3: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
Error! Bookmark not deíined.
3.1..................................................Thời gian và địa điểm Error! Bookmark
not defíned.
3.2........................................................................Vật liệu Error! Bookmark
not deílned.
3.2.1........................................................Mẩu thí nghiệm Error! Bookmark
not deílned.
3.2.2........................................................Thiết bị dụng cụ Error! Bookmark
not dellned.
3.2.3....................................................................Hóa chất Error! Bookmark
not dellned.
3.2.3.1...................................................................Môi trường phân lập và làm
thuần vi sinh vật biến dưỡng methyl (MMS).Error! Bookmark not defíned.
3.2.3.2. Môi trường chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSo) . Error!
Bookmark not dellned.
3.2.3.3. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS)Error! Bookmark not
deíined.
3.2.3.4......................................................................................Các môi trường khác
Error! Bookmark not.......................................................................deíined.
3.3. Phương pháp thí nghiệm......................................................................Error! Bookmark not
...........................................................................................................................deỉĩned.
3.3.1.......................................................................................Phân lập và lảm thuần
Error! Bookmark not.........................................................................deíined.
3.3.1.1............................................................................Lấy mẫu và tăng sinh mẫu:
Error! Bookmark not.......................................................................deíined.
3.3.1.2...........................................................................................Phân lập chọn lọc
Error! Bookmark not.......................................................................deíined.
3.3.1.3. Giữ giống

9. Error! Bookmark
not defined.
3.3.2. Định tính............................................................................Error! Bookmark not deíined.
3.3.2.1. Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng kiện
in
vitro và in vivo....................................................................................Error! Bookmark not
...................................................................................deíined.
3.3.2.2.......................................................Xử lý thống kê Error!
Bookmark not...........................................deíined.
3.3.2.3..................................................Quan sát hình thái Error!
Bookmark not...........................................deíined.
3.3.3.Định danh vi khuẩn......................................Error! Bookmark not
deíined.
3.3.3.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa.... Error!
Bookmark not dellned.
Error! Bookmark not deíined. Error! Bookmark not deíined.
3.3.3.2. Đặc điểm sinh lý...
3.3.3.3. Đặc điểm sinh hóa

10. 3.3.3.4. So sánh tính tưomg đồng di truyền dựa trên hệ số lascard Bookmark
not defined.
Error!
3.3.3.5................................................................... Phân tích trình tự rDNA 16S
........................................................................Error! Bookmark not defíned.
3.3.4. Định danh nấm men...........................................................Error! Bookmark not defíned.
3.3.4.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men...Error! Bookmark not
deíined.
3.3.4.2................................................................................. Xác định một số đặc
tính sinh hóa của nấm men...........................................Error! Bookmark not
dellned.
Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN....................................Error! Bookmark not deíined.
4.1.........................................................................Kết quả phân lập và lảm thuần
........................................................................Error! Bookmark not deíined.
4.2.........................Ket quả sàng lọc các chủng có khả năng tương tác với thực vật
.................................................................................................................Error!
Bookmark not dellned.
4.2.1. Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng YSY
trong
điều kiện in vitro..........................................................................Error! Bookmark not deíined.
4.2.2. Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống.... Error!
Bookmark not defined.
4.3. Định danh vi sinh vật............................................................Error! Bookmark not deíined.
4.3.1. Kết quả quan sát hình thái.....................................Error! Bookmark not deíined.
Chương 5: KẾT LUẬN - ĐÈ NGHỊ............................Error! Bookmark not defined.2
5.1 Kết luận..........................................................Error! Bookmark not defined.2

11. Đề nghị Error! Bookmark not deíined.TÀI LIỆU THAM KHẢO
85
11

12. DANH SÁCH CÁC CHỬ VIÉT TẤT
PHỤ LỤC
Bp Base pair
EDTA Ethylene-Diamine-T etraacetic- Acid
MS Murashige và Skoog, 1962
CMS Môi trường bổ sung 2% cao thịt và 2%
casein
MMS môi trường Methanol Minerol Salts
Gram (-) Gram âm
Gram (+) Gram dương
PPFM Pink-Pigment Facultative Methylotrophic
PCR Polymerase Chain reaction
MSo Môi trường khoáng MS không có nitrogen
DNA Deoxyribonucleotide Acid
Taq Tag polymerase
LDC Lysine decarboxylase
PHB Poly-beta-hydroxybutyrate
viii

13. DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi
khuẩn biến dưỡng methyl; (B) Khuẩn lạc Methylobacterium
13

14. DANH MỤC CÁC sơ ĐÒ VÀ BIỂU ĐÒ
•
TRANG
14

15. DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả ừong bộ thử nghiệm
xii

16. 16
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mọi
nền nông nghiệp. Do đỏ đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện
năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó
phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học. Tuy nhiên các biện pháp
này còn rất nhiều hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và ảnh hưởng
xấu đến sức khoẻ con người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện
pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền
vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao. Bên cạnh đó, gần đây nhiều
công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây
trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó các vi sinh vật có khả năng cố định
nitrogen và biến dưỡng methyl đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm.
Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật này được
biết đến thông qua cơ chế cố định đạm hoặc sự sản sinh các họp chất sinh học như các
phytohormone, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế sự phát triển của
mầm bệnh qua đó kích thích sinh trưởng của cây chủ. Chính bởi những ưu điểm này
mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đang
là một hướng đi đầy tiềm năng. Đặc biệt trong điều kiện nước ta là một trong những
quốc gia có đa dạng sinh học phong phú với các khu bảo tồn thiên nhiên còn hoang dã,
thì tiềm năng tìm thấy các chủng vi sinh vật có ích trên là rất lớn.
Trên những cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Phân lập và định danh một số vỉ sinh vật có khả năng kích thích sinh
trưởng thực vật ở vườn Quốc gia Cát Tiên”.
1.2 Mục tiêu
> Phân lập và tuyển chọn những vi sinh vật có đặc tính tương tác thực vật để ứng
dụng trong nông nghiệp.
> Định danh để tìm kiếm các loài mới.

17. 17
1.3 Yêu cầu
> Phân lập và làm thuần được một số chủng vi sinh vật có khả năng biến dưỡng
methyl và cố định nitrogen ở vườn Quốc gia Cát Tiên.
> Khảo sát để chọn lọc những vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật từ những
chủng phân lập được.

18. 18
Bước đầu định danh các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý,
sinh hoá và sinh học phân tử.
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vườn Quốc gia Cát Tiên [23]
Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT) nằm trên vùng chuyển tiếp từ cao nguyên xuống đồng bằng qua địa phận ba tỉnh:
huyện Cát Tiên, Bảo Lâm (tỉnh Lâm Đồng); Bù Đăng (tỉnh Bình Phước); Vĩnh Cửu, Tân Phú (tỉnh Đồng Nai). Chính vì thế
vườn có nhiều dạng địa hình: từ núi cao, sườn dốc, đồi nhấp nhô cho đến thềm sông bằng phẳng, nhiều thác ghềnh, suối lớn và
những vùng đầm lầy ngập nước. VQGCT cách thành phố Hồ Chí Minh 150km với tổng diện tích là 73878 ha, tài nguyên thiên
nhiên phong phú, đa dạng và là một trong những Vườn Quốc gia lớn nhất Việt Nam.
❖ Hệ thực vật
Vườn Quốc gia Các Tiên có nhiều dạng sinh cảnh: rừng nguyên sinh và thứ sinh trên đất thấp ưu thế bởi các loài thuộc
họ Dầu (Dipterocarpaceae); rừng nửa rụng lá nguyên sinh và thứ sinh ừên đất thấp ưu thế bởi các loài Lagertroemia sp. đất
ngập nước ngọt và trảng cỏ ngập nước theo mùa ưu thế bởi các loài Saccharum sp. rừng ngập lụt ưu thế bởi các loài
Hydrocarpus sp. xen lẫn Ficus benjamina và các kiểu sinh cảnh thứ sinh như rừng ừe nứa, ừảng cỏ... Hệ thực vật đã ghi nhận
1362 loài thực vật bậc cao có mạch, trong số đó có 34 loài có tên trong "Sách Đỏ" Việt Nam và nhiều loài cây gỗ có giá trị như
gõ đỏ, xoay, cẩm lai, giáng hưomg quả to
❖ Hệ động vật
Theo thống ghi nhận 77 loài thú, 318 loài chim, 58 loài bò sát, 26 loài ếch nhái, 130 loài cá. Trong số đó có các loài thú
lớn quý hiếm và một số loài có nguy cơ đe doạ tuyệt chủng toàn càu như tê giác Java, bò tót, voi Châu Á, cá sấu nước ngọt
(Crocodylus siamensis); một số loài chim đặc hữu như gà so cổ hung (Arborophila davidi), gà tiền mặt vàng (Polyplectron
germani), một số loài chim nước quý hiếm như quắm cánh xanh (Pseudibis davisoni), ngan cánh trắng (Cairina scutulata), già
đẫy nhỏ (Leptoptilos javanicus). Đối tượng bảo tồn là rừng cây họ Dầu, các hệ sinh thái đặc thù, các loài tê giác, cá sấu, bò tót,
các loài chim đặc hữu. VQGCT thực sự là kho bách khoa toàn thư sống cho công tác nghiên cứu thế giới tự nhiên
2.2 Stf lược sự tương tác giữa vỉ sinh vật và thực vật
Các vi khuẩn tương tác với thực vật rất đa dạng về giống loài và cơ chế tương tác với thực vật. Những vi khuẩn này là

19. 19
một bộ phận quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật. Mặc dù các nghiên cứu về vi khuẩn tương tác thực vật chủ yếu
tập trung vào các vi sinh vật gây bệnh trên thực vật và các vi sinh vật cố định nitơ. Tuy nhiên, mối quan tâm về sự đa dạng của
các vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật đã và đang gia tăng. Và thực tế trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có khả
năng kích thích sinh trưởng thực vật, nhưng chúng chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong quần thể vi sinh vật. Những vi sinh vật này có
vai trò quan trọng trong nông nghiệp hay môi trường. Những tiến bộ kỹ thuật trong sinh thái và di truyền vi sinh vật đã và đang
phát hiện ra nhiều loài vi sinh vật có ích, có tác động tích cực lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đồng thời cũng làm
sáng tỏ các cơ chế tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, làm nền tảng cho việc ứng dụng các vi sinh này vào cuộc sống [18].
Các vi sinh vật tương tác với thực vật không chỉ bao gồm các vi sinh vật tiền nhân (Prokaryote) mà nó còn cả các vi sinh
vật nhân thực (Eukaryote):
+ Prokaryote là thành phần chiếm đa số của hầu hết các quần thể vi sinh vật trong thực vật. Các prokaryote này, thường
là vi khuẩn có thể hiện diện với mật độ lên tới 109 tế bào trên 1 gram mô rễ. Nếu nuôi cấy chúng trên môi trường chọn lọc có
thể đạt 1010 tế bào trên 1 gram sinh khối thực vật [18].
+ Eukaryote bao gồm nấm sợi, nấm men, tảo, protozoa và các tuyến trùng thường tập trung với mật độ thấp hon các
prokaryote. Một thí dụ rõ ràng là các vi sinh vật cộng sinh hên rễ có thể đạt lượng tế bào trên 1 gram mô rễ là: 106-109 tế bào
vi khuẩn, 107 xạ khuẩn, 105-106 tế bào nấm men, 103 đối với tảo, 102-103 đối với protozoa. Bacteriophage và các loại virus
cũng là thành viên của quần thể này, chúng có thể tìm thấy trong đất với mật độ 108-109 tế bào trên một gram đất [6].
Vi sinh vật tưong tác thực vật có thể phân nhóm dựa vào nơi cư trú, và bản chất tác động của chúng lên thực vật.
Phân nhóm dựa vào nơi cư trú bao gồm
Các vi sinh vật biểu sinh (epiphyte): bao gồm các vsv cộng sinh ở vùng rễ (Rhizosphere) và vsv cộng sinh trên bề mặt
lá (Phyllosphere). Phần lớn các vi sinh vật biểu sinh tương tác thực vật sống bằng các chất dinh dưỡng thoát ra trên bề mặt cây.
Ví dụ vùng rễ thường tiết ra nhựa keo (dịch nhày) chứa: Hydrat polysaccharide, acid hữu cơ, vitamin, và amino acid, đó là điều
kiện tối ưu đối với một giá thể mà vi sinh vật cần cho sự sinh trưởng và phát triển. Nhựa keo được bao bọc bởi nước, và như
thế giúp làm môi trường thủy giải tốt đối với rễ và vi sinh vật vùng rễ phát triển [16].
Ở vùng lá, nguồn thức ăn cho các vi sinh vật là dịch lá tiết ra. Trong nhóm vi sinh vật vùng lá thì vi khuẩn biến dưỡng
methyl tùy ý (Pink-pigmented íacultatively methylotrophic, PPFM) chiếm tỉ lệ lớn và nó được phân bố hên nhiều loại cây.
[14]. Chúng sử dụng nguồn carbon là nguồn methanol do cây tiết ra từ quá trình phân hủy các pectin có methyl. Nhờ khả năng
sử dụng nguồn thức ăn khác thường này, PPFM có thể loại bỏ các chất độc này khỏi mô thực vật, và có chỗ cư ngụ trên lá. Các
PPFM sử dụng nguồn carbon, và các khoáng chất từ cây chủ, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hóa chuyển hóa quan
trọng của cây chủ [19] (Hình 2.1).
số các vi sinh vật này không làm thay đối sự sinh trưởng và sinh lý của cây. Do đỗ, phần lớn vi sinh vật tương tác thực vật có

20. 20
một tương tác hội sinh (commensalỉstỉ) với cây chủ.
thyl
(B) Khuẩn lạc
Methylobacterium từ cỏ ba lá trên
môi trường phân lập [20]
c vỉ sinh vật nội sinh (endophytỉc)
Các vi sinh vật nội sinh
(endophytỉc) là các vi sinh vật sống bên
trong mô thực vật sống và không gây
hạỉ tới cây chủ. Chúng được phân lập từ bề mặt mô hay chiết xuất từ mô thực vật. Mặc dù, các loại nấm endophytỉc đã được
nghiên cứu rộng rẫi trong khi các vi khuẩn endophytic thì chưa, các vi khuẩn này vẫn thu hút được sự quan tâm nhờ vào tiềm
năng sử dụng của chúng trong nông nghiệp.
Các vsv nội sinh được phân lập từ nhiều loại mô và cây khỏe mạnh. Kobayashỉ và Palumbo (2000) đã biên soạn một
danh sách 55 giống và 144 loài endophytic phân lập từ rễ, thân, hoa, hạt, quả của nhiều loài thực vật [14].
2.2.1 Phân nhóm vỉ sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự tương tác [16]
Theo bản chất của sự tương tác thì các vi sinh vật tương tác được chia làm 2 nhóm: nhóm vi sinh vật có lợi cho thực vật
và nhóm vi sinh vật gây bất lợi cho thực vật.
Các vi sinh có lợi chiếm ưu thế là các vi sinh vật kích thích sự sinh ở thực vật sinh trưởng. Việc tìm hiểu và xác định các
cơ chế này rất khó khăn do sự đa dạng của các cơ chế. Đối với các vi sinh vật cố định đạm, sự kích thích sinh trưởng chỉ thấy
rõ khi cây sống trên vùng đất nghèo đạm. Đen nay khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đến nay được hiểu theo 4 con
đường chính
- Gia tăng lượng các chất dinh dưỡng ở dạng dễ sử dụng cho cây
- Sản xuất các phytohormone kích thích sinh trưởng thực vật
- Tăng cường ảnh hưởng có lợi của các tương tác cộng sinh
- Giảm tác động có hại của các mầm bệnh.
2.2.1.1 Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật: thường được tìm thấy ở các vi sinh vật nội sinh.
Các vi sinh vật nội sinh bảo vệ cây khỏi sự tấn công của các mầm bệnh bằng các cơ chế sau:
• Cạnh tranh về noi ở và dinh dưỡng
Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ờ vi sinh vật biến dưỡng

21. 21
Các endophyte thuộc nhóm này có khả năng sinh sản rất nhanh chóng, chúng vượt qua số lượng các mầm bệnh trong cây
và ức chế sự sinh sản cũng như dinh dưỡng của mầm bệnh. Ví dụ điển hình trong trường họp này là một số loại nấm men. Sự
sinh sản bằng cách nảy chồi khiến nấm men nhân lên số lượng một cách nhanh chóng và khiến sự nảy mầm của các bào tử B.
cinerea hoàn toàn bị ức chế.
• Sự tổng hợp các loại họp chất thứ cấp
Trong nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy các vi sinh vật nội có sự sản sinh ra các loại họp chất thứ cấp có hoạt tính của
kháng sinh do đó chúng có khả năng ức chế và tiêu diệt một số loại nấm bệnh.
Như trường họp của 2 loại kháng sinh tự nhiên do Sporothrix ýloccolosa sản xuất ra là: heptadeceonic và methyl-
hepadecenoic acid có khả năng kháng khuẩn và kháng một số loại nấm như: B. cinerea, Fusarium oxysporưm sp. Urquhart và
Punja (2002) cũng đã tinh chế một ester acid béo với hoạt tính kháng nấm từ Tiỉỉetiopsis pallescens.
• Enzyme phân hủy vách tế bào [16]
Nhiều nghiên cứu cho thấy, các vi sinh vật tương tác thực vật có khả năng sản sinh ra các loại enzyme phân hủy thành
lysis của tế bào các loại mầm bệnh như : enzyme chitinase, P-l ,3-glucanase...
Một số loại nấm men như Pichia anomala, p. membranifaciens,R. glutinis, c. laurentii, A. pullulans, Tilletiopsis
albescens, tạo P-l,3-glucanase chống lại các loại nấm gây bệnh trên lá và trên quả như : A. niger, Sphaerotheca ýuliginea, p.
xanthii (Urquhart, 1994; Castoria, 1997; Jijakli và Lepoivre 1998; Castoria và cộng sự , 2001; MasihvàPaul 2002). Trong công
trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tương quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với
vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây [16].
• Kích thích phản ứng phòng vệ ở cây chủ
Sự cảm ứng này liên quan đến việc sản xuất một số họp chất như phenylalanine ammonia lyase phytoalexin, peroxidase
và ethylene trong mô tế vào thực vật.
2.2.1.2 Vi sinh vật gia tăng dinh dưỡng cho cây [16]
Khả năng cố định nitơ (biến đổi nitơ thành amonia) chủ yếu giới hạn trong giới prokaryotes nhưng đa dạng giữa các
giống vi khuẩn. Nằm trong số gần 100 loại cố định nitơ (diazotrophic), chỉ có một vài loại có tính chuyên biệt cao, các tương
tác mật thiết có thế tạo một cơ quan mới hay một cơ quan có cấu trúc giống với cơ quan của cây chủ. Tương tác đạt cực đại khi
chúng chuyển sang cố định nitơ cho cây chủ, theo đó cung cấp một lượng dinh dưỡng cho cây chủ. Ngược lại cây chủ cũng
giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi điều kiện môi trường và cung cấp các họp chất giàu năng lượng cho hoạt động cố định nitơ. Các vi
sinh vật cố định đạm bao gồm vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu, các vi sinh vật tự do cố định đạm, các vi khuẩn lam...
ộng sinh trên cây họ đậu
Nghiên cứu điển hình nhất về tương tác cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật là tương tác giữa vi khuẩn tạo nốt sàn trên rễ

22. 22
và các cây họ đậu. Các cây thuộc họ này bao gồm: đậu hòa lan, đậu nành, đậu lăng và cỏ linh lăng cũng như các loại cỏ trinh
nữ, cây keo...
Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn cộng sinh được phân loại thành vài giống, và các loài chuyên biệt nhất thuộc
giống Rhizobium, Sinorhizobiu, Mesorhizobiưm, Bradyrhizobium.
Hầu hết các vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu đều tạo ra nốt sần trên rễ (các nốt sần này là những tín hiệu cho thấy có
sự tương tác giữa vi khuẩn và cây trồng). Yà trong sự đáp ứng này, có sự sản xuất các phân tử tín hiệu lipochitooligosaccharide
thường được gọi là các nhân tố Nod. Các nhân tố Nod khiến các sợi rễ xoắn lại, hạn chế sự thủy phân của thành tế bào bên
trong các nốt xoắn, sự lõm vào của màng plasma, sự lắng đọng của vật liệu tạo vách tế bào mới tạo ra dòng xâm nhiễm. Chúng
giữ vai trò như một đường ngõ đi vào mô cây. Vi khuẩn phân chia bên trong các dòng này khi chúng phát triển xuyên qua
nhiều lớp vỏ tế bào trong rễ. Một số loài vi khuẩn cộng sinh cây họ đậu khác lại xâm nhập vào cây thông qua các lỗ hổng ở
biểu bi và di chuyển xuống vùng gian bào của rễ, có hoặc không có sự hình thành các dòng xâm nhiễm.
Ở một vài loài cây chủ như là cỏ linh lăng và đậu hà lan, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân bên trong vỏ tế bào và
gây nên các nốt sần bất định (các nốt sần này tiếp tục kéo dài phụ thuộc vào sự liên tục của mô phân sinh ở đỉnh); ở các cây
chủ khác như đậu nành, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân của vùng bên ngoài lớp vỏ tế bào và dẫn đến sự hình thành nốt
sần bất định. Ở hai trong số 3 phân họ cây họ đậu (Mimosoideae và Papilionoideae), vi khuẩn di chuyển từ dòng xâm nhiễm
vào trong tế bào chất của tế bào cây chủ bằng cơ chế nhập bào (endocytosis). Nó cho phép vi khuẩn được bao bọc bởi màng tế
bào thực vật. Các vi khuẩn ở trong vùng gian bào và nội bào này được gọi là các bacteroid, phân chia cho đến khi chúng chiếm
đầy tế bào cây chủ và phân hóa thành dạng giàu nitrogenase, enzyme

23. 23
quan trọng để cố định nitơ. Trong phân họ Caesaỉpinoideae, các vi khuẩn không rời khỏi trong dòng xâm nhiễm thay vào đó,
các dòng xâm nhiễm phân nhánh cho đến khi nó chiếm đày tế bào chủ. Sự cố định nitơ chỉ xảy ra khi nồng độ oxi tự do trong
nốt sần đủ thấp để cho phép kích hoạt enzyme nitrogenase. Protein liên kết oxy leghemoglobin ở thực vật (có chức năng liên
quan tới hemoglobin, giữ vai trò lảm giảm luợng oxy khi xử dụng oxy để hô hấp).
Ngoài ra còn có các các sinh vật nội bào cố định đạm không hình thành nốt sần (diazotrophic endophyte) đã được phân
lập từ một số loại cây thân thảo như: bắp, lúa, mía đường, lúa mì...ví dụ điển hình về vi khuẩn nội bào cố định đạm là
Gluconacetobacter diazotrophicus (trước đây là Acetobacter diazotrophicus), Herbaspirillum spp ở cây mía, Alcaligenes,
Azospirillum, Bacillus, Enterobacter, , Klebsiella, Pseudomonas và Rhizobium trên lúa và bắp (James, 2000). Khi chủng các
loại vi khuẩn nay lên rễ, chúng sẽ xâm nhiễm vào rễ và nhiều khi là vào hệ thống mô mạch tạo thành các quần thể vi sinh vật
trong vùng gian bào và có thể đạt nồng độ 101- 107 tế bào trên 1 gram trọng lượng tươi [16].
vật tự do cố định nittf
Đây là các loại vi khuẩn tương tác thực vật cố định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây chủ theo hướng cộng
sinh chuyên biệt.
1. Vi sinh vật cộng sinh cư trú ở vùng gian bào
(Endosymbionts)
Sự gia
tăng độ
mật
thiết của
các
tương
tác
Ví dụ: vi khuẩn cộng sinh gây nốt sần trên rễ cây họ đậu
2. Vi sinh vật cư trú ở vùng ngoại bào (Ectosymbionts)
Ví dụ: tương tác giữa vi khuẩn lam và một số loài thực vật
bậc thấp
3. Vi sinh vật bên trong mô cây chủ (Endophytes)
Ví dụ: Herbaspirillum sp. ở cây mía đường
4. Vi sinh vật chỉ sống trên bề mặt cây
Ví dụ: Azospirillum và Klebsiella
Hình 2.2: Phổ tương tác cố định
đạm trên thực vật [16].

24. 24
] Hầu hết các prokaryote cố định nitrogene sống trạng thái tự do. Sự cố định nitrogen ở vùng rễ phổ biến hom do việc cố
định nitrogen cần năng lượng lớn, và vùng rễ cây là vùng giàu carbohydrate.
Các loài Azospirillum là những loài cố định nitrogen đầu tiên được phân lập từ rễ cây và nó có các đặc tính tốt nhất của
các loài sinh vật cố định đạm tưcmg tác thực vật. Không giống các sinh vật nội sinh cố định đạm như Gluconacetobacter
diazotrophicus và Herbaspirillum sp. (nội sinh bắt buộc), Azospirillum sp. là nhóm nội sinh không bắt buộc. Chúng vừa sống
được cả nội sinh và trên vùng rễ.
ình 2.3. Azospirillum brasilense bề mặt
của rễ lúa [201
Bên cạnh nitrogen thì phosphate là loại dinh dưỡng
khoáng thứ hai ảnh hưởng nhiều lên sinh trưởng của cây. Lượng
phosphate trong đất rất dồi dào nhưng phần lớn đều ở dạng
chưa hòa tan. Nhiều loài vi sinh vật rễ có thể hòa tan các phosphate vô cơ bằng cách tiết ra các acid hữu cơ, như gluconic acid
và 2-ketogluconic acid, hay có thể khoáng hóa phosphate vô cơ bằng cách tiết enzyme ngoại bào phosphatases. Một số loài vi
khuẩn khác sản xuất các hcrp chất hữu cơ (gọi là siderophore) các chất này kết họp với Fe3+, khiến nó dễ chuyển đổi thành
dạng dễ sử dụng hơn (Fe2+) [16].
2.2.2 Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực vật.
2.2.2.1 Enzymes:
Một số nghiên cứu cho thấy có sự tổng hợp ACC deaminase (1- aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase) từ các vi
khuẩn kích thích sinh truởng thục vật ở vùng rễ (Li và ctv., 2000) nhu: Methylobacterium sp., Alcaligenes spp. Bacillus
pumilus, Enterbacer cloacae, burkholderia cepacia, Pseudomonas putida, Pseudomonas spp.và Variovoraxparadoxus [19]. Cơ
chế này đuợc lý giải là do ACC có khả năng làm giảm ethylen trong rễ (mà ethelen này ức chế sụ sinh truởng của rễ) do đó
kích thích rễ phát triển.
2.2.2.2 Phytohormone:
Tác động kích thích lên sinh truởng thục vật thuờng là do sụ sản xuất các phytohormone. Phytohormone phổ biến nhất là
auxin indole-3-acetic acid (IAA). đã có nhiều nghiên cứu về sụ sản xuất auxin này ở các loài vi khuẩn nhu: Azospirillum
brasilense, Aeromonas veronii, Agrobacterium sp., Alcaligenes piechaudii, Bradyrhizobium spp., Comamonas acidovorans,
Enterobacter sp., và Rhizobium legưminosarưm [19]. Tuy nhiên có rất ít các vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA để kích

25. 25
thích sụ sinh truởng ở thực vật. Chúng thuờng là các vi khuẩn gây bệnh nhu Argobacterium tumeýaciens, A. rhizogenes và p.
syringae pv.
Một số quan sát cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sống cộng sinh trên thục vật mà không gây bệnh cho cây chủ,
nguợc lại chúng còn có khả năng hỗ trợ cây chủ phát triển rất tốt. Holland và Polacco (1994) đã nghiên cứu về
Methylobacterium, cytokinin và sụ phát triển của thục vật bằng cách đun hạt đậu nành (50°c trong 4 giờ) để giảm khả năng nảy
mầm xuống khoảng 30%. Khi đó mật độ PPFM nhiễm ở hạt cũng đồng thời giảm xuống 90%. Việc bổ sung cytokinin (benzyl
adenine + zeatin 0,5 mg/1) vào các hạt này có tác dụng phục hồi tỉ lệ nảy mầm. Bổ sung PPFM vào môi trường hạt nảy mầm
cũng có tác dụng tuơng tụ nhu tác dụng của cytokinin [10]. Ket quả này phù hợp với giả thuyết cho rằng PPFM ảnh huởng đến
luợng cytokinin có trong mô tế bào thục vật.
Koenig và cộng sự (2002), nghiên cứu về mối liên hệ giữa Methylobacterium sp. và thực vật ở mức phân tử. Họ chứng
minh bốn loài Methylobacterium sp. phân lập từ lá và loài M. extorquens đều tạo ra cytokinin là trans-zeatin ở mức rất thấp và
tiết vào môi truờng nuôi cấy [15].
Tuy nhiên, kết quả của Koenig và cộng sụ đã cung cấp bằng chứng về cơ chế tổng họp cytokinin ở các chủng
Methyỉobacterium, là tiền đề cho các nghiên cứu về mối quan hệ giữa Methyỉobacterium và thục vật. Hơn nữa, bằng chứng về
một vi khuẩn hội sinh tạo phytohormone đã đua đến cái nhìn thấu đáo hơn về vai trò của vi khuẩn Methylobacterium sp. với
thục vật.
Kết quả: Methylobacterium sp. có khả năng tổng họp cytokinin phù họp với những khám phá khác và một số dinh duỡng
methyl khác (nhu Methylomonas methanica, Methylovorus may) có khả năng tổng họp cytokinin [7]. Hơn thế nữa, Joshi
lagmoha và Holland (2001) đã đua ra giải pháp tăng năng suất bằng cách phun PPFM lên cây trồng [21].
Bên cạnh đó năm 2004, Omer và cộng sụ đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi truờng chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn
biến duỡng methyl. Qua đó, phát hiện thấy có 3 trong 16 chủng phân lập có phản ứng duơng tính với với thuốc thử Salkowski.
Điều này đuợc chứng minh rõ hơn bằng phuơng pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) kết họp với phân tích phổ NMR (nuclear
Mangnetic Radiation: cộng huởng từ hạt nhân). Ba chủng tạo ra IAA có hàm luợng phytohormone từ 6 - 13,3 mg/1 nếu bổ
sung L-tryptophan (L-TRP). Khi không bổ sung L-TRP thì nồng độ IAA tạo ra chỉ từ 1.1-2,4 mg/1 [17], [9].
Các kết quả này đã gây đuợc sụ chú ý lớn. Agricell Report nhấn mạnh: “Việc khảo sát về khả năng vi khuẩn dinh duỡng
methyl kích thích tăng truởng và phát sinh hình thái thục vật trong điều kiện in vitro là rất lý thú và mang lại rất nhiều triển
vọng”.
Hy vọng rằng các nghiên cứu về mặt sinh lý, sinh hoá và cơ chế phân tử của vi khuẩn dinh duỡng methyl tuơng tác với
thục vật sẽ đem lại những hiểu biết hơn về nguyên lý của mối quan hệ này đồng thời mở ra hướng ứng dụng mới của công
nghệ sinh học trong nông nghiệp ở điều kiện in vitro và in vivo.

26. 26
2.3 Các phu'0'ng pháp định danh vi sinh vật
Từ lâu thì việc định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh 11, sinh hóa của vi
sinh vật. Đồng thời, phưomg pháp sinh học phân tử giải ừình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến hành để cho
kết quả nhanh chóng và chính xác.
2.3.1 Phương pháp truyền thống
Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình
dạng tế bào. Mặc dù phưomg pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình
thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai ừò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong việc định danh các
chủng mới [1].
Phưomg pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: đặc điểm hình thái, sinh
lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan
trọng nhất [22].
g khóa phân loại
Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phưomg thức truyền thống, người ta thường dựa vào các
khóa phân loại, trong đó khóa phân loại Prokaryote đày đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân loại Bergey (Bergey ’s
Manual of Systematic Bacteriology) [3].
Riêng đối với nấm men việc định danh theo phưomg thức truyền thống rất phức tạp. Từ trước đến nay có rất nhiều khóa
phân loại nấm men của nhiều tác giả khác nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên. Trong khóa phân
loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau Hansen, Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh sữa
khóa phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện [2].
Đen năm 1952, J. Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá hoàn thiện vấn đề phân loại nấm men và xuất
bản một tài liệu rất có giá trị (J. Lodder and N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952, the yeast, a taxonomic study, North Holland, Pub Co.
Amsterdam), được xuất bản lần thứ hai năm 1957. Năm 1970, J. Lodder bổ sung sửa chữa lại và in tái bản làn thứ nhất năm
1970, lần thứ hai 1971. Đây là tài liệu phân loại nấm men rất có giá trị và và là khóa phân loại thông dụng nhất hiện nay trên
thế giới. Hệ thống phân loại này dựa trên kiểu phân chia tế bào, hình thái bào tử nang và đã xác định 349 loài nấm men thuộc
39 chi khác nhau [2].
❖ Sử dụng phương pháp số học
Ngoài ra, dựa vào những thông tin về đặc điểm của vi sinh vật, người ta còn có thể tính hệ số tương đồng để đánh giá
mức độ tương đồng giữa các chủng vi sinh vật. Trong đó hệ số laccard được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng giữa hai
chủng khi muốn bỏ qua các đặc điểm mà cả hai chủng đều thiếu [1].

27. 27
2.3.2 Phương pháp hiện đại
❖ Giới thiệu
Ngày nay, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát
triển mới. Phương pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một
thời gian ngắn. Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền [3].
Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thước
đo tiến hóa”.
Phân tử rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình tự đoạn D1/D2 26s rRNA và vùng ITS 5.8S
rRNA được sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi
sinh vật. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử rRNA 16S còn có ưu điểm là
có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc
trưng từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích họp với mục tiêu phân loại nhờ có kích thước vừa phải (khoảng 1500
ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự[l].
Phưomg pháp hiện đại dùng đế định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự
mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hom RNA.
Một số phưomg pháp phân loại dựa vào vật liệu di truyền đang được sử dụng hiện nay:
ng mẫu dò kết họp vói phưong pháp lai ỉn-stíu phát huỳnh quang (Fluorescence ỉn-sừu Hybridazation - FISH)
Mẩu dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đom của acid nucleic (DNA) được gắn với một nhân tố
nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang, dùng đế nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận diện) của một
chủng vi sinh vật đã biết trước.
Phân tích dữ liệu các trình tự ssu rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho phép xác định các trình tự nhận diện
chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự nhận diện cho một nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm chí một giống,
một loài cũng đã được xác định. Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được xác định và sẽ rất hữu dụng trong việc nhận
diện, định danh một vi sinh vật mới.
Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể được tổng họp, đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang và dùng để
phát hiện chuyên biệt các giới này. Các mẫu dò này được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại” (phylogenic prode).
Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác nhân thích họp làm tăng tính thấm của màng, cho phép mẫu dò vào
bên trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân tử {lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào mẫu), và quan sát dưới kính hiển
vi huỳnh quang, người ta có thể xác định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật hiện diện trong một mẫu
tự nhiên gồm những giới nào. Kỹ thuật lai và phát hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH). Phương

28. 28
pháp này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật.
háp lai nucleic acid [4]
Thành phần base của DNA chỉ có tác dụng chứng minh các vi khuẩn là không có liên hệ với nhau. Tỷ lệ các base trong
DNA có thể thay đổi trong phạm vi rất rộng. Nếu hai vi sinh vật có thảnh phần base khác nhau thì chúng không có liên hệ với
nhau. Tuy nhiên, hai vi khuẩn có cùng thảnh phần base chưa hẳn là có quan hệ với nhau do trình tự base có thể khác nhau. Việc
lai giữa các DNA của hai vi khuẩn cho phép định danh một loài mới hoặc xác định mối quan hệ đến mức giống và loài giữa hai
vi khuẩn.
Để xác định mối quan hệ giữa các chủng, thông thường người ta so sánh phần trăm lai (DNA-DNA) giữa chủng cần khảo
sát với một chủng đã biết (chủng chuẩn). DNA từ chủng chuẩn được ly trích, tinh chế, đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, phân
đoạn thành những đoạn ngắn có chiều dài ngẫu nhiên, đun nóng để tách mạch. DNA từ các chủng được khảo sát cũng được
chuẩn bị tưomg tự nhưng không được đánh dấu. Tiến hành lai mẫu DNA chủng chuẩn với nhau (đối chứng). Sau đó tuần tự lai
DNA chủng chuẩn với DNA chủng cần khảo sát. Thu lấy DNA mạch kép (có lai), loại bỏ DNA mạch đom. Đo năng lượng
phóng xạ của trường họp đối chứng. Lượng này được xem là tưomg đưomg 100% lai. Tưcmg tự tính năng lượng phóng xạ thu
được từ các trường họp lai giữa chủng chuẩn với chủng được khảo sát. Tính phàn trăm lai.
Từ số liệu về mức độ lai có thể xác định mối tưcmg quan giữa các chủng như
sau:
Trên 70% lai: 2 chủng cùng loài (khác chủng)
Trên 20% lai: 2 chủng cùng giống (khác loài)
Dưới 10% lai: 2 chủng khác giống
Lai nucleic acid dựa vào nguyên tắc bố sung giữa các base A-T và G-C. Các đoạn polynuclotide đom có nguồn gốc khác
nhau nhưng có cấu trúc bổ sung với nhau thì chúng có thể bắt cặp với nhau tạo ra phân tử lai.
Một số phương pháp lai nucleic acid thường được sử dụng:
Phương pháp lai Southern Blot
Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Rectriction Fragment Length polymorphism - RFLP) hay phưomg pháp
dấu vân tay (Finger Printing)
Phuomg pháp lai Northern Blot
❖ Khuếch đại trình tự đặc hiệu nhờ phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [12], [17]
Trước khi giải trình tự đoạn gen mong muốn, thì ta cần khuếch đại chúng bằng phương pháp PCR. PCR là một phương
pháp in vitro để tổng họp DNA từ mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của
khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ

29. 29
thuật này do Karl Mullis và ctv (Mỹ) phát minh năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra
các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm.
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng họp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch
khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy
định việc tổng họp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung
với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Khi
có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện
đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành một số lượng lớn bản sao
đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethibium bromide.
Kỹ thuật PCR được coi là nền tảng của nhiều kỹ thuật phân tích DNA.
❖ Giải trình tự các gen mã hóa cho tiểu phần rRNA 16S
Muốn nghhiên cứu trình tự các nucleotide của một gen, một đoạn DNA, hoặc cả phân đoạn DNA cần phải tiến hành giải
trình tự. Một số phương pháp giải trình tự thường dùng hiện nay:
Phương pháp hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert, 1977): Các đoạn DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ
ở dầu 5’, và được xử lý bằng các chất hóa học nhằm bẻ gãy các đoạn DNA tại các vị trí các base khác nhau.
Phương pháp dideoxy (Phương pháp Sanger,1977): dựa trên hoạt động của enzyme DNA Polymerase xúc tác phản ứng
kéo dài chuỗi polynucleotide, và dừng lại khi gặp các dideoxynucleotide (ddNTP).
Giải trình tự DNA tự động'. Dựa vào sự phát tín hiệu huỳnh quang từ những dNTP được đánh dấu. Ngoài ra, gần đây hai
kỹ thuật mới được thiết lập cũng được sử dụng để định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền là Ribotyping và FAME
(Fatty Acid Methyl Ester):
❖ Kỹ thuật Rỉbotyping
thuật này cũng phân tích ssu rRNA (nhưng không giải trình tự) giúp định danh vi sinh vật đến mức loài, dựa trên sự sai khác
trong trình tự nhận diện của các enzyme cắt giới hạn. Gen mã hóa cho ssu rRNA được khuếch đại bằng PCR, cắt bằng một
hoặc vài enzyme cắt giới hạn, tách bằng điện di và lai bằng các mẫu dò. Các vạch lai là chuyên biệt cho từng loài và chủng vi
sinh vật, được đưa vào cơ sở dữ liệu và được sử dụng như là các mã vạch để định danh vi sinh vật [].
❖ Kỹ thuật Fame (Fatty Acid Methyl Ester)
thuật này dựa trên tính chuyên biệt về chủng loại và thành phàn các acid béo hiện diện ừong màng tế bào vi khuẩn. Tính
chuyên biệt này là do sự đa dạng về chiều dài mạch, nhóm thế, vòng, hydroxyl, độ không bão hòa,.. .của acid béo trong màng.
Việc phân tích dẫn xuất methyl ester của các acid béo này ngày càng được dùng rộng rãi trong chuẩn đoán bệnh, dịch tễ học,
xét nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm... [4]

30. 30
Chương 3
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thòi gian và địa điểm
Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 03/2007 đến ngày 08/2007 Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực
nghiệm Sinh học và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu
3.2.1 Mầu thí nghiệm
Nguồn mẫu để phân lập vi sinh vật (VSV) kích thích tăng trưởng ở thực vật là mẫu lá, mẫu đất, mẫu nước tại Vườn quốc
gia Cát Tiên thuộc địa phận huyện Tân Phú, Tỉnh Đồng Nai vào tháng 4 năm 2007.
Chủng vi khuẩn chuẩn Methylobacteriưm extorquen JCM 2802T từ ngân hàng vi sinh vật Nhật Bản.
E. coli DH5a từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc Gia
Tp. HCM.
Cây thuốc lá (.Nicotiana tabacum L. cv Samsun) lấy từ Trại thực nghiệm Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Tp.HCM, cơ sở Linh Trung-Thủ Đức, sử dụng để khảo sát hoạt tính kích thích sự tăng trưởng thực vật của chủng vsv phân lập
được trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
Hạt đậu xanh (Vigna radiata L., công ty cổ phần giống cây trồng miền Nam - 282, Lê Văn Sĩ, Q.Tân Bình, Tp.HCM),
được sử dụng để khảo sát khả năng nảy mầm của hạt.
3.2.2 Thiết bị dụng cụ
> Bể ổn nhiệt (Fisfer Scientiíĩc)
> Bộ điện di ngang Mupid-EX (advance)
> Cân phân tích
> Eppendoií, micropippette, microplate (Nikko)
> Hộp soi đèn tử ngoại uv (Vilber Lourmat)
> Kính hiển vi
> Máy đo quang phổ (Gene Quantpro)
> Máy lắc tròn
> Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zantrifugen)
> Lò Microwave

31. 31
> Nồi hấp vô trùng autoclave
> Tủ ấm Prolabo
> Tủ cấy vô trùng
> Kính hiến vi huỳnh quang (Olympus)
Và một số dụng cụ cơ bản khác của phòng thí nghiệm sinh phân tử, vi sinh, nuôi cấy mô thực vật.
3.2.3 Hóa chất
3.2.3.1 Môi trường phân lập và làm thuần vỉ sinh vật biến dưỡng methyl MMS.
Môi trường muối khoáng MS chưa có Methanol (Phụ lục 1) sau khi hấp vô trùng ở nhiệt độ 121°c, áp suất 1 atm, để
nguội và bổ sung thêm 1% Methanol.
Đối với môi trường MMS rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng. Môi trường MMS không bổ sung
vitamine hay các yếu tố tăng trưởng khác
3.2.3.2 Môi trường chọn lọc vỉ sinh vật cố định nittf (MSo)
Môi trường khoáng MS trong đó loại bỏ một số thành phần khoáng chứa nitrogen.
Khoáng MS đã được thay thế (Phụ lục 1)
Đường 30g/l
Đối với môi trường rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng ở 121°c, áp suất 1 atm.
3.2.3.3 Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS)
Môi trường khoáng MS - Murashine & Skoog, 1962 (Phụ lục 3) bổ sung thêm:
Nước cất............................................................................vừa đủ 1L
3.2.3.4 Các môi trường khác
❖ Môi trường khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon của các chủng vỉ sinh vật phân lập được
Môi trường dịch thể MMS trong đó Methanol được thay thế bằng 1% các chất cung cấp nguồn carbon và bổ sung thêm
chất chỉ thị pH là bromothymol blue với nồng độ cuối là 0,04%.
Các chất cung cấp nguồn carbon bao gồm: acetate, betain, citrate, D-glucose, dimethylamine, ethanol, íructose, lactose,
L-Abrabinose, L-glutamate, maltose, methylamine, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, Nutrient agar.
❖ Môi trường YM broth
Quan sát hình thái nấm men
Nước cất............................................................................vừa đủ 1L

32. 32
❖ Môi trường acetate agar
Quan sát bào tử nấm men
Chất chỉ thị pH Bromothymol Blue...................................0,018g/l
Nước Cất............................................................................vừa đủ 1L
❖ Môi trường đồng hóa nitrogen
Khảo sát khả năng đồng hóa nitrate
Bacto Yeast Cacbon base ..................................................117g/l
Bổ sung thêm KNO3 (0,78%)
Nguồn Nitrogen được lọc vô trùng
❖ Một số hóa chất khác
Bộ kit nhuộm gram của hãng MERK (Đức)
Bộ kit 14 thử nghiệm sinh hóa dùng để định danh trực khuẩn Gram âm của công ty Nam Khoa
KOH 3% dùng để thử nghiệm String H202 30% dùng trong thử nghiệm Catalase
Glycerol để giữ giống vi sinh vật
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu về sinh học phân tử như: dung dịch CTAB 2X, TE 0.1X, TAE 2X,
Phenol:Chloroform (1:1), DEPC-H20, Tag DNA Polymerase, dNTP, Buffer 10X,...

33. 33
3.3 Phư<mg pháp thí nghiệm
ương pháp thực hiện được trình bài dưới bảng sau:
Sơ đồ 3.1: Qui trình thí nghiệm.
3.3.1 Phân lập và làm
thuần
Vi sinh vật hiện diện trong tự nhiên
ở các dạng quần xã gồm nhiều
quần thể. Việc nghiên cứu
một quần thể vsv nhất định (tập
họp các tế bào cùng loài) sẽ
phụ
uộc nhiều vào khả năng phân lập,
làm thuần tế bào của quần thể,
khả năng giữ giống dùng cho các
nghiên cứu tiếp theo. Hầu hết
các nghiên cứu đều thực hiện trên
chủng thuần.
Phần lớn các phương pháp
phân lập và làm thuần các
chủng vsv đều dựa trên một số kỹ
thuật pha loãng kết họp với điều
kiện nuôi cấy chọn lọc tạo ưu thế
cho chủng quan tâm. Theo
Green P.N. (1992), Methylobacterium sp. là những vi khuẩn có khả năng sử dụng Methanol làm nguồn carbon và năng
lượng, vì thế môi trường MMS (Methanol Minerol Salts) là môi trường thích họp để phân lập và làm thuần các chủng vsv
có khả năng sử dụng methanol.
Tuy nhiên, môi trường MMS chưa bổ sung Methanol có thành phần gần giống với môi trường MS (Murashine &
Skoog, 1962), vì vậy có thể sử dụng luôn môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) bổ sung thêm 1% Methanol làm môi
trường phân lập và làm thuần vsv.

34. 34
Mặc khác các chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ chúng tôi sử dụng môi trường MS (Murashine & Skoog,
1962) nhưng loại bỏ các thành phần có chứa nitơ (MSo).
3.3.1.1 Lấy mẫu và tăng sinh mẫu:
Các mẫu đất, nước, lá lấy từ khu vực rừng Bầu sấu thuộc vườn Quốc gia Cát
ên.
Mầu nước có thể trải trực tiếp trên môi trường MMS và MSo
Còn đối với mẫu đất và mẫu lá, tiến hành tăng sinh trên môi trường MMS, và MSo lỏng lắc 100 vòng/phút từ 2 đến 3
ngày.
3.3.1.2 Phân lập chọn lọc
Hút 100 pl mẫu (nước, đất, lá) từ từng môi trường chọn lọc và trải lên môi trường rắn MMS, MSo tương ứng, ủ ở
nhiệt độ 25-30°C. Sau 2-4 ngày quan sát và chọn tất cả các khuẩn lạc đơn đem đi làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần
liên tiếp (3-4 lần) trên đĩa môi trường rắn tương ứng.
3.3.1.3 Giữ giống
Sau khi thu được các chủng thuần đem tăng sinh trong môi trường CMS và giữ giống với Glycerol 35-50%, bảo
quản trong điều kiện -20°c.
3.3.2 Định tính
3.3.2.1 Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng vsv trong điều kiện in vừro và in vivo
sát trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962)
Mục đích:
Xác định khả năng kích thích sự tăng trưởng của thực vật của các chủng vi sinh vật phân lập được.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design), đom yếu tố, và gồm
46 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 làn lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 5 mẫu. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại.
Vật liệu:
Các chửng vi sinh vật phân lập được trên môi trường MMS + 1% methanol, tăng sinh trên môi trường CMS sau 4
ngày.
Chồi ngủ thuốc lá Nicotiana tabacum 2 tuần tuổi được nuôi cấy in vitro. Phương pháp:
Chồi thuốc lá được cắt sao cho đồng nhất là 2 cm ngâm vào trong dịch vi sinh vật (trừ mẫu đối chứng) trong 5 phút,
sau đó cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường MS.
Điều kiện nuôi cấy:

35. 35
Nhiệt độ: 24 ± 2°c Thời gian chiếu sáng: 16h Cường độ ánh sáng: 2000-
3000 lux Ẩm độ: 55%-60%
Chỉ tiêu ghi nhận:
Sau 14 ngày nuôi cấy kết quả được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng và có bổ sung theo các chỉ tiêu sau :
Độ tăng chiều cao (mm) và độ tăng trọng lượng tươi (mg) của chồi: là hiệu của chiều cao, trọng lượng tươi chồi
thuốc lá sau 14 ngày thí nghiệm (chồi được lấy ra khỏi ống nghiệm để đo) với chiều cao chồi ban đầu khi cấy vô ống
nghiệm
Trọng lượng khô (mg): chồi cây sau khi đo trọng lượng tươi được sấy khô ở nhiệt độ từ 45 - 50°c sau 12h và cân.
Chiều dài rễ: chồi thuốc lá sau 14 ngày được lấy ra khỏi ống nghiệm tiến hành đo chiều dài rễ (mm)
Khảo sát trên môi trường MS không nỉttf (MSo)❖
Mục đích: Xác định khả năng kích thích sự tăng trưởng của thực vật của các chủng vsv phân lập được trên môi
trường không nitơ.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design), đơn yếu tố, và gồm
31 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 lần lặp lại, mỗi làn lặp lại gồm 5 mẫu. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại.
Vật liệu:
Các chủng vi sinh vật phân lập được từ môi trường MSo tăng sinh trên môi trường CMS sau 4 ngày.
Chồi thuốc lá Nicotiana tabacum được nuôi cấy trong 2 tuần Môi trường MSo được giảm lượng đường (5 g/1) nhằm hạn
chế sự phát triễn vượt mức của các chủng vi khuẩn phân lập được.
Điều kiện nuôi cấy:
Nhiệt độ: 24 ± 2°c Thời gian chiếu sáng: 16h Cường độ ánh sáng: 2000-
3000 lux Ẩm độ: 55%-60%
Phưo'ng pháp:
Dịch khuẩn được đem đi đo OD6i0nm để xác định mật độ tế bào.
Chồi cây thuốc lá được ngâm vào trong dịch vsv (trừ mẫu đối chứng) trong 5 phút, sau đó cấy vào các ống nghiệm chứa
môi trường MSo- Chỉ tiêu ghi nhận:
Sau 14 ngày nuôi cấy kết quả được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng và có bổ sung theo các chỉ tiêu sau (Phương
pháp ghi nhận chỉ tiêu giống như thí nghiệm khảo sát trên môi trường MS):
Độ tăng chiều cao chồi (mm)
Độ tăng trọng lượng tươi (mg)

36. 36
Trọng lượng khô (mg)
Chiều dài rễ (mm)
Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống trong điều kiện❖ in
vivo
Mục đích: Xác định khả năng tương tác kích thích sự sinh trưởng ở thực vật Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 76 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lặp lại
3 lần, mỗi lần 100 hạt. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại.
Vật liệu:
Sinh khối vsv được thu nhận sau 4 ngày nuôi cấy Hạt giống đậu xanh
Giá thể: cát được rửa sạch và hấp vô trùng cho vào các khay nhựa.
Phưong pháp
Dịch vi khuẩn đem đi đo OD6i0nm để xác định mật độ tế bào, sau đó ly tâm thu sinh khối.
ủ hạt (100hạt/50ml dịch khuẩn) với sinh khối vi khuẩn trong 1 giờ, sau đó đặt chuyển sang các khay nhựa chứa giá
thể cát. Đối chứng được thực hiện tương tự với nước cất. Các khay nhựa được ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 48-60 giờ ghi nhận
tỷ lệ nảy mầm của hạt so với đối chứng.
Chỉ tiêu ghi nhận
Tỉ lệ nảy mầm của hạt giống.
3.3.2.2 Xử lý thống kê
Số liệu thu được từ các thí nghiệm trên được xử lý thống kê bằng phàn mềm Stagraphic 7.0
3.3.2.3 Quan sát hình thái
Mục tiêu: xác định hình đạng tế bào, khuẩn lạc, trên cơ sở đó sơ bộ phân chia các nhóm vi sinh vật tạo điều kiện thuận
lợi cho quá trình định danh Tiến hành:
Quan sát sự phát triển và hình dạng của khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MMS, CMS, nhằm ghi nhận hình
dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc.
Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi ở vật kính 40x. Ghi nhận đặc điểm về hình thái của vi sinh vật như hình dạng kích
thước, tế bào, hình thức sinh sản.
3.3.3Định danh vi khuẩn
Sau khi nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc, chúng ta có thể thu được các khuẩn lạc đơn thuần khiết, còn gọi là
“chủng thuần”. Chủng thuần là yêu cầu cần cho việc định danh các vi sinh vật. Việc định danh này được thực hiện dựa trên
các đặc điểm về kiểu hình, cùng với các đặc tính sinh lý, sinh hóa cũng như khả năng biến dưỡng một số cơ chất của các

37. 37
chủng vi sinh vật phân lập được, trong đó quan trọng nhất là các thử nghiệm sinh hóa.
Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa *l* Đặc điểm hình thái
> Đo kích thước tế bào
Sau khi nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm Crytal Violet, quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, sử dụng kính trắc vi thị
kính, vật kính để đo kích thước tế bào.
> Thử nghiệm gram
Phương pháp nhuộm Gram
Thực hiện theo phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu
Crystal Violet trên thành tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn. Vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo
i peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crytal Violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử bởi cồn, do
đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đàu. Còn vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hom (do có ít peptidoglycan
hom), nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban
đầu, tế bào không màu lại bắt với màu hồng đỏ của thuốc nhuộm Fuschin.
Như vậy, sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ; còn vi khuẩn Gram dưomg có màu tím.
Các bước thực hiện:
- Nhỏ sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường CMS lên lam kính sạch (nếu mật độ vi khuẩn quá dày đặc thì có thể
pha loãng ra) cố đđịnh tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đđèn cồn.
- Ngoài ra, ta cũng có thể sử dụng que cấy thu khuẩn lạc đom từ đìa môi trường CMS, dàn đều lên giọt nước trên lam
kính sạch.
- Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím tinh thế (Crystal Violet) trong 3 phút, rửa lại bằng nước.
- Nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước.
- Rửa mẫu bằng ethanol 95%: aceton (1:1) trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước.
- Nhuộm tiếp mẫu bằng dung dịch Fuschin Ziehl trong 30-60 giây, rửa lại bằng nước. Đe khô, quan sát sự bắt màu của
vi khuẩn dưới kính hiển vi.
Phương pháp string test:
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng tạo nhầy (kéo sợi) giữa sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng
của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuẩn Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy (kéo sợi)
String dưomg (vi khuẩn Gram âm) khi có kéo sợi, còn String âm (vi khuẩn Gram dưomg) khi không có kéo sợi.
Thực hiện:
Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên đĩa môi trường CMS trải lên giọt dung dịch KOH 3% trên lam

38. 38
kính sạch (sinh khối càng nhiều thì hiện tượng quan sát càng rõ). Ghi nhận khả năng kéo sợi của vi khuẩn.
Khả năng di động
Nguyên tắc: vi khuẩn có thể di động nhờ cấu trúc protein, gọi là tiên mao (ílagella). Đây có thể là một trong những
căn cứ có thể dùng để phân biệt các vi sinh vật
Thực hiện: Có thể ghi nhận khả năng di động của vi khuẩn bằng 2 phưorng
áp:
- Phương pháp 1: Thử nghiệm trong môi trường thạch mềm LDC (bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR). Neu vi
khuẩn mọc theo đường cấy và lan ra cả bên ngoài đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động. Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ
mọc theo đường cấy mà không lan ra ngoài thi không có khả năng di động. Tuy nhiên, hiện tượng quan sát được không rõ,
vi vậy cần tiến hành thí nghiệm 2.
- Phương pháp 2: quan sát các tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi: dàn đều sinh khối vi khuẩn lên giọt nước trên lam
kính sạch, và quan sát sự di động của tế bào vi khuẩn.
3.3.3.2 Đặc điểm sinh lý
nh đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật độ tế bào
Mục đích: làm cơ sở để xác định mật độ tế bào cho các thí nghiệm sau này dựa trên nồng độ OD610nm (xác định
gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục).
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền
phù và có độ đục bởi sự hiện diện của các phần tử ừong môi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng
tới. Do vậy tế bào khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục, độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ
tế bào. Trong một giới hạn nhất định của của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa
mật độ tế bào và độ đục [3].
Thực hiện:
Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường CMS lỏng sau đó đem đi pha loãng và đo ODgionm để được các nồng độ từ 0,1
đến 1,0.
Từ các nồng độ OD610nm tiến hành pha loãng bậc 10. Tùy nồng độ OD mà có thể pha loãng từ 10'3 đến 10'12, từ
mỗi nồng độ OD610nm chọn ra 3 độ pha loãng trải 0,1 ml lên đĩa môi trường CMS. ủ 25-30°C trong 2-3 ngày, và đếm số
khuẩn lạc phát triển trên đĩa (trong khoảng từ 25-300 khuẩn lạc).
Tính số lượng tế bào trong 1 ml môi trường:
Nị=A xio X di
Trong đó: Ni: số lượng tế bào ở độ pha loãng dị

39. 39
A : Số khuẩn lạc đếm được trên đĩa di: Độ pha loãng
Dựng đường tưomg quan tuyến tính giữa ODgionm và logN/ml bằng phần mềm Excel.
❖ Xác định đường cong tăng trưởng
Mục đích: Nhằm xác định thời gian thích họp để thu sinh khối vi khuẩn.
Thực hiện:
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 25-30°C và tiến hành đo OD610nm 4giờ/làn trong vòng 60 giờ.
❖ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Mục đích: xác định nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn. Thực hiện: dựa vào 2 phương pháp
Phưưng pháp 1: cấy vi khuẩn lên các đĩa môi trường rắn CMS, ủ ở các nhiệt độ khác nhau 20,25, 30, 35,40°c, sau
3- 4 ngày ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc.
Phương pháp 2: cấy vi khuẩn ừong các ống nghiệm chứa môi trường CMS lỏng, nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau
20, 25, 30, 35, 40, 45, 50°c trong 3 ngày và do ODgiOnm
Dựa vào đường tương quan tuyến tính suy ra mật độ tế bào.
❖ Khảo sát ảnh hưởng của pH
Mục đích: xác định độ pH tối ưu cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn.
Thực hiện:
Cấy vi khuẩn trong các ống nghiệm chứa môi trường CMS lỏng ở các độ pH từ 4,0-9,0 (cách nhau 0,5), nuôi cấy lắc
100 vòng/phút, sau 3 ngày ghi nhận nồng độ ODgiOnm'
Dựa vào đường quan tuyến tính suy ra mật độ tế bào.
Đặc điểm sinh hóa ♦> Khảo sát hoạt tính Catalase
Nguyền tắc: Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme
catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có
khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo
H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2Ơ và giải phóng 02, gây hiện tượng sủi bọt khí.
Thực hiện: Nhỏ vài giọt H2O2 lên khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển trên bề mặt thạch. Quan sát và ghi nhận hiện
tượng sủi bọt khí.
❖ Khảo sát hoạt tính Oxydase
Nguyên tắc: Cytochrome Oxydase là thành phần quan trọng trong chuỗi chuyển điện tử hô hấp, với O2 là chất nhận
điện tử cuối cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Hoạt tính này được phát hiện nhờ
thuốc thử p-phenylenediamine bị oxy hóa thành họp chất indolphenol có màu xanh dương.
Thực hiện: dàn đều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine
dihydrochloride (TMPD). Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương sau vài phút.

40. 40
❖ Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn Carbon
Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng nguồn cung cấp carbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra
các chất làm thay đổi pH môi trường. Do khi sử dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn
carbon của vi khuẩn được ghi nhận bằng sự đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn.
Môi trường trung tính có màu xanh lá cây, môi trường acid có màu vàng, còn môi trường kiềm có màu xanh dương.
Thực hiện:
Chất cung cấp nguồn Carbon: acetate, betain, citrate, D-glucose, dimethylamine, ethanol, íructose, lactose, L-
Abrabinose, L-glutamate, maltose, methylamine, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, Nutrient agar.
Chất chỉ thị: bromothymol blue 0,04%.
Pha môi trường khoáng MS và 2ml/l chất chỉ thị pH trong nhiều erlen khác nhau rồi hấp vô trùng, trong mỗi erlen bổ
sung thêm 1% chất cung cấp nguồn Carbon bằng cách lọc vô trùng, chỉnh pH môi trường về pH =7. Bơm vào từng giếng
của Microplate lml môi trường, đối với mỗi chất cung cấp carbon có thể sử dụng nhiều giếng khác nhau trong đó có 1
giếng đối chứng, cấy 20pl dịch vi khuẩn vào các giếng của Microplate, trừ giếng đối chứng.
ủ ở 25-30°C trong 4-5 ngày và đọc kết quả: đặt microplate lên tờ giấy trắng. Phản ứng dương tính khi môi trường đối
màu so với đối chứng (màu xanh lá cây).
Các thử nghiệm trong bộ sinh hóa IDS 14GNR❖
IDS 14GNR là bộ kit 14 thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn Gram âm, được công ty Nam Khoa sản xuất
nhằm giúp cho việc định danh các trực khuẩn Gram âm được nhanh chóng và dễ dàng hơn.
Các thử nghiệm trong bộ kit IDS 14GNR bao gồm:
Thử nghiệm lên men Glucose: các vi sinh vật có khả năng lên men đường Glucose sẽ tạo ra các sản phẩm có tính
acid, làm thay đổi màu của chất chỉ thị bramothymol blue.
Thử nghiệm khử nitrate: dựa trên sự tạo thành nitrite và cạn kiệt nitrate. Nitrite được tạo thành từ nitrate sẽ phản
ứng với thuốc thử sulphanilamide và N- napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho họp chất có màu hồng đỏ. Ở
một số trường họp phản ứng không rõ, cần kiểm chứng lại sự cạn kiệt nitrate bằng bụi kẽm kim loại.
Thử nghiệm ONPG: Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự hiện diện của gen mã hóa enzyme Ị3-galactosidase
trong tế bào. Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định dựa vào cơ chất tổng họp o-nitrophenyl-D-galactopyranoside
(ONPG). Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi |3-galactosidase sẽ phóng thích o-nitrophenol có màu vàng.
Thử nghiệm urease: dựa trên khả năng tổng họp enzyme urease, xúc tác sự thủy phân urea, giải phỏng NH3 và C02,
làm tăng pH của môi trường, làm đổi màu chất chỉ thị Phenol-Red. Phản ứng (+) khi có màu đỏ cánh sen.
Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate: sự biến dưỡng citrate bởi vỉ sinh vật sẽ tạo ra C02, đồng thời phân giải

41. 41
muối ammonium, sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường, làm đổi màu của chất chỉ thị bromothymol blue.
Thử nghiệm Bile Esculin: dựa trên khả năng thủy phân glucoside trong esculin thành esculetin và glucose khi có sự
hiện diện của muối mật. Esculetin phản ứng muối sắt trong môi trường tạo thành phức chất có màu đen hay màu nâu đen.
Thử nghiệm khả năng sinh H2S: dựa ừên khả năng khử họp chất Sodium thiosulphate có trong môi trường để giải
phóng H2S. Khí H2S tạo ra được phát hiện dựa vào phản ứng kết tủa màu đen FeS giữa H2S với ion Fe2+ của chất chỉ thị
Ferric ammonium citrate.
Thử nghiệm khả năng sinh Indole: Tryptophan là một acỉd amỉne có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ
enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân
tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminpobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết
họp với nhân benzen của p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ.
Thử nghiệm V-P (Voges-Proskauer): ừong điều kiện có oxy và pH kiềm, 2,3-butanediol bị chuyển hóa thành
acetonin, và acetonin tiếp tục bị oxy hóa thành
cetyl dưới sự xúc tác của a-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine
có màu đỏ.
Thử nghiệm khả năng biến dưỡng Malonate: Các vỉ sinh có khả năng biến dưỡng manolate đồng thời có khả năng
sử dụng ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự tăng trưởng của vi sinh vật ừên môi trường chứa Manolate làm nguồn
carbon duy nhất sẽ kéo theo việc sử dụng nguồn đạm này, làm phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường. Do vậy khả
năng biến dưỡng manolate có thể được nhận thấy bằng sự chuyển màu của chất chỉ thị bromothymol blue trong môi
trường.
Thử nghiệm LDC (Lysine decarboxylase): Phản ứng được xúc tác bởi LDC sẽ loại bỏ C02 ra khỏi lysine, CO2
sinh ra sẽ làm tăng pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH (bromocresol purple).
Thực hiện:
Tạo dịch huyền phù sinh khối vi khuẩn trong 3-5ml nước cất, hoặc nước muối sinh lý vô trùng (pha càng đục càng
tốt)
Bom 200 pl dịch vi khuẩn vào các giếng của khay nhựa. Đối với ống LDC, dùng que cấy vô trùng nhúng vào dịch vi
khuẩn, sau đó cắm vào ống môi trường, dán miệng ống lại.
Đem tất cả đi ủ ở nhiệt độ 25-30°C trong 2-3 ngày, bổ sung thêm thuốc thử (nếu cần) và đọc kết quả theo bảng 3.

42. 1Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR
stt
Phản ứng sinh hóa
Thuốc thử Dương tính Ảm tính
1 Lên men glucose Không Vàng Tím
2 Khử Nitrate 1 Đĩa giấy tim nitrate Đỏ Vàng lợt
3 Galactosidase Không Vàng Không màu
4 Urease Không Đỏ cánh sen Đỏ nhạt/vàng
5 PDA 1 giọt FeCl3 Xanh lá đậm Vàng lợt
6 Citrate Không Xanh biển Xanh lá/vàng
7 Esculin Không Đen Không đen
8 Sinh H2S Không Đen Không đen
9 Sinh Indole Kovac Đỏ Không đổi màu
10
Voges-Poskauer 1 giọt KOH,
1 giọt Napthanol
Đỏ Vàng nhạt
11 Sử dụng Malonate Không Xanh biển Vàng/xanh lá
12 Oxydase Không Xanh dưomg Không đổi màu
13 LDC Không Tím Vàng
14
MOT (di động) Không Nhòe đường cấy
Không nhòe đường cấy
Khảo sát khả năng cố định đạm❖
Dreyíus (1988) và Abdoulaye Sy (2001) đã chứng minh rằng ở một số loài
Methylobacterium sp. có khả năng cố định đạm nhờ sự hiện diện của một số gen (gen
niflỉ và gen nođ) có vai trò tưomg tự như gen cố định đạm ở Rhizobium. Năm 2006,
Raja cũng đã chứng minh được 11 chủng Methylobacterium sp. có khả năng phát
triển trên môi trường khoáng MS không nitrogen, trong đó có 1 chủng chỉ có sự hiện
diện của gen nịỷH mà không có gen nod (gen tạo nốt sần ở rễ cây). Vì thế, chúng tôi
xem xét khả năng cố định đạm của các chủng phân lập được.
Phưong pháp: cấy vi khuẩn lên các erlen chứa môi trường dịch thể NMS có bổ

43. sung chất chỉ thị màu bromothymol blue 0,04%, nuôi cấy lắc 100 vòng/phút ở nhiệt
độ 25-30°C. Sau 4-5 ngày ghi nhận sự đổi màu của môi trường so với đối chứng.
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp PHB❖
PHB (poly-beta-hydroxybutyrate) là nguồn carbon dự trữ ở vi khuẩn
Methylobacterium. PHB là một polymer chịu nhiệt có kha năng phân hủy sinh học. Vì
thế, việc định tính sự tích lũy PHB không những cần thiết cho mục tiêu phân loại mà
còn đánh giá tiềm năng sử dụng thu nhận PHB chủng vi khuẩn mới phân lập được [1]
Mục đích: Định tính khả năng sinh tống họp PHB của các chủng phân lập được.
Nguyên tắc: Sử dụng phẩm nhuộm chuyên biệt Nile Blue A để ghi nhận sự hiện diện các
hạt PHB trong tế bào vi khuẩn phân lập được. Với thuốc thử này, các hạt PHB ừong tế bào
sẽ bắt màu cam sáng trên nền tế bào màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi phát huỳnh
quang ở bước sóng 460nm.
Vật liệu:
- Sinh khối của 2 chủng vi khuẩn phân lập được.
- Phẩm nhuộm Nile Blue A
- Dung dịch acid acetic 8%
Thực hiện:
Lấy 1-2 giọt huyền phù sinh khối vi khuẩn, đặt lên tấm lam sạch, hơ qua ngọn
lửa nhiều làn để cố định tế bào hên lam.
Nhuộm tế bào đã cố định bằng 1 giọt phẩm nhuộm Nile Blue A trong 15 phút
ở 55°c.
Rửa sạch phẩm thừa bằng nước cất, sau đó rửa lại 1 lần nữa bằng acid acetic
trong 1 phút. Dùng giấy thấm lau khô mẫu, cho 1 giọt nước lên lam, đậy lamen lại.
Quan sát sự bắt màu cam sáng của các hạt PHB bong tế bào vi khuẩn đã được xử lý
màu dưới kính hiển vi phát huỳnh quang ở bước sóng 460nm.
3.3.3.4 So sánh tính tưtfng đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard (Sj)
Hệ số tương đồng laccard (Sj) cho phép xác định mức độ tương đồng của hai loài vi
khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của chủng vi khuẩn phân lập được
với các loài được công bố thì việc tính toán giá trị hệ số Sj là cần thiết. Hệ số Sj được

44. tính theo công thức:
Sj= a/(a+b)
a: tổng số các đặc điểm tương đồng ở hai loài b: tổng số
đặc điểm khác biệt ở hai loài Giá trị của hệ số Sj nằm trong khoảng 0-1 (0-
100%). Nếu 2 loài có hệ số Sj >0,8 (80%) thì có khả năng thuộc cùng một loài.
3.3.3.5 Phân tích trình tự rDNA 16S Tách❖
chiết DNA
Mục đích: Thu nhận DNA bộ gen của các chủng phân lập được.
Thực hiện: theo quy trình tách chiết DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. [1].
- Ly tâm thu sinh khối
- Bổ sung 600pl CTAB nóng, đem vortex thật kỹ, ủ ở 65°c trong 60 phút, để cho
CTAB phá màng tế bào hoàn toàn.
- Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút.
- Thu dịch nổi, biến tính lần 1 bằng 500pl phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ.
- Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút.
- Thu dịch nổi, biến tính lần 2 bằng 500pl phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ.
- Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút.
- Thu dịch nổi, tủa bằng lml ethanol tuyệt đối lạnh.
- Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ 4°c trong 5 phút.
- Rửa lại tủa bằng 500pl cồn 70°c.
- Phơi mẫu cho khô cồn.
- Hòa tan tủa trong 20pl dung dịch TE 0,1X.
- Bổ sung 2pl dung dịch RNAse (lmg/ml), ủ 37°c bong 60 phút.
- Bảo quản ở nhiệt độ 4°c.
- Sản phẩm DNA bộ gen được đánh giá thông qua điện di qua gel agarose 1%, đo
nồng độ và xác định độ tinh sạch qua tỷ số OD260nm/OD280nm-
Khuếch đại trình tự rDNA 16S bằng phản ứng PCR❖
Để có thể định danh một cách chính xác các chủng vi khuẩn phân lập được ở

45. mức độ loài thì gần như toàn bộ thông tin về trình tự DNA mã hóa cho phân tử rDNA
16S phải được biết thật đầy đủ. Vì thế cần tiến hành các phản ứng PCR để khuếch đại
toàn bộ trình tự rDNA 16S từ khuôn là DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn thu nhận
được ở trên. Các phản ứng PCR được thực hiện với các mồi khác nhau, bao gồm:
Cặp mồi 2F (5’ GAT CGG ccc GCG TCT GAT TAG 3’) và 2R (5’ CCG TCA
TTA TCG TCC CGG ACA 3’) đã được Nishio T, và cộng sự (1997) sử dụng trong
định danh cho chi Methylobacterium.
Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn phân lập
được với các cặp mồi:
27F : 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
1525R: 5 ’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3 ’
520F: 5 ’-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3 ’
920F: 5 ’-AAACTCAAATGAATTGACGG-3 ’
520R: 5 ’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3 ’
920R: 5 ’-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3 ’
Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại trình tự rDNA 16S bao gồm:
DEPC-H20...............................................................................vừa đủ 25pl
Thực hiện các phản ứng PCR:
- Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp
mồi (2F, 2R), với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234 bp.
- Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn phân lập
được với cặp mồi (27F-1525R).
- Tinh chế: sử dụng bộ kit tinh chế sản phẩm PCR của hãng Bio Basic, Canada.
- PCR với các cặp mồi bên trong để kiểm chứng sự bắt cặp chuyên biệt của các
cặp mồi trong. Vì kích thước sản phẩm PCR bằng cặp mồi (27F, 1525R) là 1500 Nu
là rất lớn. Khó giải trình tự một cách chính xác theo phưomg pháp giải trình tự trực
tiếp từ phản ứng PCR nên phải sử dụng các cặp mồi bên trong. Mục tiêu của các phản
ứng PCR này là chứng minh cặp mồi (520F, 920R) có khả năng bắt cặp với trình tự

46. rDNA 16S của vi khuẩn mục tiêu.
- Các phản ứng PCR được thực hiện với cùng một chu trình nhiệt như sau:
- C
ác sản
phẩm
PCR
sẽ
được điện di trên gel agarose 2% ở điện thế 50V trong 40 phút. Sau đó nhuộm bằng
ethidium bromide trong 45 phút, và xem kết quả dưới đèn
uv.
- Những sản phẩm tốt sẽ được gửi đi giải trình tự (Macrogen, Hàn Quốc) để có
thể định danh chính xác đến mức độ loài.
Phân tích trình tự rDNA 16S.❖
Kết quả giải trình tự (phụ lục) sẽ được xử lý bằng phần mềm fast PCR để tạo
ra các trình tự rDNA nguyên vẹn của mỗi chủng vi khuẩn. Trình tự rDNA 16S nguyên
vẹn này sẽ được so sánh với các trình tự DNA của các chủng vi khuẩn khác trên ngân
hàng dữ liệu NCBI bằng phàm mềm BLAST. Trình tự của chủng khảo sát và các
chủng chuẩn được sắp gióng cột bằng chương trình CLUSTAL X phiên bản 1.81. Cây
phát sinh loài được bằng phương pháp neighbor-joining trong chương trình MEGA
phiên bản 2.1 với 1000 lần lặp lại.
3.3.4 Định danh nấm men
3.3.4.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men
*l* Hình thái của tế bào sinh dưỡng
Sau khi phân lập và làm thuần chúng ta cần kiểm tra các đặc điểm hình thái của
tế bào nấm men qua các đặc điểm về hình dạng, kích thước và kiểu sinh sản.
Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như: hình tròn, hình trứng, hình
bầu dục, hình que...

47. về kích thước, nấm men là tế bào có kích thước lớn, lớn hơn tế bào vi khuẩn 5-
10 lần. Tế bào nấm men thường có chiều dài 9-lOp.m, chiều rộng 2-7pm
Cách thực hiện:
Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường YM Broth ở nhiệt độ phòng, khoảng
24-48 giờ
Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, chú ý các đặc điểm về hình dạng
kích thước kiểu sinh sản, tế bào thường ở dạng đôi hay tạo chùm.
*l* Hình thái của khuẩn ty giả
Ở một số loài nấm men, chồi trương thành không tách ra khoải tế bào mẹ mà
tạo thành một chuổi tế bào gọi là khuẩn ty giả. Rất khó để phân biệt giữa khuẩn ty giả
và khuẩn ty thật, để phân biệt có thể dựa vào cách quan sát tế bào cuối cùng của
chúng. Khuẩn ty thật có độ khúc xạ và tế bào cuối cùng thường dài hơn tế bào cạnh
nó, còn khuẩn ty giả không có độ khúc xạ, không thấy rõ vách ngăn giữa các tế bào
(giả đốt) và tế bào cuối cùng thường ngắn hơn tế bào cạnh nó.
Sự hình thành khuẩn ty giả ở nấm men là do tác động của điều kiện môi trường
nghèo dinh dưỡng, thiếu oxy...
Cách thực hiện: (Phưomg pháp Dalmau).
- Trước tiên cần chuẩn bị lame, lamelle, đĩa Petri có giấy lọc ở dưới và một thanh chữ
u ở dưới đem hấp vô trùng.
- Hút nước đã hấp vô trùng bơm lên giấy lọc để giữ cho môi trường trong đĩa
petri không bị khô.
- Hút môi trường PDA đã hấp khử trùng và đã làm tan, trải trên miếng lame
- Dùng que cấy thẳng ria một đường lên miếng lame và đặt miếng lamelle lên chỗ vừa
cấy cho thật kín.
- Đem ủ ở nhiệt độ phòng, bổ sung nước cất vô trùng 3 ngày/lần đề tránh môi trường
thạch bị mất nước.
Kết quả: quan sát khuẩn ty giả dưới kính hiển vi.
❖ Hình thái bào tử nang
Bào tử nang của các loại nấm men rất khác nhau về số lượng bào tử trong nang,

48. hình dạng, màu sắc, kích thước. Sự hình thành bào tử nang thường được cảm ứng bởi
môi trường ức chế sự phát triển dinh dưỡng .
Cách thực hiện:
Cấy giống đã hoạt hóa vào môi trường Acetate agar và ủ ở nhiệt độ phòng trong
3 tuần.
Quan sát nang bào tử dưới kính hiến vi
3.3.4.2 Xác định một số đặc tính sinh hóa của nấm men
❖ Khả năng lên men Glucose
Lên men glucose là một trong những yếu tố quan trọng để bước đầu định danh
nấm men đến giống. Quá trình lên men có thể sinh khí hay không sinh khí, có thể tạo
acid hay tạo ethanol. Muốn xác định khả năng lên men cần xác định các yếu tố sau:
Khả năng sử dụng Glucose (màu môi trường có thay đổi)
Khả năng tạo ethanol (hình thành phức chất màu vàng với tinh thể iode trong điều
kiện kiềm)
Khả năng sinh khí (sự xuất hiện bọt khí trong ống Durham)
Cách thực hiện:
- Hút 2ml môi trường cơ bản vào ống nghiệm loại nhỏ có chứa ống Durham đã lấy hết
khí ra đem hấp khử trùng ở 121 °c trong 15 phút.
- Hút lml dung dịch đường Glucose đã lọc vô trùng trong điều kiện vô trùng.
- Cấy giống và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày kiểm tra 12 tiếng/lần
Kết quả: Sinh khí: (+) có khí trong ống Duharm
(-) không có khí trong ống Durham Sinh
ethanol: (+) hình thành tinh thể màu vàng
(-) không hình thành tinh thể vàng với Ỉ2
❖ Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon
Kiểm tra đặc tính đồng hóa các nguồn cacbon là kiểm tra khả năng phát triển
của nấm men hên môi trường chỉ chứa một nguồn cacbon như là nguồn năng lượng
duy nhất. Thử nghiệm này có thể được thực hiện trên môi trường rắn hay lỏng. Tuy
nhiên môi trường lỏng thường được sử dụng nhiều hom.

49. Các nguồn carbon được khảo sát bao gồm: beatin, citrate, D-glucose, íructose,
lactose, L-glutamate, maltose, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, tartrate.
Thực hiện: các bước thí nghiệm được thực hiện như thí nghiệm khảo sát khả
năng đồng hóa các nguồn cacbon của vi khuẩn Kết quả:
Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng (màu xanh lá
cây).
❖ Khả năng đồng hóa Nitrat
Nấm men có khả năng sử dụng các nguồn nitrogen. Khả năng sử dụng nguồn
nitrate là một tiêu chuẩn quan trọng trong việc định danh một số giống.
Cách thực hiện:
- Hút vào ống nghiệm nhỏ lml môi trường Bacto Yeast Cacbon base có bổ sung
chất chỉ thị màu Bromothymol Blue 2ml, hấp khử trùng ở 121°c trong 15 phút.
Nguồn nitrogen KNO3 được bổ sung bằng cách lọc vô trùng.
- Bơm vào từng giếng của Microplate lml môi trường, cấy 20pl dịch nấm men
vào các giếng của Microplate, trừ giếng đối chứng.
- ủ ở 25-30°C trong 4-5 ngày và đọc kết quả: đặt microplate lên tờ giấy trắng.
Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng
Tổng hợp các đặc điễm và định danh❖