La micropropagación de yemas es la técnica de cultivo in vitro más utilizada para la propagación obtención de plantas libres de agentes patógenos que causan enfermedades. El propósito de este trabajo es propagar plantas sanas mediante el cultivo de yemas aislados de Café (Coffea arabica). El medio utilizado fue el MS enriquecido con 2 mg/L de BAP y 0,05 mg/L de AIA. Los explantes se desinfectaron con detergente al 2% + Tween 20 durante 20 minutos y posteriormente con cloro al 2% igualmente con Tween 20 durante 10 minutos, además se agregó dos fungicidas: Carbendazim que es un fungicida de sistémico de rápida penetración y Captan que es un fungicida de contacto. Los resultados mostraron contaminación de los cultivos y una viabilidad de los explantes de un 25%.
1. Cultivo in vitro (micropropagación) de yemas de Café
(Coffeaarabica).
Establecimiento in vitro de meristemos de Café (Coffea arabica) a partir de esquejes.
Ayala Paola
Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Cultivo de Tejidos Vegetales
Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Sangolquí - Ecuador.
Noviembre, 2013
RESUMEN
La micropropagación de yemas es la técnica de cultivo in vitro más utilizada para la
propagación obtención de plantas libres de agentes patógenos que causan enfermedades.
El propósito de este trabajo es propagar plantas sanas mediante el cultivo de yemas
aislados deCafé (Coffea arabica). El medio utilizado fue el MS enriquecido con 2 mg/L de
BAP y 0,05 mg/L de AIA. Los explantes se desinfectaron con detergente al 2% + Tween 20
durante 20 minutos y posteriormente con cloro al 2% igualmente con Tween 20 durante 10
minutos, además se agregó dos fungicidas: Carbendazimque es un fungicida de sistémico
de rápida penetración y Captan que es un fungicida de contacto. Los resultados mostraron
contaminación de los cultivos y una viabilidad de los explantes de un 25%.
Palabras clave:Propagación, yemas, Coffeaarabica y cultivo in vitro.
ABSTRACT
The buds micropropagation technique is the most widely used in vitro culture for obtaining
free plants spread of pathogens that cause disease. The purpose of this paper is to
propagate healthy plants by meristem culture isolated from coffee (Coffeaarabica). The
medium used was MS supplemented with 2 mg / L BAP and 0.05 mg / L IAA. The explants
were disinfected with 2% detergent + Tween 20 for 20 minutes and then with 2% chlorine
equally with Tween 20 for 10 minutes, and added two fungicides: Carbendazim which is a
systemic fungicide Captan rapid penetration and is a contact fungicide. The results showed
contamination of crops and viability of the explants of 25%.
Key words: Propagation, buds, Coffeaarabica and in vitro culture.
INTRODUCCIÓN
Las técnicas de cultivo in vitro permiten la
propagación clonal, masiva y rápida de
plantas. Los métodos de desinfección
superficial utilizados para la introducción
de nuevas especies vegetativas al
laboratorio no garantizan que la planta se
encuentre libre de agentes patógenos
(López & Cazola, 2006).
La propagación por microesquejes es el
cultivo de una sección (explante)
proveniente del vástago de la planta
(nudo o entrenudo), con el fin de obtener
nuevos vástagos mediante el desarrollo
de yemas preexistentes o neoformadas,
las cuales podrán, a su vez, proporcionar
nuevos esquejes, o ser enraizados,
obteniéndose así múltiples plantitas,
2. idénticas, en principio, a la planta madre
(Rafael, 1987).
En base a previas investigaciones
desarrolladas por (Dublin, 1987) se sabe
que la estrategia de esqueje in vitro para
Arabusta comprende las fases siguientes:
a) obtención y multiplicación de los
microesquejes
b) enraizamiento
c) traspaso a condiciones ordinarias
de cultivo.
Por otra parte, Dublin estima que un solo
microesqueje podría proporcionar, en un
año, 20 000 plántulas aproximadamente,
lo que significa un altísimo rendimiento, el
cual unido a la garantía de conformidad
genotípica que ofrece esta técnica, lo
convierte en una muy buena alternativa
para la propagación masiva de genotipos
interesantes.
Otros investigadores que también han
aplicado exitosamente las técnicas de
microesquejes son (Akamura & Sondahi,
1981), quienes trabajaron con nudos de
ramas ortótropas de C. arabica cv. Mundo
Novo, obteniendo el desarrollo del 45% de
las yemas preformadas, con una
eficiencia de 7,5 plántulas por nudo
cultivado en sólo seis meses.
Otro aspecto importante en la micro
propagación in vitro de café es la
inducción de embriogénesis somática. Al
respecto se puede mencionar el trabajo
de(García & Menendez, 1987), en el cual
se logró la formación hasta de 75
embrioides por explante foliar de Catimor,
utilizando primero un medio para la
inducción del callo embriogénico [MS/2, 8
mg/I BAP y 1 mg/1 de Acido 2,4diclorofenexiacético
(2,4D)],
y
posteriormente otro medio para la
diferenciación de los embrioides (MS/2 y
10% de agua de coco).
La composición del medio nutritivo es
compleja, ya que una yema es una
porción mínima de la planta. Las yemas
se aíslan sobre medios solidos aunque en
algunos casos se utilizan medios líquidos.
Frecuentemente se utilizan vitaminas:
vitamina B1, piridoxina, ácido nicotínico,
ácido pantoténico. Los reguladores suelen
utilizarse en bajas concentraciones (0.10.5 mg/L); la auxina puede ser necesario
para la formación de raíces, auxinas y
citokininas para estimular la división
celular; el GA3 se añade a veces para
lograr la elongación del vástago (Cruz,
2005).
El objetivo de este trabajo fue el cultivo de
yemas a partir de explantes de
Coffeaarabica, para la obtención de
plantas libres de enfermedades como las
causadas por los virus.
MATERIALES Y METODOS
Preparación de la muestra: Se
extrajomicroesquejes de Coffeaarabica,
se los lavó y desinfectocuidadosamente,
se tomó 4 yemas apicales.
Preparación del medio de cultivo: El
medio utilizado fue Murashige y Skoog
enriquecido con 2 mg/l de BAP, 0,5 mg/l
de AIA, 30g/L de azúcar y 7.5g/L de agar
siendo pH ajustado a 5.75.
Desinfección del explante: Se preparó
500 ml de una solución 2% de detergente
añadiéndole 3 gotas de tween 20 durante
20 minutos. Se lavó las muestras tres
veces con agua destilada y una con agua
estéril. Posteriormente se colocó los
explantes en 500 ml de cloro al 2% más
tres gotas de tween 20 durante 10
minutos, todos estos procesos en
constante agitación, evitando dañar al
tejido del explante, agregando fungicidas
el primero Carbendazin que es un
fungicida sistémico y Captan fungicida de
contacto.
3. Después de este proceso de desinfección,
los explantes fueron trasladados a la
cámara de flujo, donde se realizaron tres
lavados listos para la siembra.
Preparación de la sala de siembra: Se
desinfectó el piso de la sala de siembra
con kalipto, se limpiaron las cámaras de
flujo laminar con papel toalla estéril y
sablón. Se introdujo en la cámara todo el
material a utilizar en la siembra: lámparas
de alcohol, juego de pinzas, bisturí,
servilletas estériles, plástico adherente,
ligas, botellas de agua estéril, vasos de
precipitación vacíos. Se prendió las UV
de las cámaras de flujo durante 20 min, se
apagó la UV y encendió el flujo de aire
durante 15 min.
Siembra del explante: Se cortó los
segmentos de material vegetal oxidado a
causa del cloro. Se quitó las hojas y
capas de tejidoque contenía el meristemo.
Se trabajó con el explante sobre una
servilleta estéril y cerca del flujo de aire de
la cámara. Se flameó las pinzas y bisturí
con alcohol al 90% antes y después de
manipular cada explante y se colocó un
explante por frasco.
Fotografía 1.- Vista superior del 1er
contaminación y necrosis del explante.
frasco
con
Fotografía 2.- Vista lateral del 1er
contaminación y necrosis del explante.
frasco
con
Se sembró dos explantes por cada frasco.
Antes de sellar el frasco se flameó la
boca. Finalmente se selló el frasco con 2
capas de plástico adherente, se aseguró
con una liga y se rotuló cada frasco.
Fotografía 3.- Vista superior del 2do frasco con
contaminación y necrosis del explante.
Se evaluó aparición de contaminantes,
brotes encontrados en los explantes y
variaciones en forma y color.
RESULTADOS
Se pudo determinar que en los cultivos in
vitro que contienen el explante de la
planta de (Coffeaarabica) sembrado, si
se obtuvo necrosamiento de los explantes
además de contaminación como se
observa en las Fotografía 1,Fotografía
2,Fotografía 3 y Fotografía 4.
Fotografía 4.- Vista lateral del 2do
contaminación y necrosis del explante.
frasco
con
Se
observó
cambios
morfológicos
representativos en los frascos de cultivo,
en su mayoría el cambio consistió en
4. contaminación y cambio de coloración
debido a la necrosis, la comparación entre
frascos se muestra en las siguientes
tablas.
Leyenda:
0 es ningún cambio
1 es un cambio ligero
2 es un cambio notorio
3 es un cambio destacable
Explante (Cofeearabica)
Parámetro
Crecimiento
Explante
0
1
2
3
1
X
2
X
3
X
4
X
Tabla 1.- crecimiento en rango después de la siembra del
explante.
Explante (Cofeearabica)
Parámetro
Contaminación
Explante
0
1
2
3
1
X
2
X
3
X
4
X
Tabla 2.- índices de contaminación después de la
siembra del explante.
Explante (Cofeearabica)
Parámetro
Coloración Café
Explante
0
1
2
3
1
X
2
X
3
X
4
X
Tabla 3.ñ- cambio de coloración de verde a café después
de la siembra del explante.
DISCUSIÓN
Según los resultados obtenidos para
establecer un cultivo de yemas es muy
importante realizar la escisión solamente
del explante seleccionado ya que de esta
manera se garantiza la ausencia de
posibles virus que afecten a la planta, lo
que permitirá tener plantas libres de
contaminación, en nuestro caso esto
nose dio por una previa infección de la
planta, por lo cual los explantes no eran
libres de contaminación, otro factor que
influencia en la contaminación es el
adecuado manejo de limpieza de la sala
de sembrío y por parte del investigador
que debe seguir todos los pasos correctos
para no contaminar el explante. De
acuerdo a ello estos explantes al estar
libres de contaminantes su viabilidad de
generar nuevos brotes a partir dela yema
según Santos, 2000 los explantes invitro
después de verificación de que no poseen
contaminación, permite a la planta
absorber todos los nutrientes del medio
para poder desarrollarse sin tener que
competir por ellos, la presencia de
contaminantes es un obstáculo para que
el explante sobreviva o logre regenerarse,
por ello existe un 90% de viabilidad de
que estos explantes con el tiempo logren
generar brotes.
CONCLUSIONES:
El
crecimiento
de
la
planta
(Coffeaarabica) en el medio de cultivo fue
escaso tan solo el cultivo de presento un
crecimiento en un rango de 2 en la escala,
los demás cultivos estuvieron en los de
rangos de cero y uno, poco crecimiento o
ausencia del mismo.
El tratamiento
de desinfección
con
detergente al 2% durante 20 min + 3
gotas de tween 20 y cloro al 2% durante
20 min + tres gotas de tween 30 y
fungicidas,no fue el óptimo para los
explantes de Coffea arabicaen la fase de
establecimiento del cultivo porque con
este tratamiento la mayoría de los
explantes están contaminados.
El cultivo a partir de yemas es una técnica
útil en la obtención de plantas libres de
contaminantes, y que además, permite el
desarrollo directo de brote, sin formación
de callo u organogénesis asegurando que
5. la inestabilidad genética y la variación
somaclonal se reducen al mínimo.
La tasa de viabilidad durante el
establecimiento in vitro se asoció con la
presencia ausencia de microrganismos
(hongos y bacterias), oxidación y elevado
porcentaje de necrosis.
RECOMENDACIONES:
Para la inducción in vitro de Coffea
arabicay un buen manejo de la
contaminación
microbiana
es
recomendable utilizar material vegetal
joven proveniente de plantas madre de
invernadero bajo cuidados fitosanitarios
estrictos durante algún tiempo.
En este estudio no se investigó la
influencia del tamaño de los explantes. Se
conoce que la probabilidad de aislar un
tejido limpio, es decir, un explante libre de
todo microorganismo es proporcional a su
tamaño inicial por lo que se recomienda
este tipo de estudio para futuras
investigaciones.
BIBLIOGRAFÍA
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Multiplicaçao "in vitro" de gemas
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Techniques de reproduction
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Techniques de reproduction
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García, E., & Menendez, A. (1987).
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Colombia: CIAT.