Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
PHẠM VĂN PHÖC
NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC
HIỆU KHÁNG SINH TETRACYCLINE VÀ
ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG
Ngành: Sinh học
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 01. 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. LÊ QUANG HUẤN
Hà Nội – 2014

2
LỜI MỞ ĐẦU
Kháng sinh là loại thuốc quan trọng được coi là chiến lược cuối cùng để điều trị
nhiễm trùng của con người. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị của chúng bị đe dọa do
việc sử dụng các kháng sinh rộng rãi và không phù hợp không chỉ trong y học mà
còn trong nông nghiệp. Sự hiện diện của dư lượng kháng sinh trong thực phẩm ở
trên mức cho phép là bất hợp pháp. Vì vậy, kiểm soát dư lượng trong sữa, trong
thực phẩm…đang là vấn đề được xã hội quan tâm.
Tetracyline là một nhóm thuốc kháng sinh phổ rộng. Chúng được sử dụng vừa để
điều trị bệnh cho cả người và động vật vừa được dùng để kích thích tăng trưởng ở
động vật. Do đó, các sản phẩm thực phẩm từ động vật (thịt, trứng, sữa) có nguy cơ
chứa dư lượng Tetracycline dẫn đến nguy hại cho sức khỏe người sử dụng. Mức độ
tối đa cho phép trong sữa là 100 μg/kg, trong gan là 600 μg/kg và trong thận là 1200
μg/kg (theo tiêu chuẩn Codex).
Hiện nay, việc nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh Tetracycline trong thực
phẩm nói chung và trong sữa nói riêng chủ yếu dựa trên phương pháp phân tích hóa
lý thông thường như phương pháp vi sinh vật, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu
năng cao, ELISA. Các phương pháp này hầu hết cho độ nhạy cao, kết quả khá chính
xác. Tuy nhiên, hạn chế của các phương pháp trên ở chỗ đòi hỏi nhiều hóa chất,
dung môi; cần lượng mẫu phân tích lớn; không có khả năng phân tích nhanh theo
thời gian thực; thiết bị cồng kềnh, sử dụng phức tạp, mặt khác chi phí cho mỗi lần
còn đắt đỏ so với điều kiện kinh tế nước nhà.
Công nghệ nano đã tạo ra các loại vật liệu thế hệ mới có các đặc tính siêu việt.
Các ứng dụng của công nghệ nano vào khoa học sự sống ngày càng được phát triển
rộng rãi, trong đó việc sử dụng các vật liệu nano để tạo các cảm biến sinh học
(biosensor) đang là hướng nghiên cứu được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và
trong nước quan tâm phát triển. Ưu điểm nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc
nano trong việc tạo các cảm biến sinh học là tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Nguyên
lý cơ bản của các cảm biến sinh học là xác định các thay đổi về quang hoặc về điện
hóa do sự tương tác đặc hiệu của các phân tử. Trong đó các tương tác kháng
nguyên-kháng thể, tương tác enzyme-cơ chất, tương tác thụ thể-ligand là những
tương tác cơ bản, đóng vai trò then chốt. Mặc dù có độ nhạy và độ đặc hiệu cao,

3
nhưng khả năng ứng dụng của các cảm biến sinh học hiện nay trên thực tế còn
nhiều hạn chế do thời gian chuẩn bị mẫu, các thao tác lâu, phức tạp. Hơn nữa, vấn
đề thu nhận và tinh sạch các kháng thể, một trong các nguyên liệu then chốt để tạo
cảm biến sinh học, là rất phức tạp, tốn kém và độ bền của kháng thể rất hạn chế.
Vì vậy, việc sử dụng các phân tử thay thế kháng thể đơn dòng trong chế tạo cảm
biến sinh học nhưng vẫn bảo đảm độ nhạy và độ đặc hiệu cao là rất cần thiết, và các
aptamer được xem là phân tử thay thế kháng thể đơn dòng phù hợp nhất trong chế
tạo các biosensor.
Aptamer là các sợi đơn DNA, các phân tử RNA hoặc các đoạn peptide có cấu
trúc đặc biệt và có khả năng gắn kết với các phân tử đích khác nhau, chẳng hạn như
các phân tử hữu cơ nhỏ, các protein và các tế bào ung thư. Với các đặc tính độc đáo,
aptamer trở thành một trong những nhóm chất có nhiều tiềm năng ứng dụng trong
điều trị ung thư. So với kháng thể đơn dòng thì aptamer có nhiều ưu điểm hơn: (1)
aptamer có kích thước phân tử nhỏ hơn kháng thể và không sinh đáp ứng miễn dịch
khi sử dụng in vivo, (2) aptamer có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với các
phân tử đích tương đương hoặc hơn các phân tử kháng thể, (3) việc chế tạo các
aptamer đơn giản, nhanh, hiệu quả vượt trội so việc tạo các kháng thể đơn dòng
hoặc các kháng thể tái tổ hợp, (4) aptamer có độ bền với các tác nhân hóa, lý, môi
trường cao hơn kháng thể. Vì vậy, aptamer là một trong những hướng nghiên cứu
mới của công nghệ gen nhằm sử dụng các chẩn đoán và điều trị miễn dịch.
Từ những lí do trên, tôi xin đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc
aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hƣớng ứng dụng”
Mục tiêu của đề tài:
 Xây dựng được quy trình sàng lọc được aptamer đặc hiệu kháng sinh
Tetracycline
 Chọn dòng được ít nhất một phân tử aptamer có ái lực cao với kháng
sinh Tetracycline
 Bước đầu phát hiện được kháng sinh trong sữa bằng biosensor theo
nguyên lý điện hóa

4
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH TETRACYCLINE
1.1.1. Kháng sinh Tetracycline
Tetracycline là một kháng sinh thuộc thế hệ cũ được tìm ra từ năm 1948, nhưng
cho đến nay nó vẫn là một loại thuốc tốt. Trong quá trình sử dụng dù tỷ lệ kháng lại
khá nhiều nhưng nó vẫn là một kháng sinh công hiệu và chưa thể loại bỏ khỏi tủ
thuốc của nhân loại.
Tetracycline là một dòng kháng sinh phổ rộng, có hiệu lực với hầu như các vi
khuẩn gram âm cũng như gram dương. Nó đã từng được coi là kháng sinh ―bách
bệnh‖ dùng cho mọi loại vi khuẩn và được sử dụng khá lạm dụng. Tỷ lệ kháng
kháng sinh này khá cao nhưng không phải vì thế mà nó mất đi công hiệu vốn có của
mình. Với những tác dụng đặc hiệu thì Tetracycline vẫn được bảo toàn sau 70 – 80
năm và là kháng sinh đầu bảng của các bệnh nhiễm Chlamydiae, bệnh nhiễm
Mycoplasma, Rickettsiae như sốt kiểu thương hàn, sốt hồi quy và đặc biệt là nhiễm
phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae gây ra bệnh dịch tả điển hình trong mùa hè.
1.1.2. Phân loại
Hình 1.1. Công thức hóa học chung của nhóm Tetracycline
( Nguồn: Từ Ming Koóng, 2004)

5
Kháng sinh nhóm Tetracycline bao gồm 3 loại chính là: Oxytetracycline,
Tetracycline và Chlortetracycline. Các loại Tetracycline có cấu trúc cơ bản giống
nhau, chúng chỉ khác nhau ở gốc R.
1.1.3. Cơ chế tác động
Tetracycline được vận chuyển theo phương thức tích cực qua màng bào tương
của các vi khuẩn mẫn cảm với thuốc. Các yếu tố vận chuyển tích cực này chỉ có ở
vi khuẩn mà không có ở tế bào vật chủ. Sau khi thuốc vượt qua màng bào tương sẽ
gắn vào tiểu phần 30s của Ribosom và đồng thời cũng gắn vào cả ARN thông tin, từ
đó ngăn cản sự gắn kết các axit amin vào chuỗi peptid. Qua đó, chúng ức chế quá
trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Nếu không có các protein này thì vi khuẩn
không thể phát triển, nhân rộng và tăng số lượng. Do đó, Tetracycline làm dừng lại
quá trình lây lan và những vi khuẩn còn lại sẽ bị giết bởi hệ thống miễn dịch hoặc tự
chết dần dần.
Hình 1.2. Cơ chế tác động của Tetracycline (Nguồn: Gary E. Kaiser)
Đề kháng Tetracycline là do sự thay đổi khả năng thẩm thấu của vách tế bào vi
khuẩn. Ở những vi khuẩn nhạy cảm, thuốc được tập trung vào bên trong và khó
thoát khỏi tế bào, còn ở vi khuẩn đề kháng thì thuốc không được vận chuyển chủ
động vào bên trong hoặc dễ dàng rời khỏi tế bào một cách nhanh chóng làm nồng
độ ức chế của thuốc không còn được duy trì. Cơ chế này được kiểm soát bởi
plasmid.
1.1.4. Phổ hấp thụ
Kháng sinh nhóm Tetracycline có phổ tác dụng rất rộng. Chúng tác dụng với rất
nhiều loại vi khuẩn gram dương và âm, nhiều loại Mycoplasma, Clamidia,

6
Richketsia; tác dụng với cả các Protozoa (ở nồng độ cao) như Theileria,
Anaplasma, Eperythrozoom. Tác dụng tốt với các Clostridium, Listeria,
Streptococcus, E.rhusiopathiae, Brucella, B,bronchiseptica, Klebsiella. Không tác
dụng với P.aeruginosa, P. vulgaris [6].
1.1.5. Sự hấp thu, phân bố và thải trừ
Hấp thu
Tetracycline thường được hấp thu theo đường uống, có thể tiêm tĩnh mạch, tiêm
bắp cho động vật, tiêm dưới da cho gia cầm. Nếu đưa thuốc bằng đường miệng,
kháng sinh nhóm Tetracycline có thể giữ được nồng độ tác dụng trong máu từ 2 –
4h. Oxytetracycline được thải qua phân với nồng độ 2,5 mg/g phân khi cho uống ở
người. Khả năng hấp thu của thuốc sẽ giảm đi nhiều nếu cho uống cùng với sữa, các
sản phẩm của sữa và các muối của các ion Al3+
, Mn2+
, Mg2+
, Ca2+
…
Nếu tiêm, thuốc được hấp thu gần như hoàn toàn, nhanh đạt nồng độ hữu hiệu
trong máu hơn đường uống. Đưa bằng đường tiêm, thuốc cũng được phân bố trong
dịch tổ chức đều hơn, rộng hơn so với uống. Do vậy hiệu quả điều trị cũng cao hơn.
Sau khi uống khoảng 2 – 4h, thuốc đạt nồng độ hữu hiệu trong máu và được giữ
trong khoảng 6h hay lâu hơn, đôi khi có thể kéo dài tới 24h hay 30h. Nếu cứ sau 6h
lại uống 250 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt 1 – 3 μg/ml. Còn uống liều 500 mg,
nồng độ thuốc trong máu đạt 3 – 5 μg/ml. Liều 1 g nồng độ cao hơn 5 μg/ml. Nồng
độ này duy trì trong suốt thời gian điều trị.
Khi tiềm liều 250 – 500 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt từ 5 – 10 μg/ml [6].
Phân bố
Hàm lượng thuốc trong các tổ chức có liên quan rất lớn đến liều lượng sử dụng
với hàm lượng nước của các mô tổ chức trong cơ thể. Chúng phụ thuộc vào sự liên
kết và biến đổi của protein huyết tương. Ví dụ như Chlortetracycline 50 – 70%,
Oxytetracycline 20 – 25%.
Tất cả các dạng thuốc nhóm Tetracycline sau khi hấp thu được chuyển tới gan
theo mật đổ xuống ruột non. Hàm lượng thuốc trong gan, mật bao giờ cũng cao hơn
trong máu ít nhất từ 5 – 10 lần. Thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột – máu nên
được tồn tại lâu trong máu, vì vậy thời gian tác dụng của thuốc dài.
Thải trừ

7
Tetracycline phần lớn thải trừ qua nước tiểu. Sự lọc thải của thuốc phụ thuộc vào
công năng của thận. Nếu tiêm khoảng 20 – 60%, lượng thuốc được thải qua thận
sau 24h đầu. Có khoảng 20 – 55% liều uống cũng được thải qua nước tiểu. Trong
đó có khoảng 10 – 35% lượng Oxytetracycline thuốc thải qua nước tiểu dưới dạng
còn hoạt tính sau khi dùng thuốc 1/2h đến 5h. Còn Chlortetracycline nếu uống, chỉ
có khoảng 10 – 15% lượng thuốc được tìm thấy trong nước tiểu. Sự thải của
Chlortetracycline qua thận chỉ khoảng 35%, thấp hơn Oxytetracycline. Nếu tiêm
tĩnh mạch, 60% lượng thuốc được thải qua nước tiểu trong 12h đầu.
Nếu đưa thuốc qua đường uống, phần Tetracycline không được hấp thu sẽ thải
trừ qua đường tiêu hóa (theo phân) dưới dạng còn hoạt lực. Có khoảng 500 – 600
μg Tetracycline trong 1 g phân. Đồng thời một phần lượng thuốc tiêm cũng được
thải trừ qua phân do đó thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột rồi theo phân ra
ngoài [1].
1.1.6. Tính kháng thuốc
Kháng thuốc diễn ra chậm, theo từng bước tăng dần. Nguyên nhân do sự chuyển
vận thuốc qua màng bị rối loạn, giảm dần. Trong trường hợp kháng do R.Plasmid
thì ngược lại, lan truyền rất nhanh. Sử dụng Tetracycline quá rộng rãi, không kiểm
soát được đã tạo điều kiện làm tăng tình trạng kháng thuốc trong thực tế lâm sàng.
Tình trạng kháng thuốc ở các vi khuẩn E.coli, Salmonella, Proteus hầu như
giống nhau; tỷ lệ chủng Staphylococcus kháng thuốc thay đổi tùy tình hình, tùy địa
phương. Các chủng M.hyoneumoniae, M.bovis, Pasteurella, A.pleuropneumoniae
có tỷ lệ kháng ít nhất [6].
1.1.7. Tác dụng phụ
Không thể phủ nhận hiệu lực của Tetracycline trong việc điều trị nhiễm trùng,
đặc biệt là các bệnh nhiễm trùng thuộc những vi khuẩn kể trên. Người bệnh sẽ thấy
có sự biến chuyển ngay từ liều đầu tiên cho tới khi khỏi bệnh. Song nó cũng ẩn
chứa nhiều nguy cơ có hại về mặt sức khỏe.
Khi Tetracycline được sử dụng trong chăn nuôi quá nhiều sẽ dẫn đến dư thừa
trong sản phẩm thực phẩm nói chung và trong sữa nói riêng. Hàm lượng dư thừa đó
được người sử dụng hấp thụ trong một thời gian dài gây tích lũy và ảnh hưởng có
hại tới sức khỏe.

8
Mặc dù tương đối an toàn, các tác dụng phụ thường gặp nhất ở Tetracycline bao
gồm các phản ứng dị ứng từ nhẹ đến trung bình, nhạy cảm với ánh nắng mặt trời,
rối loạn dạ dày, hiếm khi nhức đầu nặng và các vấn đề liên quan đến thị lực.
Ngoài ra, nhóm kháng sinh Tetracycline có xu hướng tác dụng trên răng và
xương trẻ em. Do đặc tính đặc thù là kết hợp và tạo phức hợp bền (chelat) với canxi,
thành phần nhiều trong xương và răng nên Tetracycline dễ dàng tạo phức hợp bền
với yếu tố này tại hai cơ quan đang cốt hóa. Sự lắng đọng lâu và kéo dài
Tetracycline sẽ gây ra hiện tượng hỏng men răng, xỉn răng, hủy hoại sự phát triển
xương. Nếu phụ nữ mang thai vào giai đoạn cuối của thai kỳ sử dụng sữa có chứa
dư lương Tetracycline thì sẽ ngăn chặn sự phát triển xương của trẻ em. Do vậy,
kháng sinh Tetracycline tuyệt đối không được sử dụng ở bà mẹ mang thai thời kỳ
cuối (ba tháng cuối) và không dùng cho trẻ em đến khi nào đứa trẻ được 12 tuổi.
Do thuốc gây ức chế tổng hợp protein nên nó sẽ gây ra ứ đọng các axit amin, các
đơn vị tiền thân của protein. Sự dư thừa các axit amin gây tăng phân giải tạo ra các
sản phẩm ure và nitơ. Do đó mà thuốc làm tăng nồng độ ure huyết. Bởi vậy, nếu
người già và người bị các bệnh lý về thận mà vô tình bị tích lũy dư lượng
Tetracycline thì hậu quả rất nguy hiểm. Chúng sẽ làm cho sự gia tăng ure huyết là
đỉnh điểm và gây ra tai biến, có thể dẫn đến hôn mê.
Nếu xét về độc tính trên gan thì Tetracycline là một thuốc kháng sinh gây viêm
gan điển hình trong họ hàng nhà kháng sinh. Thuốc gây ra viêm gan và viêm tụy
mức độ nặng nếu chúng ta dùng liều cao và kéo dài. Do đó, trên những đối tượng
sẵn có các bệnh lý về gan và tụy như viêm gan virut, viêm tụy, viêm gan tắc mật,
viêm gan vàng da thì việc sử dụng các sản phẩm sữa chứa dư lượng kháng sinh là
một yếu tố làm tăng tình trạng bệnh..
Bên cạnh đó, việc tích lũy hàm lượng Tetracycline trong một thời gian dài còn
dẫn đến nguy cơ phá vỡ hệ cân bằng các vi sinh vật đường ruột, tạo ra các chủng
kháng thuốc kháng sinh.
1.1.8. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới
Nhu cầu về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi động vật nói chung và nuôi bò
sữa nói riêng là rất lớn. Kháng sinh được sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng

9
khi dùng với liều lượng thấp 2,5 – 50 ppm. Việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn
chăn nuôi được đánh dấu bằng một thí nghiệm của Stokstad và Juke (1949) khi cho
gia cầm ăn thức ăn có bổ sung Chlortetracycline, nhận thấy tốc độ sinh trưởng và
hiệu quả sử dụng thức ăn của gia cầm tăng rõ rệt. Từ đó rất nhiều công trình nghiên
cứu về kháng sinh như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi đã được thực hiện. Bắt
đầu từ những năm 1950 và 1960 của thế kỷ 20, một kỷ nguyên mới của ngành chăn
nuôi đã được mở ra khi kháng sinh được coi như một yếu tố không thể thiếu, nó đã
tạo nên một bước đột phá về năng suất và hiệu quả chăn nuôi ở nhiều nước trên thế
giới.
Ở Mỹ hàng năm khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng
trong chăn nuôi. Xấp xỉ 80% gia cầm, 70% lợn; 70% bò sữa và 60% bò thịt ở Mỹ
được nuôi dưỡng bằng thức ăn có bổ sung kháng sinh và cứ mỗi một USD chi phí
cho kháng sinh dùng trong thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2- 4 USD. Vào
năm 1999, chỉ riêng lượng kháng sinh nhóm Tetracycline được sử dụng đã là 1453
tấn, chiếm khoảng 15,67% lượng kháng sinh được dùng (theo số liệu thống kê của
viện thú y Mỹ) và đặc biệt khoảng 13,7% tổng lượng kháng sinh được sử dụng với
mục đích kích thích sinh trưởng [7]
Ở Anh, Tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng nhiều nhất để bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi, chiếm hơn 50% tổng số kháng sinh bổ sung vào thức ăn.
Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng
trong dân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (quy theo mức 100% tinh
khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong dân y, 33% trong
điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong đó, tỷ lệ các
loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: penicillin: 9%; tetracycline: 66%;
macrolide: 12%; Aminoglycoside: 4%; Fluoroquinolone: 1%;
Trimethomprim/sulpha: 2% và các kháng sinh khác: 6% [6]
Tình hình sử dụng kháng sinh tại Việt Nam
Từ khi được đưa vào Việt Nam đến nay, kháng sinh ngày càng được sử dụng
rộng rãi và liên tục, trong đó có một phần không nhỏ cho lĩnh vực chăn nuôi. Nhằm
tăng khả năng chống chịu những thay đổi của môi trường và mầm bệnh nên trong
quá trình chăn nuôi, người ta thường sử dụng kháng sinh trộn vào thức ăn, nước

10
uống hoặc tiêm với mục đích kích thích tăng trường, phòng bệnh và trị bệnh. Việc
trộn kháng sinh vào thức ăn của vật nuôi với hàm lượng rất cao, không tuân thủ
đúng thời gian quy định về ngưng thuốc trước khi xuất chuồng là nguyên nhân
chính gây tồn dư kháng sinh trong thực phẩm vượt mức cho phép (Quyết định số
46/2007/QĐ-BYT). Hậu quả có thể ảnh hưởng tới sức khỏe con người như nguy cơ
dị ứng kháng sinh, độc tính mãn tính và gia tăng hiện tượng đề kháng kháng sinh.
Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cao: 100% có
Oxytetracycline, 67% có Chloramphenicol, 30% có Olaquindox, 77% có
Dexamethasol [5].
Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã
tiến hành khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng
sinh trong thịt ở các quầy kinh doanh gia súc, gia cầm (2003). Điều tra 628 hộ chăn
nuôi lợn, gà cho thấy đa số người chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý như
liều cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa bệnh cho gia súc cho đến khi nào bán
được. Xét nghiệm các mẫu thịt được lấy trực tiếp tại các chợ cho thấy có 26 loại
kháng sinh được phát hiện. Trong đó, loại được sử dụng nhiều nhất là
Chloramphenicol (chiếm 15,35%), Tylosin (15%), Colistin (13,24%), Norfloxacin
(10%), Gentamycin (8,35%), nhóm Tetracycline (7,95%), Ampicillin (7,24%)…
Trong đó, Chloramphenicol là kháng sinh hiện đã bị cấm sử dụng trên nhiều quốc
gia. Trong 149 mẫu thịt gà được kiểm tra, phân tích có đến 44,96% số mẫu có dư
lượng kháng sinh vượt quá mức quy định cho phép từ 2,5 – 1.100 lần so với tiêu
chuần ngành. Trong đó, loại kháng sinh Chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất đến
87,50%, Flumequin chiếm 83,33%, Chlortetracycline chiếm 62,50%, Amoxillin
chiếm 60%...
Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các hộ chăn nuôi trên địa bàn Hà Nội
cho thấy tỷ lệ sử dụng các loại kháng sinh là Quinolones 78,14%, Macrolides
86,89%, Polipeptides 54,92%, Aminoglycosides 50,96%, β-lactams 4,58% và
Tetracycline 46,58%.
Từ năm 2003 – 2006, kết quả phân tích lượng tồn dư thuốc kích thích tăng
trưởng trong 150 mẫu thịt và gan của gia cầm, gia súc thu thập tại Hà Nội của Khoa
Thực phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện dinh dưỡng Quốc gia cho thấy: đã

11
phát hiện tồn dư thuốc kháng sinh nhóm Tetracycline trong 18 mẫu, chiếm tỷ lệ
12%. Có 5,5% số mẫu trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường Hà Nội có tồn dư kháng
sinh Tetracycline. Tại các khu vực chăn nuôi ở miền nam cũng nhận thấy có 4 cơ sở
chiếm 22,2% các mẫu thịt gà có tồn dư các loại kháng sinh Tetracycline, amoxyline,
erofloxacine với hàm lượng cao gấp từ 1,4 – 30,9 lần so với ngưỡng cho phép [3].
1.1.9. Sự tồn dƣ kháng sinh
Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh
Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng
sinh và có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn
nuôi:
- Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc
- Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh
- Kháng sinh cho vào nước uống để chữa bệnh gia súc
- Kháng sinh cho thêm vào thức ăn gia súc để bảo quản súc sản lâu hư
- Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với
mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi.
Hai là, có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật
để bảo quản thực phẩm. Do vận chuyển sản phẩm đi xa, cho kháng sinh vào thực
phẩm để bảo quản [4].
Tác hại của việc tồn dư kháng sinh
Việc người chăn nuôi và các bác sỹ thú y sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi,
sai nguyên tắc đối với động vật như hiện nay, đặc biệt là ở những nơi trình độ dân
trí còn thấp cộng với công tác quản lý của cán bộ nhà nước còn lỏng lẻo đã dẫn tới
tình trạng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật. Không chỉ
vậy, việc này còn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe của con người và về lâu
dài còn ảnh hưởng tới cả môi trường sinh sống, cụ thể như sau:
- Ảnh hưởng ngay lập tức sau khi tiêu thụ sản phẩm
- Phản ứng quá mẫn cảm đối với người nhạy cảm kháng sinh
- Gây dị ứng sau khi tiêu thụ thịt tồn dư kháng sinh
- Ảnh hưởng muộn hơn khi tiêu thụ thịt tồn dư kháng sinh:
- Tạo ra vi sinh vật kháng thuốc

12
- Gây khó khăn cho công tác điều trị nhiễm khuẩn
- Gây tốn kém kinh tế
- Làm giảm sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể
- Ảnh hưởng tới quá trình chế biến thực phẩm
- Một số kháng sinh, hóa dược có thể gây ung thư cho người tiêu thụ
Berends B và cộng sự (2001) khi đánh giá mối nguy hiểm của việc quản lý kháng
sinh trên động vật giết mổ đối với sức khỏe của người tiêu dùng tại Hà Lan cho
thấy: nguy cơ gây hại của dư lượng Tetracycline trong thịt lợn giết mổ gây nên phản
ứng dị ứng trên người tiêu dùng là 1/33.000.000 và các rối loạn của vi khuẩn đường
ruột là 1/45.000.000 (được ước tính ngẫu nhiên tối đa). Khi so sánh giữa hai nguy
cơ gây hại trên đối với sức khỏe của con người, ông đã kết luận rằng: nguy cơ của
dư lượng Tetracycline gây rối loạn vi khuẩn được ưu tiên chú trọng.
Trong đó, tạo ra sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn là tác hại nghiêm trọng nhất khi
sử dụng thực phẩm tồn dư kháng sinh. Việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn
nuôi (sử dụng không đúng cách trong điều trị, phòng bệnh và dùng trong thức ăn
chăn nuôi như chất kích thích sinh trưởng) đã dẫn đến một hậu quả rất nghiêm trọng
là làm tăng hiện tượng kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn gây bệnh trên người
và vật nuôi. Có ý kiến cho rằng, việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi
đã biến vật nuôi thành nơi để một số loài vi khuẩn học cách vô hiệu hóa tác dụng
của các loại kháng sinh.
Hậu quả của sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn về kinh tế rất lớn. Theo dẫn liệu của
Robyn (2002), chi phí điều trị một bệnh nhân mắc bệnh lao ở Mỹ tăng từ 12000
USD (thông thường trước đây) lên 180000 USD cho những bệnh nhân nhiễm vi
khuẩn lao kháng thuốc. Tuy nhiên, những thiệt hại về kinh tế không phải là chính
yếu mà vấn đề đáng lo ngại không chỉ ở vật nuôi mà ngay cả loài người đang đứng
trước hiểm hoạ xảy ra các thảm dịch do những loài vi khuẩn kháng thuốc gây ra mà
không thể kiểm soát được [7].
Tình trạng phổ biến của vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam đang ở mức độ
báo động. Ngoài nguyên nhân của việc sử dụng kháng sinh một cách rộng rãi trong
điều trị y học, nhóm nghiên cứu GARP – Việt Nam (2010) đã nhấn mạnh đến ý
nghĩa của việc sử dụng kháng sinh trên động vật ngày một rộng rãi mà chưa bị phát

13
hiện về vai trò đối với các căn nguyên gây bệnh ở người. Thực trạng này đã gây ra
những ảnh hưởng tiêu cực về kinh tế của mỗi quốc gia. Theo kết quả nghiên cứu
của một số tác giả cho thấy: ở bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ E.coli kháng kháng sinh
tăng từ 18% năm 2005 lên 42% năm 2008: cho thấy mức độ kháng kháng sinh
Tetracycline 88,6%, ciprofloxacine 82,3% [5]
Ngoài ra, sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi còn là mối đe dọa cho môi
trường. Kháng sinh vào cơ thể vật nuôi thông qua thức ăn hoặc bằng các con đường
khác đều được thải ra môi trường. Ảnh hưởng của việc thải kháng sinh đến môi
trường thể hiện ở các khía cạnh sau:
Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất
Quần thể vi sinh vật đất có ý nghĩa rất quan trọng trong các chu trình chuyển hoá
vật chất trong đất và cải thiện độ phì nhiêu của đất. Kháng sinh dù bằng con đường
nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bằng sinh thái hệ vi sinh vật và ảnh
hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường.
Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường
Phân của vật nuôi được nuôi dưỡng bằng các loại thức ăn có kháng sinh không
chỉ gồm các cặn bã của quá trình tiêu hoá hấp thu mà còn chứa rất nhiều loài vi sinh
vật, trong đó có nhiều loài vi khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại
kháng sinh, chính chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh
trong môi trường.
Với kháng sinh Tetracycline, sự dư thừa trong sữa còn gây thiệt hại về kinh tế vì
làm chậm quá trình lên men sữa chua và lên men pho mát.
1.1.10. Quy định tồn dƣ kháng sinh Tetracycline trong thực phẩm
Những tác hại nghiêm trọng khi sử dụng kháng sinh bừa bãi trong chăn nuôi hiện
nay thực sự đáng báo động. Nhưng nếu loại bỏ hoàn toàn kháng sinh trong điều trị,
trong thức ăn thì chắc chắn sẽ làm tăng chi phí cho nhà sản xuất, sản lượng gia súc,
gia cầm hàng năm không đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Vấn đề
đặt ra là các cơ quan quản lý liên Bộ-ngành về chất lượng vệ sinh anh toàn thực
phẩm, chất lượng thuốc thú y trong đó có kháng sinh sử dụng trong thức ăn chăn
nuôi thế nào cho đúng và an toàn cho con người. Chẳng hạn như trên thế giới, để
tăng cường kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Ủy ban Châu Âu, Mỹ

14
và các nước phát triển khác đã ban hành các quyết định, quy định giới hạn cho phép
thuốc, hóa chất dùng trong thú y bao gồm cả thuốc kháng sinh được dùng trong sản
phẩm động vật (chẳng hạn Quyết định sô 2377/90 EC), theo đó các sản phẩm có
nguồn gốc động vật phải được kiểm soát dư lượng và tuân thủ các quy trình cụ thể
(chẳng hạn Chỉ thị số 96/23 EC). Ủy ban Tiêu chuẩn về Thực phẩm Quốc tế
(Codex) đã đưa ra các quy định giới hạn dư lượng tối đa (Maximum Residue Limit,
MRL) của nhóm Tetracycline. Tức là lượng kháng sinh cao nhất được phép tồn dư
trong thực phẩm mà không ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật nuôi khi sử
dụng sản phẩm đó làm thức ăn.
Ở Việt Nam, do chưa có các đánh giá nguy cơ toàn diện cho kháng sinh này nên
chưa đưa ra được các quy định riêng. Bởi vậy, hiện tại, Việt Nam đang sử dụng các
tiêu chuẩn Codex làm quy định. Ngày 19/12/2007, Bộ Y Tế ban hành quy định giới
hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm kèm Quyết định số
46/2007/QĐ-BYT, trong đó có giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh nhóm
Tetracycline trong thực phẩm như sau:
Bảng 1.1. Dƣ lƣợng tối đa kháng sinh nhóm Tetracycline trong thực phẩm
Thực phẩm Thịt Gan Thận Sữa
MRL (μg/kg) 200 600 1200 100
1.1.11. Các phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng kháng sinh
Các phương pháp phân tích xác định dư lượng kháng sinh trong sữa cũng như
trong các mẫu thịt và các mẫu thực phẩm khác có thể phân thành các nhóm phương
pháp sau:
Phương pháp sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, rẻ tiền và cũng có độ
nhạy cần thiết. Phương pháp này chủ yếu cho phép định tính sự hiện diện của các
kháng sinh trong mẫu phân tích nhưng đôi khi cũng có thể xác định được lượng
kháng sinh trong khoảng 0,4-0,6 μg/kg đối với streptomycin, kanamycin,
gentamycin [57], khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp, ví dụ Acetone–methanol–
ammonia, 5:4,5:0,5 trong phân tích Streptomycin, Chloroform–methanol–ammonia,
1:1:1 trong phân tích Tetracycline.

15
Phương pháp điện di mao quản là kỹ thuật phân tách có nhiều ưu điểm, hiệu
quả và cho phép phân tách đồng thời hàng trăm thành phần khác nhau với nhu cầu
lượng mẫu ít. Tuy nhiên, một trong các trở ngại của phương pháp này là độ nhạy.
Khi kết hợp với đánh dấu huỳnh quang, phương pháp này có thể xác định được dư
lượng kháng sinh trong khoảng nồng độ 0,5-1,5 μg/kg mẫu thực phẩm.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để xác định dư
lượng của các aminoglycoside và các macrolide. Aminoglycoside là nhóm các
kháng sinh được đặc trưng bởi 2 hoặc hơn đường gắn với aminocyclitol thông qua
liên kết glycoside, ví dụ neomycin, streptomycin, gentamycin, kanamycin. Các
kháng sinh thuộc nhóm này ngăn cản sinh tổng hợp protein của vi khuẩn thông qua
việc gắn kết thuận nghịch với ribosome và kết quả làm tổn thương màng tế bào vi
khuẩn. Trong khi đó, các Macrolide được đặc trưng bởi vòng lactam lớn chứa 14,
15 hoặc 16 nguyên tử carbon gắn với đường thông qua liên kết glycoside. William
(1995) sử dụng phương pháp HPLC đã định lượng kháng sinh tetracycline trong các
mẫu thịt và sữa bò với ngưỡng giới hạn là 20-50 ppb trong mẫu thịt và 4-8 ppb
trong các mẫu sữa [83], xác định được dư lượng kháng sinh sulfamethazine ở 3
trong 4 mẫu sữa bò đã phân tích với hàm lượng 12,2 μg/kg cao hơn rất nhiều so với
giới hạn cho phép [20]
Sử dụng phương pháp HPLC để xác định các dư lượng kháng sinh Cefotaxime
và cephalexine trong sữa, với giới hạn xác định tương ứng là 0,1 và 0,3 ng/ml [68].
Phương pháp này cũng được áp dụng để xác định dư lượng các thuốc thú y có chứa
cephalexine. Phương pháp HPLC có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký khác
như sắc ký khí, khối phổ cho phép xác định chính xác các dư lượng kháng sinh
trong các mẫu phân tích. Tuy nhiên, đây là phương pháp yêu cầu trang thiết bị đắt
tiền và đội ngũ cán bộ thực hiện được đào tạo chuyên sâu.
Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: Để kiểm tra dư lượng kháng sinh trong các
mẫu thực phẩm có nguồn gốc động vật, phương pháp xác định sự ức chế phát triển
của vi sinh vật thường được sử dụng, các xét nghiệm này có giá rẻ và cho phép
phân tích một số lượng lớn các mẫu trong một thời gian ngắn. Phương pháp này có
phổ rộng và không đặc hiệu. Chất thử nghiệm (sữa hoặc dịch chiết mẫu thực phẩm)
được bổ sung vào môi trường thạch nuôi cấy chủng vi sinh vật và vòng kháng

16
khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch được xem xét để đánh giá mức độ tồn dư của kháng
sinh trong mẫu phân tích. Chủng vi sinh vật sử dụng trong phép thử, tất nhiên là
không thể đặc hiệu với tất cả các kháng sinh. Ví dụ, khả năng phát hiện tốt nhất đối
với các kháng sinh nhóm β-lactam là các chủng Geobacillus stearothermophilus,
Kocuria rhizophila, và Bacillus subtilis, trong khi đó đối với các kháng sinh
macrolide là chủng K. rhizophila. Giới hạn phát hiện tetracycline thấp khi sử dụng
chủng Bacillus cereus, còn đối với quinolone là Escherichia coli và Yersinia
ruckeri. Sulfonamid được phát hiện khi sử dụng các chủng G. stearothermophilus
và Bacillus pumilus. Chủng B. subtilis được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của
các aminoglycoside [24]
Phương pháp Bioautography kết hợp với sắc ký lớp mỏng để xác định dư lượng
kháng sinh trong thịt động vật và trong sữa đã tiến hành cho phép xác định được dư
lượng một số kháng sinh trong thịt và trong sữa là: 4 μg/L đối với penicillin G, 100
μg/L đối với oxytetracycline, 200 μg/L đối với streptomycin, 100 μg/L đối với
gentamicin, và 1000 μg/L đối với neomycin. Và dư lượng kháng sinh trong các mẫu
sữa đã tiệt trùng là 150,4 μg/L đối với oxytetracycline, 33,5 μg/L đối với penicillin
G, 7688,4 μg/L đối với neomycin và tỉ lệ các mẫu sữa đã phân tích bị nhiễm chiếm
1,25% [45]
1.2. CÔNG NGHỆ NANO VÀ CẢM BIẾN SINH HỌC
1.2.1. Công nghệ nano
Công nghệ nano là một trong những hướng nghiên cứu mới, có nhiều ứng dụng
trong khoa học và đời sống. Việc kết hợp giữa công nghệ nano và công nghệ sinh
học đã và đang mang lại những thành tựu to lớn, cho phép tạo ra những sản phẩm
khoa học có tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Sử dụng công nghệ
nano, các nhà khoa học đã tạo ra các hạt nano, như hạt nano vàng, hạt nano bạc, hạt
nano từ, hạt sillica phát quang, hạt quantum dot,...với những đặc tính siêu việt mà
các hạt có kích thước lớn không thể có được
Hạt nano vàng đã và đang được quan tâm nghiên cứu mạnh vì một số tính năng
đặc biệt và có tiềm năng lớn cho việc ứng dụng trong y sinh. Đặc tính ưu việt của
các hạt nano vàng là ổn định về cấu trúc, không độc, có khả năng tương hợp sinh
học cao và nhất là chúng dễ dàng hoạt hoá để gắn kết với các phân tử sinh học như

17
amino acid, protein, enzyme, DNA và các phân tử thuốc thông qua các chất có chứa
nhóm –SH. Với các đặc tính hoá học bề mặt đặc thù này, các nghiên cứu đang tập
trung sử dụng hạt nano vàng làm tâm mang cho các hệ thống phân phối thuốc nano,
ứng dụng cho chữa trị một số bệnh như ung thư, đái tháo đường .... Về khía cạnh
vật lý, nhờ vào hiệu ứng plasmon cộng hưởng nên các hạt nano vàng có thiết diện
tắt (hấp thụ và tán xạ) rất mạnh trong vùng nhìn thấy, các hạt nano vàng được sử
dụng nhiều trong các thí nghiệm theo dõi đơn phân tử và hiện ảnh các tế bào ung
thư. Với khả năng hấp thụ và tán xạ trải tới vùng hồng ngoại gần của các hạt nano
đó, người ta có thể tạo ảnh in vivo sâu trong cơ thể (10 cm) để phát hiện và tiêu diệt
các khối ung thư bằng liệu pháp quang nhiệt.
, phân
đầu dò DNA siêu nhạy (Ultrasensitive DNA detection), chẩn đoán ung thư, máy
đếm dòng tế bào (flow cytometry)…
1.2.2. Cảm biến sinh học
Các ứng dụng của công nghệ nano vào khoa học sự sống ngày càng được phát
triển rộng rãi, trong đó việc sử dụng các vật liệu nano làm các chất đánh dấu và vận
chuyển thuốc tới các tế bào đích mang bệnh đang là những hướng nghiên cứu được
nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và trong nước quan tâm phát triển. Ưu điểm
nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc nano trong việc tạo các cảm biến sinh học
(biosensor) là tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Các hạt nano thường được sử dụng
trong việc tạo các cảm biến sinh học để phát hiện các kháng sinh trong các mẫu
thực phẩm cũng như phát hiện các tác nhân gây bệnh trong cơ thể, trong môi trường
như các hạt nano vàng, các hạt nano bạc, hạt nano từ hoặc quantum dot [28]
Cảm biến sinh học được hai tác giả Clark và Lyons công bố đầu tiên năm 1962,
các năm sau đó, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc
biệt là các ngành công nghệ vật liệu nano và công nghệ thông tin, cảm biến sinh
học cũng đạt được những tiến bộ vượt bậc. Theo hiệp hội quốc tế về hóa học ứng

18
dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 đã
định nghĩa: Cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp có khả ăng cung cấp thông
tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử nhận biết
sinh học ( bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đồi ( transducer)
Hình 1.3. Mô hình cảm biến sinh học
Như vậy, có thể hiểu cảm biến sinh học là thiết bị phân tích gồm hai thành phần
chính: phần tử nhận biết sinh học và bộ phận chuyển đổi tín hiệu. Phần tử nhận biết
sinh học được cố định trực tiếp hoặc gián tiếp trên bộ phận chuyển đổi tín hiệu. Nó
là một loại vật liệu sinh học có thể liên kết hoặc phản ứng với cơ chất (chất cần
phân tích) sinh ra sản phẩm làm thay đổi tín hiệu sinh hóa trong quá trình phân tích
Đầu thu sinh học là nhưng chất có khả năng phản ứng trực tiếp với các tác nhân
cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học. Có thể phân loại cảm
biến sinh học theo loại đầu thu sinh học đó là cảm biến enzyme (enzyme sensor),
cảm biến DNA (DNA sensor), cảm biến miễn dịch….
Tác nhân cố định là một phần rất quan trọng của cảm biến sinh học. Các tác nhân
này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên đế. Nói một cách khác đây là bộ
phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học với thành phần vô cơ.
Những thành phần này vừa phải đảm bảo độ bền cơ học, vừa phải đảm bảo khả
năng chuyển tải tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ phân chuyển đổi. Việc nghiên

19
cứu lựa chọn những tác nhân cố định thích hợp giúp nâng cao độ nhạy, độ ổn định
cho cảm biến sinh học.
Bộ phận chuyển đổi: Có nhiều dạng chuyển đổi như chuyển đổi điện hóa, chuyển
đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng
các hệ vi cơ… Trong đó, chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có nhiều ưu điểm như
chế tạo đơn giản, độ nhạy và độ chính xác cao. Có nhiều phương pháp đo tín hiệu
điện hóa khi có sự tương tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích như
phương pháp đo dòng, phương pháp đo thế, phương pháp đo độ dẫn, phương pháp
đo tổng trở….
Các cảm biến miễn dịch theo nguyên tắc quang và nguyên tắc điện[56], phép thử
miễn dịch dòng chảy (flow cytometric immunoassays) đề xuất cũng như công nghệ
chip sinh học đã và đang được ứng dụng để phân tích định tính và định lượng kháng
sinh tồn dư trong sữa cũng như trong các mẫu thực phẩm [16, 75]. Cảm biến sinh
học (cảm biến quang học, optical biosensor và cảm biến điện hóa, electrochemical
biosensor) là các hệ cảm biến tương đối mới cho phép xác định nhanh và chính xác
dư lượng kháng sinh trong các mẫu phân tích. Sử dụng cảm biến sinh học để xác
định dư lượng sulfomamide trong sữa, ngưỡng xác định của cảm biến là 1,44 μg/ml
(5,92 nmol/L) [42, 88]. Sử dung biosensor, Sternesjo và cs (2006) đã xác định được
dư lượng ampicilin trong các mẫu sữa là 2,5 ng/mL với thời gian cần cho phép thử
là 10 phút [72].
1.3. TỔNG QUAN VỀ APTAMER
1.3.1. Giới thiệu về aptamer
Aptamer (thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Latin aptus – phù hợp, tiếng Hy Lạp
meros – phần) có bản chất là axit oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả năng
liên kết chặt chẽ và đặc hiệu với một phân tử đích cụ thể. Aptamer được phát hiện
từ năm 1990 bởi 2 phòng thí nghiệm độc lập Ellington & Szostak, 1990 và Tuerk &
Gold, 1990 [27,79].

20
Hình 1.4. Hình ảnh cấu trúc của aptamer khi liên kết với protein và kháng sinh
Aptamer được tạo ra theo con đường nhân tạo. Aptamer được sàng lọc bằng
phương pháp SELEX – Systematic Evolution of Ligans by Exponential enrichment
[79]. Quá trình sàng lọc bắt đầu với thư viện oligonucleotide lớn ngẫu nhiên. Các
chuỗi oligonucleotit được ủ với phân tử đích và qua nhiều vòng sàng lọc để lựa
chọn những phân tử có ái lực cao với phân tử đích. Sau đó, sử dụng PCR để khuếch
đại aptamer mong muốn. Được tổng hợp từ những năm 1990 đến nay, aptamer đã
được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối
nguy, cảm biến sinh học, điều trị ung thư, y dược, thuốc phân tử, điều trị lâm sàng,
thực phẩm… Phổ đích của aptamer rất đa dạng từ các ion, các phân tử, các chất,
thậm chí cả tế bào [11,43,55,58,59,63,81]. Aptamer còn có khả năng phát hiện các
chất độc hoặc các chất không có hoạt tính miễn dịch. Một số aptamer đã được
nghiên cứu có hằng số phân ly (Kd) trong phạm vi nanomol hoặc picomol [8].
Trong một số trường hợp vai trò như đầu dò nhận biết phân tử, aptamer có ái lực
liên kết thậm chí vượt qua các kháng thể đơn dòng [25,41,63,87]. Đã có Kit thương
phẩm của aptamer để nhận biết các phân tử: EGFR (ErbB1), INSR (Isulin
Receptor), ErbB2, EphA2, IGF-1R, HGFR (c-MET)…[40] và một số thuốc thương
phẩm được xây dựng trên nền tảng aptamer được đưa ra lưu thông trên thị trường.
Hơn thế, aptamer còn có nhiều ưu điểm so với các kháng thể (Bảng 1.2). Do đó,

21
aptamer nhân tạo đang rất được kỳ vọng là hướng nghiên cứu giải quyết đa lĩnh
vực, những căn bệnh nan y như HIV, ung thư… với giá thành ngày càng giảm.
1.3.2. Ƣu điểm của aptamer so với kháng thể
Sử dụng aptamer có nhiều ưu điểm hơn so với sử dụng các kháng thể [40]. Thứ
nhất, độ tinh khiết của aptamer cao hơn được tổng hợp và tinh sạch trong khi đó sản
xuất kháng thể phải sử dụng các hệ thống sinh học, các cơ thể sống và quá trình tinh
sạch khó khăn hơn. Trong một số trường hợp sử dụng aptamer sẽ tránh được quá
trình nhận biết nhầm các protein đích có cấu trúc tương tư như protein nội sinh hoặc
các hợp chất độc hại. Thứ hai, giá thành sản xuất aptamer thấp hơn, thời gian sàng
lọc ngắn hơn so với việc sản xuất các kháng thể. Thứ ba, phổ phân tử đích của
aptamer rất rộng so với kháng thể từ những phân tử nhỏ như ion kim loại Na+
, Zn2+
[78], lysozyme, thrombin [55,58], yếu tố đáp ứng miễn dịch truyền của virus HIV
(HIV TAR), hemin [69], interferon γ [43], yếu tố tăng trưởng nội mô mạch
máu (VEGF), [81], kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSA) [69], dopamine
[11]…đến những đại phân tử, thậm chí tế bào [23,54,55,]. Thứ tư, aptamer nhân tạo
ổn định hơn trong hầu hết các điều kiện môi trường so với kháng thể. Thứ năm,
aptamer có hạn sử dụng dài hơn và có thể biến tính thuận nghịch mà không mất đặc
tính so với kháng thể. Thứ sáu, aptamer có khả năng liên kết với các phân tử không
có tính miễn dịch hoặc các cơ chất có tính độc hại, độc tố. Thứ bảy, aptamer có thể
dễ dàng thay đổi với thuốc nhuộm, nhãn đánh dấu và các nhóm bề mặt mà không
ảnh hưởng ái lực của chúng. Cuối cùng, aptamer có khả năng cải biến hóa học linh
hoạt để ứng dụng vào nhiều chức năng, mục đích sử dụng khác nhau.

22
Bảng 1.2. So sánh ƣu điểm của aptamer và kháng thể
1.3.3. Phƣơng pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment) sàng lọc Aptamer
Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment) là phương sử dụng một nhóm các kỹ thuật sinh học phân tử để tổng
hợp in vitro oligonucleotit (có thể là ssDNA, dsDNA, RNA, các đoạn peptit) có khả
năng liên kết với phối tử, mục tiêu phối tử (phân tử đích) [27]. Trong quá trình sàng
lọc aptamer theo một quy trình SELEX gồm nhiều vòng sàng lọc với 3 quá trình:
chọn lọc những trình tự oligonucleotit (aptamer) gắn với phân tử đích từ thư viện
oligonucletit ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại những aptamer có khả năng liên
kết đặc hiệu với phân tử đích [27,80].
Đặc điểm so sánh Aptamer Kháng thể
Tổng hợp hóa học
Có Không
Chất lượng Cao hơn Thấp hơn
Giá thành sản xuất Thấp hơn Cao hơn
Thời gian sử dụng Dài hơn Ngắn hơn
Mức độ ổn định trong các điều kiện môi
trường
Cao hơn Thấp hơn
Nhận biết phân tử đích là các chất, phân tử
độc, không có hoạt tính miễn dịch
Có Không
Khả năng biến tính thuận nghịch Cao hơn Thấp hơn
Thay đổi chất đánh dấu, nhóm bề mặt
Dễ dàng mà không
ảnh hưởng hoạt tính
của aptamer
Khó, dễ ảnh
hưởng hoạt tính
sinh học của
kháng thể

23
Hình 1.5. Thu nhận aptamer theo quy trình SELEX (Systematic Evolution
of Ligands by Exponential Enrichment)
Quy trình SELEX sàng lọc aptamer bắt đầu từ một thư viện oligonucleotit DNA
[27, 79] ngẫu nhiên.
5’ 3’
Vùng cố định Vùng ngẫu nhiên Vùng cố định
Hình 1.6. Sơ đồ aptamer ssDNA
Thư viện này gồm ssDNA có độ đa dạng cao (khoảng 1025
phân tử). Mỗi ssDNA
có một vùng trung tâm là các trình tự ngẫu nhiên có n nucleotit từ 20 - 80 nucleotit
được gắn với hai đầu là những trình tự cố định (vùng cố định này là vị trí gắn mồi
cho phản ứng PCR) khoảng 18 – 21 nucleotit. Kích thước của vùng ngẫu nhiên gồm
n nucleotit quyết định sự phức tạp của thư viện, có thể tính đơn giản là 4n
phân tử.
Ví dụ, khi lựa chọn vùng ngẫu nhiên gồm 40 nucleotit sẽ tạo ra 440
phân tử khác
nhau. Việc lựa chọn số lượng nucleotit thích hợp trong vùng ngẫu nhiên giúp tăng
khả năng sàng lọc được những phân tử aptamer có ái lực cao, bền vững với phân tử
đích. Trong các thí nghiệm đã được tiến hành về aptamer, sử dụng phương pháp

24
SELEX chọn lọc trong thư viện ban đầu có 109
đến 1014
, 1015
phân tử đồng nghĩa
với việc lựa chọn vùng ngẫu nhiên có số nucleotit từ 20 – 80 [23].
Để tăng tính phức tạp của thư viện oligonucleotit, ta có thể sử dụng thư viện
oligonucleotit được cải biến hóa học, cung cấp những khả năng mới cho sự tương
tác với những phân tử đích như tăng cường sự bền vững của cấu hình
oligonucleotit. Cải biến được sử dụng khá phổ biến ở đây là thay thế nhóm 2’ – OH
của nucleotit prymidine thành nhóm 2’ – NH2. Sự cải biến này giúp bảo vệ các
RNA không bị thoái hóa do các enzyme nuclease phân hủy. Hàng loạt các dUTP
mang axit amin được cải biến ở vị trí cacbon số 5 sẽ giúp tăng cường quá trình cải
biến của DNA. Những cải biến này đã được ứng dụng cho quá trình chọn lọc
aptamer như sử dụng cho các thí nghiệm chọn lọc in vitro sàng lọc aptamer gắn với
phân tử đích dạng anion [11].
Quá trình sàng lọc, thư viện được ủ với những phân tử đích trong đệm, nhiệt độ
phù hợp. Sau đó, sử dụng các kỹ thuật khác nhau để tách các phức hợp aptamer –
đích ra khỏi những phân tử không gắn đặc hiệu. Sử dụng màng nitrocellulose là
phương pháp phổ biến để tách những phân tử protein. Ngoài ra, một số phương
pháp như cố định các phân tử đích vào một phức hệ đặc biệt như sepharose, agarose
hay hạt từ tính cũng là những phương pháp được sử dụng cho giai đoạn tách. Những
trình tự gắn đặc hiệu đã thu được sau giai đoạn phân tách được giải hấp và khuếch
đại để cung cấp thư viện cho vòng sàng lọc sau [25]. Quá trình chọn lọc và khuếch
đại này được lặp lại cho đến khi sàng lọc được aptamer có ái lực cao nhất với phân
tử đích. Phân tử aptamer được lựa chọn sẽ được chuyển sang quá trình tách dòng và
giải trình tự [23,27,79].
1.3.4. Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nƣớc
Với những ưu điểm vượt trội như trên, aptamer đã và đang trở thành nhóm chất
có nhiều tiềm năng được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: tạo cảm
biến sinh học, phát hiện các tác nhân mong muốn, phát hiện độc tố, vận chuyển
thuốc, chế tạo thuốc, điều trị bệnh, dịch tễ học…
Hiện nay có nhiều nghiên cứu tập trung vào khả năng ứng dụng của aptamer.
Trong lĩnh vực chế tạo cảm biến sinh học: aptamer được sử dụng để phát hiện
kháng sinh tồn dư trong sản phẩm như streptomycin, tobramycin, neomycin [18].

25
Aptamer được sử dụng để phát hiện độc tố nấm ở nồng độ nano gram: mycotoxin
[17], ochratoxin A (OTA) và đã xây dựng thành kit thương phẩm, fumonisin B1
(FB1), nephrotoxin [17,19]. Chúng còn được sử dụng để phát hiện các kim loại
nặng có trong nước uống như Arsen [47], thủy ngân trong cá, sữa [86]. Aptamer
RNA được sử dụng làm nền tảng để phát hiện các chất độc như Bisphenol A (BPA)
tồn tại trong giấy gói thực phẩm, hộp bảo quản thức ăn, bình sữa (theo FDA 2010),
melamin [82], thuốc trừ sâu: dư lượng Melachite Green (MG) trong cá, trứng, sữa
[33,71].
Các Kit thương phẩm của aptamer đã được thương mại hóa để nhận biết các phân
tử: EGFR (ErbB1), INSR (Isulin Receptor), ErbB2, EphA2, IGF-1R, HGFR (c-
MET)...[40].
Aptamer được sử dụng cho việc sản xuất thuốc thương phẩm đầu tiên là sản
phẩm: natri pegaptanib dạng tiêm, tên thương phẩm Macugen của công ty
Eyetech/Pfizer được cấp phép năm 2000. Đây là thuốc kháng VEGF – 165 (yếu tố
nội mô tăng trưởng mạch máu), giúp điều trị các bệnh lý ở mắt và tính thấm thành
mạch để điều trị neovascularization liên quan đến thoái hóa điểm vàng do vấn đề
tuổi tác. Chúng có bản chất là aptamer RNA kháng VEGF – 165 và các đồng vị chủ
yếu của VEGF – 165. Từ đó, đã có nhiều thuốc dựa trên các nghiên cứu về aptamer
được sử dụng trong điều trị bệnh như: AS1411, aptamer DNA liên kết đặc hiệu với
necleolin, dùng cho bệnh bạch cầu. ASRC1779, aptamer DNA liên kết đặc hiệu với
willebrand, dùng cho hội chứng nghẽn động mạch vành cấp tính. NU172, DNA
aptamer liên kết đặc hiệu Thrombin, dùng hạn chế hình thành máu động trong quá
trình phẫu thuật tim mạch [54]. Aptamer được nghiên cứu để sử dụng trong điều trị
HIV [84]. Các tác nhân gây bệnh AIDS là một retrovirus mà sử dụng vỏ
glycoprotein (MT) gp160 để ràng buộc và lây nhiễm sang các tế bào T. Gp120 liên
kết với các thụ thể tế bào T CD4 và một trong những chemokine đồng thụ là CCR5
hoặc CXCR4 và làm trung gian kết hợp giữa các hạt virus và máy chủ T-tế bào.
Aptamer liên kết siRNAs hạn chế sự liên kết của gp120 với thụ thể của tế bào người
để ngăn cản sự xâm nhập của virus.
Ngoài ra, aptamer có rất nhiều ứng dụng trong điều trị ung thư: Aptamer kháng
Tenascin – C (TN – C) có thể hạn chế phát triển khối u thần kinh đệm, u vú. TN –

26
C là một protein ngoại bào (ECM) liên quan trong quá trình sửa chữa mô. Nó được
biểu hiện quá mức trong chất nền của khối u tăng cường sự hình thành mạch tăng
cường xâm lấn của khối u [85]. Aptamer ức chế kháng nguyên màng cụ thể tuyến
tiền liệt (PSMA) trong ung thư tuyến tiền liệt. PSMA là một loại metallopeptidase
màng liên quan đến biểu hiện quá mức trên bề mặt của tế bào ung thư. PSMA cũng
được biểu hiện trong các mạch máu của nhiều khối u rắn khác. Các aptamer để ức
chế hoạt động enzyme (N-acetyl-α liên kết dipeptidase) của PSMA. Hướng nghiên
cứu đề xuất là các aptamer kháng PSMA mang siRNA gắn với các tế bào biểu hiện
PSMA để ức chế khối u [53].
Trong khi đó, aptamer là lĩnh vực nghiên cứu mới ở Việt Nam và ban đầu đã có
một số nghiên cứu, ứng dụng: Nghiên cứu tạo aptamer tái tổ hợp đặc hiệu tế bào
ung thư máu dạng Lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) ứng dụng trong chẩn đoán và
điều trị. Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đang tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất chế tạo và sử dụng bộ kit phát hiện
kháng sinh trong sữa bằng kỹ thuật nano (sử dụng aptamer). Nghiên cứu tổng hợp
các aptamer ức chế protease HIV của Đại học Khoa học Tự nhiên. Trường Đại học
Nông nghiệp Hà Nội cũng đang tiến hành các nghiên cứu ứng dụng aptamer và vật
liệu nano trong phát hiện tồn dư của thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản, các ion
kim loại nặng... trong sản phẩm nông nghiệp và môi trường. Và các nghiên cứu để
phát hiện các loại virus gây bệnh trên động và thực vật.
1.3.5. Tình hình nghiên cứu aptamer nhận biết đặc hiệu kháng sinh
Lần đầu tiên, năm 2001, Berens và cộng sự đã công bố một ARN đặc hiệu kháng
sinh Tetracycline có hằng số phân ly 1 μM. Sau đó, đến năm 2008, Niazi và cộng sự
đã sử dụng phương pháp sàng lọc cải tiến nhờ điện hóa để tạo ra hai phân tử DNA
aptamer đặc hiệu với Tetracycline và Oxytetracycline. Ngoài ra còn có Y. S. Kim
và cộng sự, nhờ phương pháp điện hóa và đo màu để sàng lọc phân tử DNA
aptamer đặc hiệu cho Oxytetracycline.
Đặc biệt hơn cả phải kể đến Zhang và cộng sự (2010), ông đã phát triển phương
pháp sử dụng một DNA aptamer có điện cực cacbon dạng thủy tinh cải biến. Trong
sự hiện diện của Tetracycline, aptamer liên kết với đích, ngăn chặn các bề mặt điện
cực và làm gián đoạn hệ thống oxi hóa khử. Điều này dẫn tới sự sụt giảm các đỉnh

27
của dòng điện. Đỉnh dòng điện với nồng độ được đo và vẽ như một đường cong tiêu
chuẩn cho mẫu trong đệm PBS, cũng chính xác tương tự như trong sữa. Mối quan
hệ tuyến tính giữa nồng độ Tetracycline và dòng điện được tìm thấy giữa 0,1 –
100ng/mL và giới hạn để phát hiện Tetracyclie trong trường hợp này là 1 ng/mL.
Không thấy có phản ứng đáng kể của penicillin, chứng minh về độ đặc hiệu của hệ
thống. Cảm biến sinh học này được minh chứng là đáng tin cậy, độ nhạy cao, không
tốn kém và là hệ thống phát hiện đặc hiệu đối với tetracycline trong các mẫu sữa.
Ngoài ra, thời gian để phát hiện chỉ có 5 phút, do đó, hệ thống này có thể hữu ích
trong việc kiểm tra an toàn thực phẩm.

28
CHƢƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid
- E.coli chủng DH5α,
- Vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen).
2.1.2. Hóa chất
- Kháng sinh Tetracycline (Sigma), cộng hợp Agarose-Tetracycline, cộng hợp
BSA-Tetracycline; HAuCl4 (Sigma), Cao nấm men, Tryptone, Agar, Ampicilin,
Chloroform, Isoamylalcohol, Agarose, SDS, Etbt, nước khử ion 2 lần, nước đã xử
lý RNA và DNA, methanol, Tween 20%, sữa, MgCl2, dung dịch gốc của dNTPs
(Hybaid, Germany), K3[Fe(CN)6], K4[Fe(CN)6], H2SO4, KCl,
- Enzyme λ exonuclease, Taq Polymerase (Promega,Germany).
- Màng PVDF – Polyvilidene Fluoride (Pall, Mexico).
- BSA – Bovine Serum Albumin (Sigma).
- Bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose (QIA gen), kit tách dòng TOPO – TA
(Invitrogen).
- Mồi ApF2 : 5’ - ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG - 3’
- Mồi ApR2: 5’– ATA CGG GAGA CCA ACA CCA AAG CTTC–3’.
- Mồi ApR2Ph: 5’Photphoryl – ATA CGG GAGA CCA ACA CCA AAG
CTTC–3’.
- Mồi ApF2SH: 5’SH - ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG - 3’
- Thư viện ssDNA (Marcogen): 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG
– N40 – AAG CTT TGG TGT T – 3’
2.1.3. Thiết bị và máy móc
- Lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc) - Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật)
- Máy li tâm (Eppendorf, Đức) - Tủ hút
- Máy đo pH (Metter, Thuỵ Sĩ) - Máy Vortex (Rotolab OSI)
- Máy soi gel (Pharmacia, Mỹ) - Tủ ấm 370
C, 280
C
- Máy PCR (Mỹ) - Tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật)

29
- Máy lắc ổn nhiệt 37o
C, 30o
C, 28o
C - Bể ổn nhiệt (Teche, OSI)
- Cân phân tích 10-4
g (Mettler Toledo) - Pipetman các loại (Gilson)
- Cân điện 10-1
g (Ohaus) - Bộ điện di DNA
- Hệ đo gồm 3 điện cực là điện cực
vàng , điện cực so sánh Ag/AgCl, điện
cực phụ trợ Pt
- Thiết bị phân tích điện hóa đa
năng PGS-HH5
- Các loại cốc đong, bình định mức, đĩa peptri, que cấy, ống facol, ống
eppendrof...
- Và các thiết bị khác của Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Phòng
Công nghệ Tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
2.1.4 . Môi trƣờng và dung dịch
- Dung dịch I: Tris – HCl 50mM; pH=8,0; EDTA 10nM; pH=8,0; Glucose
50mM.
- Dung dịch II: NaOH 0,2M; SDS 1%.
- Dung dịch III: Đệm acetate kali 3M, pH 5,5; Axit acetic băng 11,5%.
- Dung dịch phenol:chloroform:isomylalcohol (25:24:1).
- Dung dịch đệm SB (5 mM MgCl2; 50 mM Tris-HCl pH 7.6; 250 mM NaCl)
- TE: Tris – HCl 1M, pH=8,0; EDTA 0,5M; pH=8,0.
- TAE 50X: Tris – base 121g; Axit acetic băng 28,6ml; EDTA 0,5M ; pH=8,0,
nước cất vừa đủ 500ml.
- PBS 10X: Na2HPO4 80,6mM; KH2PO4 19mM; KCl 27nM; NaCl 1,37M;
pH=7,4; nước khử ion.
- Gel agarose 0,8% pha trong TAE.
- Ethidium bromide dung dịch gốc: (10mg/ml) 1g ethidium bromide; 100ml H2O.
Quấy vài giờ bằng máy khuấy từ cho tan đều. Giữ dung dịch trong lọ tối ở nhiệt độ
phòng. Khi dùng pha 20µl dung dịch gốc trong 100 ml đệm TAE 1X.
- Đệm tra mẫu DNA (loading Buffer): Tris HCl 1M, pH=8,0, 1ml; EDTA 0,5M,
pH=8,0, 0,2 ml; Glycerol 2ml; Bromphenol blue 1% , 2ml.

30
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB lỏng: Cao nấm men 0,5%; Trypton 1%; Nacl
0,5%.
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB đặc: Môi trường nuôi cấy LB lỏng bổ sung
1,5% agar.
Các môi trường trên được khử trùng ở 121ºC, 1atm, 15 phút. Kháng sinh được bổ
sung sau khi khử trùng môi trường và nhiệt độ giảm xuống còn 50ºC.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp khuếch đại gen bằng PCR
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp) là
một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực Sinh học
phân tử. Phương pháp do Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Phương pháp PCR
cho phép tổng hợp nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây là phương
pháp thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ
chính xác cao. Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ
cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống
trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ
thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA tồn tại ở dạng cuộn xoắn chặt vì vậy DNA
polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử
DNA. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên
đến 100o
C. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính và DNA polymerase có
điều kiện hoạt động.
Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR:
- DNA mẫu
- Mồi
- Enzyme polymerase chịu nhiệt
- Các loại nucleotit
- Nước
- Dung dịch đệm
- Ion Mg2+

31
Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR: Có 3 giai đoạn chính trong
phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75
chu kỳ).
- Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị
biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-95ºC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân
tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân
tử bị bẻ gãy và tạo thành các ssDNA.
- Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp (thường từ 40-70ºC, thấp
hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-5ºC) cho phép các mồi
bám vào các phân tử ssDNA, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn
này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ). Nếu nhiệt độ quá
thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu
nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả. Công thức để xác định nhiệt độ
nóng chảy (Tm) một cách tương đối là Tm=4(G+C) + 2(A+T).
- Giai đoạn kéo dài (elongation): Nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC giúp cho DNA
polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di
chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới
bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi.
Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo
dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Thành phần và chu kỳ phản ứng như sau:
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gen
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10nM 2,5
MgCl2 25mM 1,25
Mồi xuôi 10pmol/µl 1
Mồi ngược 10pmol/µl 1
DNA khuôn 10 – 100 ng/µl 5
Taq- polymease 5 unit/µl 0,3

32
H2O
Tổng thể tích
11,45
25
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gen
25 chu kỳ
2.2.2. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Trong trường hợp lý tưởng, sau phản ứng PCR chỉ có 1 sản phẩm duy nhất
nhưng thông thường sản phẩm vẫn lẫn tạp với một lượng mồi, dNTPs dư, enzyme,
DNA polymease. Nếu không tinh sạch sản phẩm PCR, những thành phần tạp có thể
ảnh hưởng đến phản ứng giải trình tự sau này. Do đó, cần tiến hành tinh sạch sản
phẩm PCR theo các bước sau (sử dụng kit của hãng QIAgen):
Bước 1: Bổ sung 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều.
Bước 2: Chuyển dịch vào cột gắn DNA và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút.
Bước 3: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dưới cột.
Bước 4: Bổ sung 500µl buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút.
Bước 5: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dưới cột.
Bước 6: Lặp lại bước 4 và 5.
Bước 7: Ly tâm 12000 v/ph, 1 phút để làm khô.
Bước 8: Bổ sung 30µl nước vào cột ly tâm 12000 v/ph, 1 phút.
Bước 9: Chuyển dịch sau ly tấm sang ống eppendorf mới và bảo quản sản phẩm
sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự.
2.2.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
Điện di agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác
định và tinh sạch các đoạn DNA.
Nhiệt độ (ºC) 94 94 55 72 72 8
Thời gian 3
phút
45 giây 45 giây 45 giây 8 phút ∞

33
Nguyên tắc: Cá
. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử
trong gel
hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
.
, quan sát.
- Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp.
- Ly tâm mẫu agarose gel.
- Điện di vào bẫy.
- Dùng hạt thủy.
: Ước lượng kích thước của các phân tử DNA
sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được
tạo dòng…). Phân tích c
. Kỹ thuật này sử dụng
một dung dịch đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách
các đoạn DNA, các đoạn DNA cần phân tách được trộn với dung dịch mẫu (loading
gel) sau đó được chuyển vào các giếng trên gel để thực hiện phân tách dưới tác
dụng của điện trường và các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử
trên gel sau khi điện di. Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose, kích
thước phân tử tuyến tính với quãng đường dịch chuyển của DNA trên gel agarose.
Thường các đoạn gen có kích thước từ 300 - 10.000 bp có thể được phân tách trên
gel agarose 0.8%. Nồng độ gel thường phụ thuộc vào kích thước sản phẩm DNA
cần phân tách.
2.2.4. Phƣơng pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu Tetracycline

34
Quá trình sàng lọc một aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline được thực hiện
bằng phương pháp ủ kháng sinh với ssDNA và ly tâm loại bỏ những thành phần
không mong muốn.
Chuẩn bị cột agarose có gắn kháng sinh đặc hiệu
- Kháng sinh được gắn với agarose được sử dụng làm chất giá trên cột với
hàm lượng 30 mg/ cột.
- Cân bằng cột với đệm 300 µl đệm SB, đảo đều để hạt agarose phân bố đều
trong dung dịch đệm, sau đó ly tâm 4000 vòng/phút, 4 phút, loại dịch.
- Bổ sung 300 µl đệm SB, đảo đều, sau đó lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 2 giờ để
cân bằng cột, ly tâm 4000 vòng/ phút, 4 phút, loại dịch.
Ủ với aptamer
- 50 µL aptamer sau khi đóng xoắn được hòa trong 200 µL đệm SB, đảo đều
- Chuyển toàn bộ dịch aptamer hòa trong SB lên cột chứa agarose-kháng sinh.
Lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng, 1 giờ
- Ly tâm 3000 v/p, 4 phút, loại dịch
Rửa, giải hấp và thu sản phẩm
- Rửa cột 3 lần với SB
- Bổ sung 250 µL đệm rửa (SB + 0.1% Tween 20) lên cột, lắc nhẹ ở nhiệt độ
phòng 15 phút. Ly tâm 3000 v/p, 5 phút, loại dịch (giữ lại dịch để kiểm tra nồng
độ)
- Rửa tiếp 2 lần, mỗi lần với 250 µL đệm rửa, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 10
phút. Ly tâm 3000 v/p, 5 phút, loại dịch (giữ lại dịch để kiểm tra nồng độ)
- Giải hấp: bổ sung 250 µL DMSO lên cột. Lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 20 phút.
Ly tâm 3000 v/p, 5 phút, thu dịch để kiểm tra nồng độ và sử dụng làm nguồn
DNA để PCR vào vòng sàng lọc tiếp theo. Cứ như vậy, sau 8 vòng sàng lọc chúng
tôi thu nhận ssDNA không bám dính, tủa lại với ethanol và dùng làm khuôn thực
hiện phản ứng PCR nhân bản các aptamer sau các vòng chọn lọc. Để theo dõi quá
trình làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu với kháng sinh Tetracycline trong suốt
quá trình sàng lọc, thư viện đưa vào và sản phẩm thu được sau giải hấp của mỗi
vòng được đo nồng độ trên máy NanoDrop 1000. Hỗn hợp trình tự gắn thu được
sau vòng sàng lọc cuối cùng được sử dụng để tách dòng và giải trình tự.

35
2.2.5. Phƣơng pháp xử lý tạo ssDNA
Trước mỗi vòng sàng lọc, sản phẩm PCR cần được xử lý để tạo ssDNA. Enzyme
lamda exonuclease được sử dụng cho quá trình tạo sợi đơn này.
Các thành phần cho phản ứng tạo sợi đơn như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tạo ssDNA
Thành phần Thể tích (μl)
Sản phẩm PCR 20
Dung dịch đệm 4
Enzyme 2
H2O 14
Tổng thể tích 40
Trộn đều các thành phần phản ứng theo bảng 2.3, hỗn hợp được ủ 4h, nhệt độ
37ºC. Cuối cùng, ssDNA sẽ được thu lại bằng cách tủa. Cách thực hiện như sau:
Bước 1: 0,475µl EDTA 0,5M và 150µl ethanol 10% được thêm vào mỗi ống
mẫu, giữ ở - 20ºC, trong 2,5h.
Bước 2: Ly tâm 12000 v/ph, 20 phút. Loại dịch nổi, thu cặn.
Bước 3: Bổ sung 30µl H2O vào mỗi ống.
Bước 4: Sau khi thu được sản phẩm ssDNA, tiến hành xử lý biến tính ở 95ºC
trong 5 phút sau đó được đưa xuống 4ºC, 15 phút rồi ủ ở 25ºC trong 7 phút để
ssDNA cuộn xoắn theo cấu trúc thứ cấp đặc thù.
2.2.6. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
Nguyên tắc: Chèn một đoạn DNA ngoại lai vào một phân tử DNA có kích thước
nhỏ (vector tách dòng) thường có dạng vòng với mục đích nhân bản đoạn DNA
ngoại lai với số lượng lớn.
Vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen) được sử dụng để gắn trực tiếp sản
phẩm phản ứng PCR. Trên sản phẩm enzyme sẽ tạo một gốc Adenin tự do đầu 3’
mà không phụ thuộc vào trình tự khuôn, trong khi đó một gốc Thymine tự do được

36
thiết kế trên vector tách dòng pCR2.1. Điều này cho phép sản phẩm PCR có thể dễ
dàng gắn vào vector khi có mặt enzyme xúc tác.
Cách tiến hành:
Sử dụng bộ kit theo vector pCR2.1 (Invitrogen) để tách dòng. Trộn các thành
phần của phản ứng và ủ ở 22º trong 30 phút.
2.2.7. Phƣơng pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.coli DH5α
Nguyên tắc: Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để
sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ
hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến (có khả năng
thấm vector tái tổ hợp). Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc được
cảm ứng. Tuy nhiên, nó sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và phụ
thuộc vào sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà người nghiên cứu sẽ
chọn phương pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D
(Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào
hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp được thực hiện với vector
chuyển gen là plasmid. Có nhiều phương pháp biến nạp như hóa biến nạp, điện biến
nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen và phương pháp vi tiêm. Trong đề
tài nghiên cứu sử dụng phương pháp hóa biến nạp: dựa vào tác dụng của CaCl2
khiến thành tế bào thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp hơn, tạo điều kiện cho DNA có
thể chui qua lỗ màng khi tiến hành sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen
kháng kháng sinh có trong plasmid ngoại lai.
Cách tiến hành:
* Chuẩn bị tế bào khả biến:
Bước 1: Tế bào E.coli chủng DH5α được nuôi lắc 200v/ph, 37ºC, qua đêm trong
môi trường LB lỏng.
Bước 2: Pha loãng dịch nuôi theo tỷ lệ 10% trong môi trường lỏng, nuôi lắc
200v/ph, 37ºC. Sau 2h thì tiến hành kiểm tra mật độ tế bào phương pháp đo OD600,
đạt từ 0,6 đến 1,0 là đạt yêu cầu.
Bước 3: Chuyển 1ml dịch nuôi sang ống eppendorf vô trùng, giữ trên đá 10 phút.

37
Bước 4: Ly tâm 3000 v/ph, 4ºC trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn tế bào.
Bước 5: Hòa cặn tế bào trong 300µl CaCl2 100mM, 4ºC thành dạng huyền dịch.
Bước 6: Ly tâm 3000 v/ph, 4ºC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn tế bào.
Bước 7: Hòa lại cặn tế bào trong 60µl CaCl2 100mM, 4ºC thành dạng huyền
dịch, giữ trong đá ít nhất 1h trước khi biến nạp hoặc bảo quản ở - 85ºC, trong
glycerol 15-30% để sử dụng sau.
* Biến nạp:
Bước 1: Các ống tế bào khả biến bảo quản ở - 85ºC được để trên đá ít nhất 30
phút.
Bước 2: Trộn DNA plasmid 10-50ng với tế bào của ống tế bào khả biến sau đó
để trên đá 30 phút.
Bước 3: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bể ổn nhiệt, tiến hành sốc nhiệt ở
42ºC trong 60 giây.
Bước 4: Chuyển nhanh eppendorf vừa sốc nhiệt trên giữ trên đá 2 phút.
Bước 5: Bổ sung 200µl môi trường LB lỏng ở nhiệt độ phòng, nuôi lắc ở 37ºC,
1h.
Bước 6: Cấy trải 100µl mẫu trên môi trường LB đặc trên đĩa peptri bổ sung
kanamycin (50µg/ml), Amp( 100µg/ml)
Bước 7: Ủ đĩa pepetri trong tủ ấm 37ºC, ít nhất 18-20h.
* Chọn dòng tế bào tái tổ hợp:
Đây là bước kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Các đĩa peptri sau khi ủ
18-20h để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ hợp. Có 3 trường hợp xảy ra:
Trường hợp 1: Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp.
Trường hợp 2: Tế bào vi khuẩn nhận plasmid nhưng không biểu hiện gen kháng
kháng sinh.
Trường hợp 3: Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợpvà biểu hiện gen
kháng kháng sinh.
Chỉ có tế bào nhận được plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới phát
triển được trên môi trường có bổ sung kháng sinh kanamycin . Chọn các khuẩn lạc
mọc riêng biệt trên đĩa thạch. Sau đó, tiếp tục cấy các các khuẩn lạc đó trong các
ống môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp, kanamycin lắc trong máy lắc

38
ổn nhiệt 200v/ph, 37◦
Ctrong 10-20h để các tế bào sinh trưởng và nhân lên số lượng
lớn để tiến hành tách DNA plasmid.
2.2.8. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Nguyên tắc: Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp
nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa
tan khác nhau của mỗi loại phân tử (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa
tan (phenol, chloroform/nước). Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở
trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa
học. Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế
hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase). Sau công đoạn tách chiết,
nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly
tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể
hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn.
Tách chiết DNA gồm các bước:
- Bước 1: Phá màng tế bào, màng nhân.
- Bước 2: Loại protein.
- Bước 3: Thu hồi nucleic acid.
Sau khi thu hồi, làm sạch các tế bào có chứa plasmid. Phá màng tế bào, màng
nhân: nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, EDTA hoặc NaOH) và
proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng
thời phân hủy các protein liên kết với DNA, dsDNA biến tính thành ssDNA nằm
cạnh nhau. Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân
tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng. Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng
mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn.
Loại protein: Lắc mẫu trong dung dịch phenol:chloroform để biến tính protein
đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein bị biến tính không hòa tan trong pha
nước có chứa nucleic acid và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước
và pha phenol:chloroform.
Thu hồi nucleic acid trong pha nước. Đưa về môi trường trung tính để ssDNA
được hồi tính trở lại. Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc

39
để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thể hòa lại trong
nước theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa trong ethanol hoặc isopropanol. Sau đó
li tâm để thu nhận lại nucleic acid. Cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ
các muối hoặc các dấu vết của isopropanol.
Cách tiến hành:
Bước 1: Hút 1ml dịch nuôi tế bào vi khuẩn trong môi trường LB lỏng bổ sung
Amp đã được nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 1,5ml, ly tâm 600 v/ph trong 5
phút, loại dịch nổi, thu cặn tế bào.
Bước 2: Bổ sung 150µl Sol I, vortex để hòa tan tế bào.
Bước 3: Bổ sung 150µl Sol II, đảo nhẹ 4-6 lần.
Bước 4: Bổ sung 150µl Sol III, đảo nhẹ 4-6 lần.
Bước 5: Thêm 450µl dung dịch phenol:chloroform:isoamylalalcohol (25:24:1),
đảo nhẹ.
Bước 6: Ly tâm với tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 15 phút để dịch trong ống
eppendorf phân tách thành 3 lớp.
Bước 7: Hút dịch nổi ở pha trên sang ống eppendorf 1,5ml mới.
Bước 8: Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1 so với mẫu, để tủa plasmid ở -20o
C
trong 2h.
Bước 9: Ly tâm tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 30 phút, thu cặn.
Bước 10: Rửa cặn bằng 500µl ethanol 70%.
Bước 11: Ly tâm 12000 v/ph trong 10 phút, thu tủa.
Bước 12: Làm khô DNA plasmid bằng máy Speed vac trong 3 phút.
Bước 13: Hòa lại cặn trong 40µl trong H2O có bổ xung RNAse.
Bước 14: Ủ ở 37o
C trong thời gian 1h để loại RNA .
Bước 15: Điện di kiểm tra kết quả tách chiết trên gel agarose 1%.
Bước 16: Bảo quản ở - 20o
C.
2.2.9. Phƣơng pháp giải trình tự axit nucleic tự động
Nguyên tắc: Phương pháp này được Frederick Sanger và cộng sự phát minh vào
năm 1977. Nguyên tắc của phương pháp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ
sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase. Với
việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP)

40
thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA
có kích thước khác nhau. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch đơn
khoảng 20 nucleotide, bốn loại dNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị
phóng xạ) và bổ sung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại
phản ứng. Các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 khi mạch đơn DNA đang
tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi loại phản ứng được
thực hiện riêng rẽ, có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Taq
DNA- polymerase, dung dịch đệm và có thêm khoảng 1% một loại ddNTP. Kết quả
phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide
và được nhận biết nhờ phương pháp điện di. Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống,
thu được trình tự các nucleotide của mạch đơn, có thể biết được trình tự sắp xếp các
nucleotide trong gen.
Cách tiến hành: Bước 1: Sau khi có sản phẩm plasmid sạch, chúng tôi xác định
trình tự nucleic acid theo phương pháp trên phương pháp này sử dụng phản ứng
PCR cùng với dd NTP có đánh dấu huỳnh quang. Các ddNTP chỉ khác các dNTP là
chúng bị mất nhóm OH ở vị trí 3, nên DNA polymerase không thể kéo dài mạch từ
các phân tử này nữa.
Bước 2: Sau khi chuẩn bị thành phần phản ứng, bổ sung ddNTp, mồi, DNA
khuôn, enzyme hỗn hợp phản ứng sẽ được đưa vào máy giải trình tự tự động.
Bước 3: Nhờ bộ phận phát tín hiệu huỳnh quang từ các ddNTP, trong quá trình
thực hiện phản ứng trình tự của các gen sẽ được ghi lại.
Bước 4: Sau khi thu được kết quả, trình tự được đăng ký trên các ngân hàng dữ
liệu trình tự hoặc so sánh với các trình tự đã được công bố trên các ngân hàng dữ
liệu quốc tế như EMBL, Genebank... để tìm ra các trình tự nucleotit tương đồng.
2.2.10. Phƣơng pháp tạo hạt vàng
Hạt nano vàng là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được tạo thành
từ kim loại vàng. Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên
và phương pháp từ trên xuống. Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo vật
liệu nano từ vật liệu khối ban đầu. Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các
ion hoặc các nguyên tử kết hợp lại với nhau. Đối với hạt nano kim loại như hạt nano

41
vàng thì phương pháp thường được áp dụng là phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc
là khử các ion kim loại như Au+
để tạo thành các nguyên tử Au0
. Các nguyên tử sẽ
liên kết với nhau tạo ra hạt nano vàng.
Có nhiều phương pháp chế tạo hạt nano vàng dạng keo. Hạt nano vàng được tạo
ra ở dạng lỏng ( các phương pháp hóa – lỏng) bằng cách khử hydro tetraclorua vàng
(HAuCl4). Sau khi hòa tan HAuCl4 trong nước dung dịch được khuấy từ nhanh
trong khi thêm các tác nhân khử vào. Do đó, Au3+
bị khử thành ion vàng một cộng
(Au+
) và nhanh chóng trở thành nguyên tử vàng và bắt đầu dần dần kết tủa dưới
dạng hạt nhỏ hơn nano mét và lớn dần cho tới khi dung dịch trở nên siêu bão hòa.
Nếu dung dịch được khuấy từ đủ mạnh thì các hạt sẽ có kích thước đồng đều.
Để ngăn chặn các hạt kết đám vào nhau, một vài tách nhân ổn định và có tính
chất hoạt động bề mặt được thêm vào. Chúng có thể được chức năng hóa bề mặt với
các nhóm chức hữu cơ tạo liên kết vô cơ – hữu cơ với các hạt vàng làm chúng được
bao quanh bởi một lớp phân tử hữu có tích điện nhằm tránh sự kết dính vào nhau
gọi là hạt keo vàng. Dưới đây là phương pháp tạo hạt nano vàng dạng keo ( Phương
pháp Turkevich)
Phương pháp Turkevich tạo hạt nano vàng bằng phương pháp hóa khử từ muối
chloride HAuCl4 dùng citrate làm tác nhân ổn định. Năm 1951, J. Turkevitch là
người đầu tiên đưa ra phương pháp này và được G. Frens hoàn thiện năm 1970. Đây
là phương pháp đơn giản nhưng cho hiệu quả cao. Nhìn chung, phương pháp này
được sử dụng để chế tạo các hạt vàng hình cầu đơn phân tán trong nước với kích
thước cỡ vài chục nano mét. Natri citrate đầu tiên có tác dụng làm tác nhân khử.
Quá trình khử với lượng natri citrate sẽ tạo một lượng ion âm citrate tương ứng làm
chất ổn định cho các hạt vàng. Sau đó ion âm citrate bám xung quanh hạt nano vàng
bằng lực hút tĩnh điện làm cho bề mặt của các hạt vàng có điện tích âm ngăn không
cho chúng kết hợp lại với nhau.
Kích thước hạt nano vàng phụ thuộc vào nồng độ citrate. Bằng cách giảm lượng
natri citrate có thể tăng đường kính của hạt vàng. Phương pháp này tạo hạt vàng tan
trong nước được bao quanh bởi các nhóm citrate có nhóm chức COO-
và OH-

42
Hình 2.1. Hạt vàng đƣợc chế tạo theo phƣơng pháp Turkevich
Cách tiến hành: Hạt nano vàng được chuẩn bị bằng phương pháp khử citrate
HAuCl4 (Grabar et al., 1995). HAuCl4 được sử dụng làm muối vàng trong thí
nghiệm. Trisodium citrate (Na3C6H5O7.2H2O) được sử dụng làm tác nhân khử.
Muối vàng được trộn đều và đun đến điểm sôi (97.50
C) với nồng độ đã chuẩn bị để
bắt đầu phản ứng tổng hợp. Sau khi thêm sodium citrate vào dung dịch nó bị chuyển
thành dạng acid citric. Tại thời điểm này dung dịch đang có màu vàng đột nhiên trở
nên trong suốt không màu. Tiếp đó, nó bị chuyển thành màu đen và sau cùng
chuyển dần sang màu vang đỏ. Dung dịch được đảo đều trong suốt quá trình thay
đổi màu. Khi sự thay đổi màu kết thúc dung dịch hạt vàng vẫn được đảo đều và làm
lạnh dần. Việc tổng hợp muối vàng được tóm tắt theo phương trình sau:
2Na3C6H5O7 + HAuCl4 → Au + 2NaCl + 2HCl + 2Na2C5H4O5 + 2CO2 + ½ H2
2.2.11. Phƣơng pháp xác định hình thái hạt nano vàng
Phương pháp chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua đã được sử dụng để
xác định hình thái của các hạt nano vàng. Kính hiển vi điện tử truyền qua là một
loại thiết bị nghiên cứu, sử dụng chum điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua
mẫu nhỏ và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới
hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, trên film quang học hoặc
ghi nhân bằng các máy chụp kỹ thuật số.

43
Hình 2.2. Mô hình nguyên lý hoạt động của máy chụp ảnh TEM
Nguyên lý làm việc của máy TEM được mô tả như sau: chùm electron được tạo
ra từ nguồn sau khi đi qua các thấu kính hội tụ sẽ tập trung lại thành một dòng
electron hẹp. Dòng electron này tương tác với mẫu và một phần sẽ xuyên qua mẫu.
Phần truyền qua đó sẽ được hội tụ bằng một thấu kính và tạo ảnh. Ảnh sau đó sẽ
được truyền đến bộ phận phóng đại. Cuối cùng tín hiệu tương tác với màn huỳnh
quang và sinh ra ánh sáng cho phép người quan sát được ảnh. Phần tối của ảnh đại
diện cho vùng mẫu đã cản trở, chỉ một số ít electron xuyên qua (vùng mẫu dày có
mật độ cao). Phần sáng của ảnh đại diện cho những vùng mẫu không cản trở, cho
nhiều electron truyền qua (vùng này mỏng hoặc có nhiệt độ thấp). Ảnh TEM thu
được sẽ là hình ảnh mặt cắt ngang của vật thể. Ảnh TEM có thể cung cấp thông tin
về hình dạng, cấu trúc, kích thước của vật liệu nano.
Tuy có ưu điểm là độ phóng đại và độ phân giải cao nhưng TEM không thể hiện
tính lập thể của vật liệu. Do vậy, TEM thường được dùng kết hợp với kính hiển vi
điện tử quét (SEM) để phát huy được ưu điểm của hai phương pháp này.
2.2.12. Phƣơng pháp xác định kích thƣớc hạt nano vàng
Kích thước trung bình và phân bố kích thước của các hạt nano vàng được đo bởi
phương pháp phân tán ánh sáng động học bằng máy Zetasizer (Nano-ZS; Malvern
Instruments, Malvern, UK). Đây là một kỹ thuật được sử dụng để xác định kích

Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Similar a Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

Similar a Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng(20)

Mais de Man_Book

Mais de Man_Book(20)

Último

Último(20)

Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng