Microscopia de Fluorescencia, principio de la técnica

2. La longitud de onda determina el color
de las cosas
Fluorescencia
LUZ VISIBLE
Excitación ===============Emisión

3. FLUORESCENCIA
 ¿Qué es?
Es un proceso de interacción entre la
radiación y la materia en el cual un material
absorbe radiación de una fuente específica
y muy rápidamente emite luz cuya energía
es menor (de mayor longitud de onda) que
la de la radiación que ha absorbido.

4.  ¿Cómo se produce?
Los electrones son excitados a estados
vibracionales y rotacionales más altos y cuando
vuelven a su estado fundamental emiten la
energía
de excitación en forma de radiación.
¡La cantidad de luz emitida es muy pequeña en
comparación con la utilizada para la excitación!

5. Fluorescencia y Fosforescencia
 Tiempo de excitación
 Cantidad de luz emitida
 Duración de la emisión

6. Fluoróforos y Fluorocromos
 Un fluorocromo es una molécula capaz de
absorber fotones y emitir fotones de
menor energía (mayor longitud de onda).
 Un fluoróforo es la parte del fluorocromo
responsable de la emisión de la
fluorescencia.

7. Tipos de Fluorescencia
La fluorescencia primaria:
 Es la que se da porque existe una
configuración inherente a la estructura
molecular.
 Se presenta en muchos sistemas aromaticos
La fluorescencia secundaria:
 Ocurre cuando una molécula específica o un
grupo capaz de fluorescer un fluorocromo, se
introduce en la estructura de la muestra.

9. Uso de la microscopía de fluorescencia:
1) El objetivo principal es la identificación de una
sustancia específica observando sus
propiedades características de emisión cuando
se ilumina con radiación de longitud de onda
apropiada.
2) La determinación de parámetros específicos
propios de la muestra, que son resultado de la
preparación de la misma, que influyen en la
fluorescencia de un fluorocromo específico en
un material dado.
3) Otro objetivo es el barrido localizado de una
muestra para determinar la distribución de los
Fluorocromos que contiene, que es la
microscopía de barrido confocal.

12. FUENTES DE LUZ
 La elección de la fuente de luz depende
del fluorocromo que se investiga, según
sus necesidades de excitación.

13.  Lámparas de mercurio a alta presión

14.  Lámparas de xenón a alta presión:

16.  Con el filtro de excitación seleccionamos la
parte del espectro que utilizaremos para
excitar la muestra.
 La muestra emite fluorescencia en un
espectro distinto al de excitación y al
mismo tiempo refleja parte del espectro
utilizado para la excitación.
 El filtro barrera se encarga de eliminar la
parte del espectro reflejado y nos permite
visualizar el espectro de emisión
correspondiente al fluorocromo

18. 1. La lámpara emite luz en todo el espectro.
2. El filtro de excitación sólo deja pasar la
parte del espectro necesaria para excitar la
muestra.
3. El espejo dicroico refleja hacia la muestra la
excitación correspondiente.
4. La muestra se excita con la luz que le llega
y emite en un espectro superior al de la
excitación.
5. El espejo dicroico transmite la emisión de la
muestra.
6. El filtro barrera hace una selección exacta
del espectro de emisión que nos interesa.

19. APLICACIONES
 Se aplica a la determinación cuantitativa
de aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos y muchos Fluorocromos
celulares (para ello se utiliza un fotómetro
que mide la intensidad de la fluorescencia
de una región específica de la muestra).

25. Célula PtK2:
Fotografía de
sistema de micro
túbulos

26.  Equipo 2
 Rocío Regalado Villagómez
 Joel Grimaldo Velázquez
 Omar Pastor Islas Bayona