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- 2. 生物化学 基 因 (gene)： 为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以 碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。 基 因 组（genome)： 某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意 义上说，是指全部DNA序列。
- 3. 生物化学
- 6. 生物化学 A T G C C G T A Ç× ´ú DNA T C G A A G C T A G C T T C G A ×Ó́ú DNA
- 9. 生物化学 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的 碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传 信息，体现了遗传的保守性。 半保留复制的意义 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础， 但不是绝对的。
- 15. 生物化学 三、DNA复制的半不连续性 前导链：以3’ →5’ 方向的亲代链为模板连续合 成的子代链。 连续 滞后链：以5’ →3’方向的亲代链为模板的子代 链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接 成滞后链。不连续 前导链 冈崎 片段 滞后链 半不连续复 制：DNA复制 时，一条链 的合成是连 续的，另一 条链的合成 是不连续的。 复制叉移动方向 DNA聚合酶合成方向都是5′→3′
- 18. 生物化学 半不连续复制动画
- 19. 生物化学 DNA复制的体系 底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol) 模板: 解开成单链的DNA母链 引物: 提供3'-OH末端的寡核苷酸 其他: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接 酶 四、与DNA复制有关的酶和蛋白质
- 20. 生物化学 （一） DNA聚合酶 1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶， 催化性质如下： 原料：dNTP（dATP、dGTP dCTP dTTP) 需要模板： 需要引物：含3’ -OH. 合成方向：5 3 核酸外切酶活性
- 21. 生物化学 1959 年获诺贝尔生理学或医学奖 奥乔亚 科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg
- 23. 生物化学 5´ A G C T T C A G G A T A 3´ | | | | | | | | | | | 3´ T C G AA G T C C T A G C G A C 5´ • 3 5外切酶活性 • 5 3外切酶活性 ? 能切除引物和突变的 DNA片段。 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性
- 24. 生物化学 1.大肠杆菌DNA聚合酶 DNA polymerase 至少五种DNA polymerase DNA polymerase I DNA polymerase II DNA polymerase III DNA polymerase IV DNA polymerase V 1999年被发现，涉及 DNA的错误倾向修复
- 25. 生物化学 也称Kornberg酶，1956年分离。 1) DNA pol Ⅰ ① 5′→3′聚合 ② 3′→5′核酸外切酶活 ③ 5′→3′核酸外切酶活 ④ 焦磷酸解 ⑤ 焦磷酸基交换 功能：校读，去除RNA引物，填补空隙， 参与DNA损伤修复。 多功能酶
- 26. 生物化学 5′→3′聚合作用 单链线状DNA 单链环状DNA B. 局部变成了单链 的双链DNA C. 有切口（nick）的双链DNA D.有缺口（gap）的双链DNA 模板－引物 5' 3' 5' 3' A.单链DNA 5' 3' 3' 3' 5' 缺口填充 3' 3' 3' 5' 5' 3'
- 27. 生物化学 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段/Klenow 片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N 端 C 端 木瓜蛋白酶 DNA-pol Ⅰ • Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物 学研究中常用的工具酶。 补平 校对 DNA修复、切除引物
- 28. 生物化学 • 具有5′→3′的聚合酶活性。 • 只是在无polⅠ及polⅢ的情况下暂时 起作用。 • 对模板的特异性不高, 参与DNA损伤 的应急状态修复。 DNA聚合酶II (DNA-pol II)
- 29. 生物化学 DNA pol I DNA pol II DNA pol III 分子量 103Kd 88Kd 900Kd 不同种类亚基数目 1 ≥ 7 ≥ 10 每个细胞的分子数 400 100 10 生物学活性 1 0.05 15 5'→3'聚合酶活性 ＋ ＋ ＋ 3'→5'外切酶活性 ＋ ＋ ＋ 5'→3'外切酶活性 ＋ － － 聚合速度（核苷酸/分） 1,000－1,200 2,400 15,000－60,000 持续合成功能 3－200 1,500 500,000 功能 校正，修复，去 除RNA引物 修复 复制（5'→3'聚合 作用） 3)大肠杆菌三种DNA聚合酶比较
- 30. 生物化学 4) DNA pol Ⅲ——复制酶 每个E.coli约含10分子DNA pol Ⅲ，量少，但活性强，为DNA pol I的15倍，除聚合酶活性外，还有3′→5′核酸外切酶活性， 但无5′→3′核酸外切酶活性。 多亚基酶，含十种亚基（αβγθτδδ’χΨε）：αεθ 核 心酶；β2 夹子； γ2δδ’χΨ组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA， 故称夹子装配器，与持续能力强有关。
- 31. 生物化学 亚 基 亚基 数目 Mr(kDa) 基因 亚基功能 α ε θ τ γ δ δ’ χ Ψ β 2 2 2 2 2 1 1 1 1 4 132 27 10 71 52 35 33 15 12 37 dnaE dnaQ holE dnaX dadX ＊ holA holB holC holD dnaN 聚合作用 3’ → 5’外切酶的校对功能 组建核心酶 使核心酶二聚化 依赖DNA的ATP酶，形成γ复合物 与β亚基结合，形成γ复合物 形成γ复合物 形成γ复合物 形成γ复合物 两个β亚基形成滑动夹子，以提高酶 的持续合成能力。 DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成 核心酶 （2） γ复合物 夹子装配器 持续能力强 滑动夹子 2β2
- 33. 生物化学
- 34. 生物化学 2.真核生物DNA聚合酶 有DNA polα、β、γ、δ、ε α β γ δ ε 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 分子量（kD) >250 36-38 160-300 170 256 聚合方向：5'→3' ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 外切酶活性3'→5' － － ＋ ＋ ＋ 抑制剂Aphidicolin strong None None strong strong Dideoxy NTPs None strong strong weak weak N-Ethylmaleimide Strong None strong strong strong 功能 引物 合成 修复 线粒体 DNA合成 核DNA 合成 有解螺旋酶 活性 修复
- 35. 生物化学 连接DNA双链中的单链切口 大肠杆菌和其它细菌 NAD+供能 高等生物和噬菌体 ATP 供能 T4 DNA ligase 连接双链DNA上 的粘性切口和无粘性末端的平头 双链DNA。 DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。 （二）DNA连接酶 DNA ligase
- 36. 生物化学 连 接 酶 连 接 切 口 Mg2+ 连接酶 ATP或NAD＋ AMP+PPi或NMN+AMP A T C G P T T P P P A A C C T G A P A C P P P P OH T G G 切口 3' 5' 5' 3' 模板链 3' 5' G A T C G P T T P P P A A C C T G A P A C P P P T G P 5' 3' 模板链
- 39. 生物化学 两类拓扑异构酶作用特点: 类型Ⅰ拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用 是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区， 同转录有关。 如：E.coli的ω-蛋白（消除负超螺旋） 真核细胞的Top Ⅰ, Ⅲ 类型Ⅱ拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入 负超螺旋时需要ATP提供能量，同复制有关。 如： E.coli的DNA gyrase（DNA旋转酶，连续引入负超螺旋， 真核细胞的TopⅡα, Top β
- 40. 生物化学 拓扑异构酶Ⅱ的作用
- 43. 生物化学 （五）引物合成酶与引发体蛋白 引物合成酶： DnaG 催化引物RNA的生成 引发体蛋白: DnaA DnaB DnaC n(PriA) n’(PriB) ATP酶 n’’(PriC) i(DnaT) 引发前体 1、引发体，沿模板链5’3’ 移动,具有识别合成起始位 点的功能，移动到一定位 置上即可引发RNA引物的合 成。移动和引发均需ATP。 2、引发体的移动方向与复 制叉移动方向相同，与冈 崎片段合成方向相反。 预引发体
- 46. 生物化学 A 端粒合成的一种模型 3´ 5´ TTTTGGGGTTTTG 5´ 3´ AAAACCCCAAAACCC C C C AA 3´ 5´ TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG 5´ 3´ AAAACCCCAAAACCC C C C A AA T T G G G T G G G T 3´ 5´ AA TTTTG 5´ 3´ AAAACCCCAAAACCC C C C A GTTTTG 整合和 杂交 移位和 再杂交 端粒合成的完成 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT 5´ 3´ n AA 3´ TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5´ 3´ T T CCCCT n AA 3´ TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT 5´ 3´ T T AAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n 进一步加工 继续 延伸
- 51. 生物化学 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓扑异构酶 SSB 3 5 3 5 引发体和引物 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
- 52. 生物化学 1、拓扑异构酶解开超螺旋。 2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个 9bp的重复序列。 3、在类组蛋白（HU）、ATP参与下, Dna A蛋 白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。 4、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C 的帮助下沿5’ →3’ 方向移动，解开DNA双链， 形成前引发复合物。 5、单链结合蛋白结合于单链。 6、引物合成酶（Dna G蛋白）合成RNA引物。
- 53. 生物化学 蛋白质 功能 Dna A 识别起点序列，在起点特异位置解开双链 Dna B 解开DNA双链 Dna C 帮助DnaB结合于起点 类组蛋白HU DNA结合蛋白，促进起始 引物合成酶Dna G 合成RNA引物 单链DNA结合蛋白SSB 结合单链DNA RNA聚合酶 促进Dna A活性 DNA旋转酶TopⅡ 释放DNA解链过程产生的扭曲张力 Dam甲基化酶 使起点GATC序列的腺嘌呤甲基化 大肠杆菌起点与复制起始有关的酶与辅助因子
- 54. 生物化学 不能发生复制的起始 13min 全甲基化的起点 245bp ori C有 11个GATC 复制起始的时序控制 半甲基化OriC可与 细胞膜结合，暂时 无法被Dam甲基化。 半甲基化的起点 ori C和dna A 位点再甲基化 的延迟 A的N6甲基 化 降低起始蛋白DnaA水平
- 56. 生物化学 先导链的合成
- 57. 生物化学 滞后链的合成
- 58. 生物化学 复 制 过 程 简 图
- 59. 生物化学 大肠杆菌染色体复制的终止 oric 复制叉2 复制叉1 终止复制叉2 终止复制叉1 复制叉1 复制叉2 完成复制 DNA拓扑异构酶Ⅳ Top Ⅳ 连锁染色体 （三）复制的终止 Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区 域，20bp的序列，终止利用物质Tus可 识别并结合，从而导致DNA复制的终止。 原核生物基因是环状DNA，双向复制的 复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 分开染色体
- 62. 生物化学 • 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复 制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而 不是同步起动。 • 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子 (replication factor, RF)。 （一）复制的起始
- 64. 生物化学 • DNA复制与核小体装配同步进行。 • 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 • 复制终止包括： 1. 岡崎片段、复制子之间的连接。 2. 端粒的合成 （三）复制的终止和端粒酶
- 66. 生物化学 功能 • 维持染色体的稳定性 • 维持DNA复制的完整性 结构特点 • 由末端DNA序列和蛋白质构成。 • 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基 的短序列。 TTTTGGGGTTTTGGGG…
- 68. 生物化学 端粒酶(telomerase) 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体 ，它以其RNA为模板，通过逆转 录对末端DNA链进行延长。 包括： 端粒酶的分子结构 • 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) • 端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) • 端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT)
- 70. 生物化学 端粒及端粒酶的意义 成年人端粒比胚胎细胞端粒短； 老化与端粒酶活性下降有关； 肿瘤的发生与端粒酶活性有关； 端粒酶不一定能决定端粒的长度。
- 78. 生物化学 7. 真核生物DNA复制体组成不同。真核细胞内有多种DNA 聚合酶，DNA聚合酶δ是复制酶，在增殖细胞核抗原PCNA 存在下有持续合成能力 DNA pol α DNA pol β DNA pol γ DNA pol δ DNA pol ε 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 外切酶活 － － 3’→5’外切 3’→5’外切 5’→3’外切 引物合成 酶活 ＋ － － － － 持续合成 能力 中等 低 高 有PCNA时 高 高 抑制剂 蚜肠霉素 ddTTP ddTTP 蚜肠霉素 蚜肠霉素 功能 引物合成 修复 线粒体DNA 合成 核DNA合成 修复
- 79. 生物化学 组成 细菌 真核生物 复制酶 DNA聚合酶Ⅲ全酶 DNA聚合酶α/δ 进行性因子 β-夹子 PCNA 增殖细胞核抗原 定位因子 γ复合物 RF-C 引物合成酶 Dna G DNA聚合酶α 去除引物 RNase H 和DNA聚合酶Ⅰ RNase H1和MF-1 滞后链修复 DNA polⅠ和DNA连接酶 DNA polε和DNA连接酶Ⅰ 解螺旋酶 DnaB（定位需Dna B） T抗原 消除拓扑张力 旋转酶 拓扑异构酶Ⅱ 单链结合 SSB RP-A 细菌和真核生物复制体的组成
- 80. 生物化学 聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ， PCR）体外扩增DNA以成为应用最广泛的一种生物技 术。 必备条件 ①模板DNA（单链） ②引物 ③Taq DNA polymerase ④dNTP ⑤一定浓度的Mg2+