UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA
JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS
SEL...
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA
JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS
SEL...
JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS
SELEÇÃO DE PROBIÓTICO NA AQUICULTURA
ORNAMENTAL DO ACARÁ BANDEIRA (Pterophyllum
scalare LIECHTEN...
“O êxito do trabalho não se mede pelo caminho que
você conquistou, mas sim pelas dificuldades que
superou em percorre-lo”
...
Dedico este trabalho aos meus pais, Antônio
Lázaro Meireles Dias e Ângela Maria
Rodrigues Dias, pelo apoio, carinho e
cred...
AGRADECIMENTOS
Por mais que eu não seja uma pessoa muito religiosa, acho que sou muito é do
considerado aos olhos de Deus,...
incondicionalmente grato pela benção que Deus me concedeu em colocá-los nesse
capítulo de minha vida.
Esse cantinho dedico...
SUMÁRIO
CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO GERAL: REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA.................................................................
CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO GERAL: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL
A produção de espécies com potencial ornamental vem ...
O comércio ornamental, principalmente às espécies nativas, encontra-se em
intensa expansão a nível internacional, decorren...
duas a três semanas, até o consumo do saco vitelínico e natação das larvas (DIAS &
CHELLAPA, 2003; CACHO et al., 2007; BAL...
além de não solucionar as enfermidades, causam degradação ao meio ambiente,
resistência dos patógenos e intoxicação da esp...
Uma diversidade de micro-organismos pode ser utilizada como organismos
probióticos, sendo o principal grupo estudado os da...
porém esse composto acaba sendo o mais caro e nem tanto aproveitado, desse modo à
indução de micro-organismos que facilite...
suplemento alimentar ou na água de criação (GULLIAN, 2004; VENKAT et al., 2004;
DIAS et al., 2007; JATOBÁ et al., 2008; RE...
1.4 Enterococcus faecium
A espécie Enterococcus faecium é classificada como uma bactéria ácido láctica,
Gram positiva, com...
capacidade de auto-agregação, característica essa de grande importância para fins
probiótico, pois a sua coagregação em um...
produtor, podendo impactar na perda parcial ou total de seus recursos produzidos,
consequentes da intensa proliferação pat...
A seleção de bactérias in vitro é de grande importância para atenderem as
premissas à potencialidade probiótica. Para isto...
simulando a elevada capacidade em multiplicação para competir por espaço e nutriente,
aos agentes patogênicos no hospedeir...
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de juvenis de Acará-Bandeira (Pterophyllum scala...
probiotics on the innate immune parameters of a teleost fish (Sparus aurata.).
Veterinary Immunology and Immunopathology. ...
TORRES, M. F.; GIARIZZO, T.; CARVALHO, J. R. Jr. 2008. Diagnóstico, tendência,
análise e políticas públicas para o desenvo...
VENKAT, H. K.; SAHU, N. P.; JAIN, K. K. 2004. Effect of feeding Lactobacillus-
based probiótics on the gut microflora, gro...
CAPÍTULO II
3 RESUMO
A espécie Pterophyllum scalare aponta para expressivos valores monetários em
comercialização, sendo exportada pri...
3.1 ABSTRACT
The specie Pterophyllum scalare was point the signficants monetary values in
comercialization, being exported...
4 INTRODUÇÃO
A produção de peixes com potencial ornamental cresce linearmente no mercado
internacional, apontando para val...
hídrico. Essa estratégia produtiva aponta para a prevenção de surtos de micro-
organismos patogênicos no sistema de produç...
cepas com este potencial, sendo a produção desse suplemento alimentar exige a
realização de uma série de desafios de seleç...
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Isolar e selecionar a bactéria com potencial probiótico, obtida do trato
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6 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS COM POTENCIAL
PROBÓTICO.
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descartando para as etapas de inibição in vitro as cepas catalase positivas (JATOBÁ et
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definidas pelo percentual de redução da absorbância em comparação ao meio de cultura
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Para estes resultados, foram calculadas a velocidade máxima de crescimento
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7. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A importância na aquisição de um probiótico deve seguir o isolamento de
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Figura1. Fenograma das cepas probióticas isoladas do acará bandeira com as sequências
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zootécnicos, na menor conversão alimentar e efeito imunomodulador durante 28 dias
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Tabela 1. Redução em porcentagem de absorbância na avaliação in vitro das bactérias
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bandeira, sendo todos os isolados para este fim, apontaram para progressivos resultados
frente ao desafio salobro.
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marinhos com peixes apontam para bons índices zootécnicos dos camarões, que estaria
associado aos peixes reduzirem o exces...
Para a produção de compostos lácticos suplementados com probiótico, o pH
dentre as escalas de 4-5, são utilizados à garant...
Fapespa seleção de probiótico na aquicultura ornamental do acará bandeira (pterophyllum scalare liechtenstein, 1823)
Fapespa seleção de probiótico na aquicultura ornamental do acará bandeira (pterophyllum scalare liechtenstein, 1823)
Fapespa seleção de probiótico na aquicultura ornamental do acará bandeira (pterophyllum scalare liechtenstein, 1823)
Fapespa seleção de probiótico na aquicultura ornamental do acará bandeira (pterophyllum scalare liechtenstein, 1823)
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Fapespa seleção de probiótico na aquicultura ornamental do acará bandeira (pterophyllum scalare liechtenstein, 1823)

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS SELEÇÃO DE PROBIÓTICO NA AQUICULTURA ORNAMENTAL DO ACARÁ BANDEIRA (Pterophyllum scalare LIECHTENSTEIN, 1823) BRAGANÇA 2014
  2. 2. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS SELEÇÃO DE PROBIÓTICO NA AQUICULTURA ORNAMENTAL DO ACARÁ BANDEIRA (Pterophyllum scalare LIECHTENSTEIN, 1823) BRAGANÇA 2014 Trabalho de Conclusão de Curso apresentado a Faculdade de Engenharia de Pesca, da Universidade Federal do Pará, Instituto de Estudos Costeiros, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Bacharel em Engenharia de Pesca. Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Martins Cordeiro UFPA – Campus de Bragança Co-Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Yudi Fujimoto EMBRAPA – Tabuleiros Costeiros
  3. 3. JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS SELEÇÃO DE PROBIÓTICO NA AQUICULTURA ORNAMENTAL DO ACARÁ BANDEIRA (Pterophyllum scalare LIECHTENSTEIN, 1823) Trabalho julgado para a obtenção do grau de Bacharel em Engenheiro de Pesca do Curso de Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança. DATA DE AVALIAÇÃO: 17 de Novembro de 2014 CONCEITO: BANCA EXAMINADORA Prof.ª. Drª. Cristiana Ramalho Maciel IECOS/UFPA Prof. Msc. Dioniso de Souza Sampaio IECOS/UFPA BRAGANÇA 2014
  4. 4. “O êxito do trabalho não se mede pelo caminho que você conquistou, mas sim pelas dificuldades que superou em percorre-lo” Adaptado de Abraham Lincoln
  5. 5. Dedico este trabalho aos meus pais, Antônio Lázaro Meireles Dias e Ângela Maria Rodrigues Dias, pelo apoio, carinho e credibilidade durante essa caminhada, assim como aos meus irmãos Sileno Julho Rodrigues Dias que sempre esteve presente em todos os momentos de minha vida e ao meu irmão Silvano Sandro Rodrigues Dias.
  6. 6. AGRADECIMENTOS Por mais que eu não seja uma pessoa muito religiosa, acho que sou muito é do considerado aos olhos de Deus, aquém agradeço incondicionalmente e peço para que todas as manhãs ilumine meu caminho e conceda-me forças para nunca desistir dos meus objetivos. Ao Orientador Carlos Alberto Martins Cordeiro e Co-Orientador Rodrigo Yudi Fujimoto por toda dedicação, amizade, disposição e confiança durante essa trajetória que se concretiza na realização de um sonho. Aos companheiros de Laboratório Bruna Palheta, Aline, Ryuller, Talita, Rudã Mendes, Henrique Malta, Marcela Gabay, Fabrício Ramos, Micaelle, Josi, Laís e Debora. Aos amigos que contribuíram para a realização deste trabalho Valéria Couto, Natalino Sousa, Danielle e Arthur. Ao Laboratório de Genética Aplicada em especial a Dr° Grazielle Gomes, ao mestrando Raimundo Evereste pela dedicação, apoio e análise dos dados genéticos, assim como a minha grande amiga Ivana Menezes. Agradeço incondicionalmente ao Programa de educação tutorial PETpesca, pelas oportunidades vividas, portas que abrimos e conhecimentos impares adquiridos sobre as tutorias do Dr° Rodrigo Fujimoto 2007/2011 e atual Drª Marileide Alves, que sempre agiram com afinco para a continuação e êxito do programa, assim como aos petianos. Ao Laboratório de Camarões Marinhos da UFSC, em especial ao Dr° José Luiz Mouriño, a mestranda Sheila e pós Doutoranda Gabriela, em terem me acolhido e contribuído com muita atenção e dedicação ao andamento do trabalho. A todos os lugares que tive oportunidade de estagiar e conhecer um pouco mais de perto e exercer com afinco as atribuições que cabem ao profissional de Engenharia de Pesca, Gomes da Costa em especial a Keyti e ao Adão, ao Oceanário de Pernambuco com o professor Ricardo, ao sr° Robert do Piauí, a Maria do Socorro da DNOCS Ceará, ao Blachã de Tanguanika Ceará, a empresa Poytara, ao sr° Victor Uliana do Projeto Arapaima em Belém, a AMASA ao Eng. De Alimentos Alessandro, ao Eng. De Pesca José Geison da Secretaria de Pesca de Augusto Corrêa, dentre outros. A minha excelentíssima turma de Engenharia de Pesca 2010 e a turma de técnico em pesca 2009 do IFPA. E é claro destinar esse singelo espaço em agradecimento aqueles que sempre me deram, apoio, raiva, felicidades, madrugadas em claro fazendo trabalho, ajuda sempre que possível no laboratório, companheirismo, festas e cervejada, a vocês meus Brothers Gerson Leandro, John Lennon e Diego Bazílio. Sem dúvidas
  7. 7. incondicionalmente grato pela benção que Deus me concedeu em colocá-los nesse capítulo de minha vida. Esse cantinho dedico, para ele, mais uma vez supracitado um parceirão que somando ao parágrafo anterior têm extrema importância nessa caminhada, pela sua parceria, amizade, sinceridade e fidelidade, de uma amizade indescritível, que além de me conceder extremas alegrias de confraternização, tenho o seu apoio para análise de dados, discussão para concretizados e perspectivos trabalhos, nem sempre sai uma concordância 100%, mas é isso ai quem manda ser inteligente, papo cabeça. Caramba! Como a vida nos surpreendeu nessa jornada, quanto à pedra no caminho, retirar? Não, lapidar. E o tempo esta nos dando essa revira volta e como foi difícil sermos julgados pelos nossos acertos e apedrejados pelos erros alheios hum... hum... Concluindo é o cara, meu amigão de faculdade e com certeza de trabalho, é dele mesmo que estou falando Higo Abe o famoso INHA. Agradeço também com muito carinho, respeito e admiração às pessoas com quem eu tive a oportunidade de conviver em alguns metros quadrados e adotado a denominação de “família”. Agradeço sem sombras de dúvidas a minha amigona, Tamyres Barbosa (Tatah), uma “menina” extremamente iluminada, dedicada e amorosa, praticamente a irmãzinha que tive durante a graduação, assim como agradeço ao Breno Silva (Gordinho), esse sim fez história em Bragança e deixou muitas saudades, meu irmãozinho, como estou feliz por você também está concretizando o seu sonho, desejo a você e toda a sua família muita paz, amor, sucesso e alegrias, você sabe que cada um tem um apelidinho especial e carinhoso que os batizei, mas não cabe para esse momento citar (risos), te amo irmãozão. Luciene (Luluh), Matheuzinho (Crazy Life) e ao meu amigo Bruno Brito (missão). Agradeço as amizades de Bragança, aos meus grandes amigos Wyller Mello, Wallacy Mello e Allana Seixas, praticamente oito anos de amizade, vocês estão concretizados em minha história. Aos meus pais Antônio Lázaro e Ângela Maria por todo amor, carinho, paciência, dedicação, credibilidade e apoio que sempre me deram, para a consolidação de meus objetivos, nem sempre concordando, mas apoiando as minhas tomadas de decisões. Ao meu grande irmãozão Sileno Dias e Silvano Dias, minhas princesas Clarina e Bia, minhas cunhadas Luciana e Rosa. E por fim a minha querida prima Andrea Dias, a quem tenho grande amor, companheirismo e amizade e a toda aminha família.
  8. 8. SUMÁRIO CAPÍTULO I 1 INTRODUÇÃO GERAL: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................................................................1 1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL.........................................................................1 1.2 ACARÁ BANDEIRA Pterophyllum scalare...........................................................2 1.3 PROBIÓTICO NA AQUICULTURA......................................................................4 1.4 Enterococcus faecium...............................................................................................8 1.5 BACTERIOSE NA AQUICULTURA.....................................................................9 1.6 SELEÇÃO DE PROBIÓTICOS in vitro................................................................10 2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................13 CAPÍTULO II 3 RESUMO...................................................................................................................27 3.1 ABSTRACT............................................................................................................28 4 INTRODUÇÃO.........................................................................................................29 5 OBJETIVO................................................................................................................32 5.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................32 5.2 OBJETIVO ESPECÍFICO.......................................................................................32 6 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................33 6.1 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS COM POTENCIAL PROBÓTICO.................................................................................................................33 6.2 IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE...........................................................................34 6.3 SELEÇÃO in vitro...................................................................................................35 6.4 INIBIÇÃO DE PATÓGENOS................................................................................36 6.5 CINÉTICA DE CRESCIMENTO...........................................................................36 6.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................37 7 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................38 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO III 9 CONCLUSÃO...........................................................................................................70 9.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................70
  9. 9. CAPÍTULO I
  10. 10. 1 INTRODUÇÃO GERAL: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL A produção de espécies com potencial ornamental vem se destacando no mercado aquícola mundial, sendo a modalidade apontada com crescimento de 14% desde meados da década de 90, contribuindo com valores monetários de aproximadamente US$ 200 milhões em comercialização, sendo 60% deste capital oriunda da economia de países em desenvolvimento (FAO, 2007). Com o progresso da atividade, diversos países vêm apontando grandes investimentos na cadeia produtiva comercial das espécies, destacando os Estados Unidos, Japão, União Europeia e Cingapura como os principais países consumidores nesta área (LIMA, 2003; PANNÉ, 2008; CARDOSO & IGARASHI, 2009). Os países asiáticos como principais produtores, enfatizando Cingapura com produção de US$ 68,00 milhões em 2006 (AVA, 2007). Este comércio desenvolvem significativas tendências que intensificam o seu sistema de produção, relacionando a variabilidade das espécies, elevadas taxas de retorno e remuneração de capital, melhor utilização de espaço e instalações, podendo ser implantado positivamente em centros urbanos, e atingir elevados valores de produtividade (PRANG, 2007). Na América do Sul os principais produtores no mercado ornamental são Colômbia, Peru e Brasil, sendo o território brasileiro de grande reconhecimento pelo seu potencial geográfico, hídrico e climático, que é favorável à produção de diversas espécies com potenciais a aquicultura, além de possuir grande diversidade em sua ictiofauna ornamental. O potencial produtivo aquícola nacional apontam para progressivos avanços no setor, com á Regiões Norte (12,1%), Nordeste (2,1%), Sudeste (13,2%), Sul (6,1%) e Centro-Oeste (1,3%), destacando como principais espécies produzidas, as nativas da Bacia Amazônica (IBAMA, 2008; PANNÉ, 2008; TORRES et al., 2008). No entanto, é a pesca extrativista amazônica que vêm contribuindo com dois a três milhões de dólares para a economia nacional, com taxa média de crescimento de 28,8% anualmente nas exportações dentre os anos de 2002 a 2005 e US$ 3,9 milhões, em 2007, comercializando aproximadamente 6,7 milhões destes organismos, destacando-se o Pará e Amazonas, (PANNÉ, 2008; TORRES et al., 2008). Destes estados, o Pará, no ano de 2005, atingiu o ranking nacional de segundo maior produtor de peixes ornamentais, oriundos do Rio Xingu e Rio Tapajós (TORRES et al., 2008).
  11. 11. O comércio ornamental, principalmente às espécies nativas, encontra-se em intensa expansão a nível internacional, decorrentes da grande variabilidade dentre os gêneros e exuberância dessa espécie (PRANG, 2007). Entretanto o Brasil apresenta-se emergente na competitividade dos mercados externos, sendo de suma importância o apoio à atividade e incentivos em tecnologias de reprodução, nutrição, manejo, genética e sanidade que preservem os estoques selvagens e aprimorem as tecnologias de produção, visando estabelecer uma atividade social, produtiva, econômica e sustentável (SALES & JANSEM, 2003; GODINHO, 2007). 1.2 ACARÁ BANDEIRA Pterophyllum scalare A espécie pertence à família Cichlidae apresenta características fenotípicas como; corpo triangular, perfil afilado, nadadeiras dorsal e anal longas e eretas, nadadeira pélvica fina e comprida e linha lateral interrompida (DIAS & CHELLAPA, 2003; LIMA, 2003). O acará bandeira, Pterophyllum scalare (LIECHTENSTEIN, 1823), é uma espécie endêmica da bacia Amazônica, com ampla distribuição, encontrado nas águas continentais do Peru, Colômbia, Guianas e Brasil. Habita ecótonos dulcícolas e lênticos de águas ácidas e de baixa dureza, podendo atingir 15 cm de comprimento. Na natureza são comumente encontrados em cardumes com estabelecimento de hierarquias nas proximidades de troncos, raízes e vegetação submersa, servindo de abrigo e proteção contra predadores. Se alimentam de pequenos crustáceos, larvas de mosquito e vegetais, considerando-se uma espécie de hábito alimentar onívoro-carnívora (CACHO et al., 1999; FUJIMOTO et al., 2006; RODRIGUES & FERNANDES, 2006). A maturidade sexual da espécie supracitada é alcançada entre oito a doze meses de idade, apontando para uma elevada complexidade em seu comportamento por competição territorial, coorte, acasalamento e cuidado parental, sendo a atuação do macho de grande importância no cuidado da prole contra predadores, além de adotarem como característica reprodutiva a monogamia serial. O dimorfismo sexual da espécie é pouco acentuado, possuindo o macho uma maior protuberância na região cefálica e a fêmea uma acentuada papila urogenital, que facilita a deposição dos óvulos. Sua reprodução ocorre quando o casal progenitor assepsia o substrato de desova com a boca, seguido da fêmea que pode expelir de 20 a 500 óvulos, que são fecundados posteriormente pelo macho, ficando a prole sobre o cuidado parental do casal dentre
  12. 12. duas a três semanas, até o consumo do saco vitelínico e natação das larvas (DIAS & CHELLAPA, 2003; CACHO et al., 2007; BALDISSEROTTO & GOMES, 2010). As variedades de acará bandeira como: koi, marmorato, leopardo, ouro, preto, fumaça e palhaço, produzidas em sistemas de confinamento, são linhagens geneticamente modificadas para fins ornamentais desenvolvidas por produtores da Europa, Estados Unidos e Ásia a partir de matrizes selvagens da região amazônica. Com isso, apresentam valores monetários de comercialização de até dez vezes mais elevados, quando comparados aos exemplares naturais (RIBEIRO et al., 2009; VIDAL JÚNIOR, 2005; HULATA, 2001). O tamanho mínimo de comercialização do organismo é de 2,5 cm de comprimento padrão, entretanto indivíduos de 4-6 cm, são mais atrativos para o comércio, consequente de seu período de engorda que varia entre três a quatro meses para alcançarem o tamanho adulto, apontando para valores monetários variáveis de acordo com o tamanho do corpo e nadadeiras (VIDAL JÚNIOR, 2005). Pesquisas realizadas com o ornamental utilizando dietas peletizadas ou extrusadas melhoraram o desempenho e P. scalare quando comparados a alimentos farelados RODRIGUES & FERNANDES (2006) e RIBEIRO et al. (2007), avaliaram as exigências proteicas do ornamental, encontrando resultados próximos a 32% de proteína bruta. RIBEIRO et al. (2007), ao analisarem o fornecimento de dietas isoenergéticas com 26 a 32% de PB e ZUANON et al. (2006) com níveis de proteína de 34-46% de PB na dieta de juvenis do acará bandeira, concluíram que 32 e 34% de PB, respectivamente, e 3.200 kcal de ED/kg de ração, atendem as necessidades nutricionais da espécie (RIBEIRO et al., 2007). Comparando os sistemas de criação da espécie em mono e policultivo com camarão-da-amazônia (Macrobrachium amazonicum, HELLER 1862), obteve-se melhores resultados zootécnicos, quando comparados em sistema de criação em aquários (VASQUEZ, 2008). Avaliando as exigências nutricionais de P. scalare, com dois níveis de arraçoamento e duas refeições ao dia concluiu que, o arraçoamento com 6% do peso vivo do animal, proporciona-o melhores resultados. O ornamental amazônico P. scalare, é uma das espécies mais criadas e comercializadas em âmbito nacional e internacional, justificada pela à sua fácil adaptação às condições de confinamento, boa expressão monetária de mercado, fácil reprodução em cativeiro e boa aceitabilidade as rações industrializadas. Apesar de grandes perdas de produção pouca tecnologia é desenvolvida para a profilaxia e tratamento de doenças ictiológicas, sendo a falta de informação técnica responsável pela intensificação da prática errônea de tratamentos quimioterápicos e antibióticos, que
  13. 13. além de não solucionar as enfermidades, causam degradação ao meio ambiente, resistência dos patógenos e intoxicação da espécie produzida, sendo de grande importância a profilaxia e o uso de tecnologias que sessem a presença de microrganismos que comprometam a sanidade da espécie (FUJIMOTO et al., 2006; DIAS, 2004; CARROLA et al., 2009). 1.3 PROBIÓTICO NA AQUICULTURA A definição utilizada para se classificar um probiótico na aquicultura segue os estudos de GASTESOUPE (1999), que resume o termo como micro-organismo vivo que ao se inserir no sistema de criação coloniza a microbiota intestinal do hospedeiro, beneficiando a sua saúde e equilíbrio homeostático. Além de contribuir para o crescimento e melhorar a resposta imunológica dos organismos produzidos, aponta para benefícios na qualidade das variáveis da água, na decomposição da matéria orgânica, inibe a propagação de bactérias patógenas no meio de criação, incluindo também os conceitos de biorremediação e biocontrole (MAEDA et al., 1997; GATESOUPE, 1999; KESARCODI-WATSON et al., 2008). A produção de alimentos funcionais cresce a taxas de 14% anualmente, valores que se acentuam comparados à produção de alimentos convencionais, que registram índices dentre 3% a 4% na produção mundial. A comercialização deste mercado a nível nacional aponta para 1% da produção total alimentícia no Brasil, sendo os probióticos com aproximadamente 65% deste total. Sendo essa tecnologia quando aplicada na cadeia produtiva das espécies aquícolas é uma ferramenta eficaz e não invasiva, que corrobora na restauração da flora natural do intestino de seu hospedeiro (ROLFE, 2000; GRANATO et al., 2010) Tecnologias que aprimorem o uso de probióticos na produção de organismos aquáticos crescem progressivamente com a exigente demanda empresarial, na busca de técnicas mais saudáveis no escalonamento produtivo da aquicultura (RAMIREZ et al., 2013). Os probióticos são suplementos alimentares não digeríveis, que além de atuarem positivamente no alimento suplementado, surtem efeitos benéficos ao seu hospedeiro. Quando inseridos são capazes de suportar as condições adversas fisiológicas do hospedeiro, como: resistir à acidez estomacal, colonizar o intestino e resistir às condições naturais e antrópicas do sistema de criação (GIBSON, 1999; LEE et al., 1999).
  14. 14. Uma diversidade de micro-organismos pode ser utilizada como organismos probióticos, sendo o principal grupo estudado os das bactérias ácidas lácticas, (RINGO & GASOUPE, 1998; RINGO et al., 2003). Estas são bactérias Gram positivas, caracterizadas por possuírem morfologia de bacilos e cocos, não esporuladas, inertes, anaeróbicas obrigatórias ou aerotolerantes e produtoras de ácido láctico como fundamental carboidrato durante o processo de fermentação (MELLO et al., 2013). Essas bactérias apresentam características de grande interesse à aplicação na criação animal como: fácil multiplicação e resposta imune não específica do hospedeiro, pertencente à microbiota endógena das espécies aquáticas em produção (RINGO et al., 2003; SALINAS et al., 2006; GATESOUPE, 2008; SOUZA et al., 2010). O potencial das bactérias lácticas utilizadas como probióticos, referem-se a sua resistência no trato gastrointestinal, desempenharem características terapêuticas, profiláticas e promotoras de crescimento, além de apresentarem um caráter seguro, não havendo o risco de causar enfermidades, modular a resposta imunológica do hospedeiro, apropriadas características organolépticas, pertencer a microbiota natural do intestino do animal, desempenhar efeito antagônico às bactérias patogênicas, na adesão das células epiteliais do intestino, desta forma produzindo defensinas e muco, que inibem o crescimento patogênico na superfície da mucosa intestinal, tolerar a ação dos ácidos graxos e da bile, transmudar a lactose em ácido láctico, reduzindo o pH do trato gastrointestinal, produzir substâncias antimicrobianas (bacteriocinase e peróxido de hidrogênio) (OUWEHAND et al., 2002; SENOK et al., 2005; SALINAS et al., 2006; BALCÁZAR et al, 2008; SOUZA et al., 2010; GATESOUPE, 2008; LEBEER et al., 2010). Inibindo desta forma o crescimento bacteriano patogênico pela adesão aos sítios superficiais do epitélio intestinal, competição por nutrientes, de fácil manejo as condições de armazenamento, ser resistente ao processamento de rações industriais, ser agente modulador as respostas imunológicas e contribuir no processo fagocitário da ração, proporcionando assim maior ganho de peso e resistência ao animal (FULLER, 1989; VINE et al., 2006; SUGITA et al., 2007; BALCÁZAR et al., 2008; REGITANO & LEAL, 2010; QINGHUI AI et al., 2011; FARIAS, 2012). A aplicação de bactérias probióticas na nutrição animal pode contribuir economicamente a cadeia produtiva piscícola, proporcionando menor conversão alimentar e melhores aproveitamentos de nutrientes e aminoácidos fornecidos na ração, tendo em vista que a proteína é de suma importância para o crescimento do organismo,
  15. 15. porém esse composto acaba sendo o mais caro e nem tanto aproveitado, desse modo à indução de micro-organismos que facilitem a fagocitose de absorção e digestibilidade da proteína, é fundamental à redução dos custos de produção (LIU et al., 2009; GASTESOUPE, 2008). As espécies utilizadas para produção de probióticos na criação de camarão (GARRIQUES & AREVALO, 1995; MORIARTY, 1997) e peixes (SUZER et al., 2008), estão catalogadas como: Lactobacillus acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. delbruechii, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnssonii, L. paracasei, L. plantarum, L reuteri, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. lactis, L. salivarius, Bifidobacterium adolescentes, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum, Lactococcus lactis, Leuconstoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus toyoi, Propionibacterium freudenreichii, Saccharomyces cerevisiae e S. boulardii (GASTESOUPE, 2008; HOLZAPFEL, 2001). As bactérias presentes na microbiota intestinal de organismos com potencialidade à aquicultura são apresentadas em seu maior volume por micro- organismos gram positivo, catalase negativa, não esporulados, morfologia bacilos ou cocos e produção de ácido láctico na fermentação dos carboidratos. A maior gama de gêneros catalogados na literatura com potencial probiótico se destacam os Lactobacillos, Leuconostoc, Pediococcus e Wisella (VINE et al., 2006; MOURIÑO, 2012). Os estudos de probióticos na piscicultura ornamental vêm crescendo e apontando para resultados científicos significativos nos índices zootécnicos, imunológicos e redução na conversão alimentar, quando comparados a animais nutridos com ração basal utilizando a espécies Xiphophorus helleri Heckel, 1848 (Peixe Espada), assim como para as espécies de Poecilia reticulata Peters, 1859 (Guppy), Poecilia shenops Valenciennes, 1846 (Molinésia Negra) e Xiphophorus maculatus Gunther, 1866 (Plati) (GHOSH et al., 2007). A redução das bactérias que apresentam patogenicidade ao hospedeiro, podem ser inibidas com a modificação da microbiota gastrointestinal do animal, fornecendo a este suplementação alimentar e/ou exposição de bactérias probióticas no sistema de criação (GOMEZ-GIL et al., 2000; RINGO et al., 2003; RAMIREZ et al., 2006; VASEEHARAN, 2007; WANG, 2007; TSENG, 2009). Trabalhos comprovam a modificação da microbiota intestinal com o fornecimento de bactérias probióticas como
  16. 16. suplemento alimentar ou na água de criação (GULLIAN, 2004; VENKAT et al., 2004; DIAS et al., 2007; JATOBÁ et al., 2008; RENGPIPAT et al., 2008; DIAS et al., 2011). A fauna microbiológica do trato intestinal da espécie em produção, pode ser apontado como um recurso natural e seguro, no esforço em inibir a proliferação dos agentes patogênicos nas pisciculturas (VAHJEN, et al., 2009). Essa estratégia está relacionada à tecnologia na suplementação das rações funcionais com probióticos, cuja técnica é desenvolvida visando reduzir a colonização bacteriana patogênica, dos animais confinados em empreendimentos aquícolas. Apontando como alternativa a adoção dos antibióticos nos sistemas de criação, cujos atuam no balanço microbiótico intestinal, reduzindo desta forma os micro-organismos benéficos ao hospedeiro (GOMEZ-GIL et al., 2000). Além dos probióticos apontarem como potencialidade a ausência na produção de toxinas e resíduos, que gerem resistência ou contaminação ao bioma de produção (MOURIÑO et al., 2012). O perfil na fermentação da glicose, a velocidade de crescimento em distintas temperaturas, a configuração na produção de ácido láctico, a habilidade de crescimento em soluções salinas, assim como sua tolerância frente à acidez ou alcalinidade, classificam as bactérias ácido lácticas em distintos gêneros (VAHJEN, et al., 2009). Como pode ser visto na criação de peixes já existem comprovações que a utilização de probióticos na alimentação dos animais pode melhorar a resistência imunológica e contribuir para o seu bom desempenho (KUMAR et al., 2008; NAYAK, 2010). Compostos antimicrobianos com potencial probiótico, apontam para êxito no combate a patogenicidade por bactérias, Li et al., (2006) ao utilizarem o probiótico Arthrobacter XE-7, inibiu o crescimento de Vibrio parahaemolyticus, Vibrio anguillarum e Vibrio nereis. Os probióticos além de beneficiarem o desempenho do animal em produção, podem agir de forma positiva na qualidade da água, sendo as bactérias com esse potencial, gram positivas, que em sistemas aquícolas podem atuar na conversão da matéria orgânica em CO2 de forma mais eficaz, assim como minimizar o excesso de carbono orgânico dissolvido no sistema de produção (DALMIN, 2001). No entanto o uso dos probióticos na piscicultura ornamental, apesar de emergente, ainda são escassos exigindo do meio técnico científico maiores estudos afim de contribuir na viabilidade desta tecnologia na saúde animal e fornecer melhorias de viabilidade econômica, otimizando as respostas ambientais e comerciais da cadeia produtiva aquícola.
  17. 17. 1.4 Enterococcus faecium A espécie Enterococcus faecium é classificada como uma bactéria ácido láctica, Gram positiva, com distribuição oblíqua, não virulenta e não resiste a ação de antibióticos relevantes, garantindo a sua segurança quando ingerida. Micro-organismo esse encontrado na fauna microbiológica intestinal de humanos e animais, assim também como no solo, água e alimentos fermentados (PIMENTEL, 2007; BYAPPANAHALLI, 2012), com fundamental importância na suplementação de alimentos, produzindo bacteriocinas que inibem a ocorrência de agentes patogênicos no hospedeiro e conferem as características organolépticas do produto suplementado, sobrevivência ao processo de estocagem e colonização gastrointestinal nas espécies produzidas (BHARDWAJ et al., 2008; PIMENTEL, 2012). Entre a caracterização das bactérias ácida láctica, os gêneros Lactobacillus (L. reuteri, L. johnsonii, L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. casei, L. rhamnosus, L. salivarius, L. fermentum e L. plantarum,) e Bifidobacterium (B. thermophilum, B. bifidum, , B. lactis, B. longum e B. breve) são mais relatadas, porém trabalhos avaliando o potencial probiótico de outras classes de micro-organimos menos explorados, constatam o uso probiótico na resposta profilática, terapêutica e de desempenho em animais, como as espécies da variação Lactococcus lactis, Leuconstoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, utilizadas com fins probióticos na produção animal e de compostos lácticos (JIN et al., 2000; SANDERS e KLAENHAMMER, 2001; POLLMAN et al., 2005). A inclusão de Enterococcus faecium na ração animal corrobora na redução da gordura visceral, a partir de estímulos da ativação no sistema enzimático hepático do hospedeiro, capacidade de estimular à resistência sanitária e ganho de peso. A espécie E. faecium é denominada como micro-organismos colonizador permanente e/ou transitório, no aparelho digestivo animal (DUPRE et al., 2005; POLLMAN et al., 2005; SIVIERI et al., 2007). O micro-organismo se acentua dentre outras, pela sua rápida atividade microbiológica de crescimento e produção de compostos antimicrobianos, no combate a flora patogênica intestinal, reduzido tempo de duplicação, com reprodução de até três vezes mais intensa, elevada resistência às condições ácidas estomacais, com reduzida capacidade de perda na densidade floral, quando veiculado na suplementação oral e rápida adesão aos sítios de ligação na parede intestinal do hospedeiro, expressiva
  18. 18. capacidade de auto-agregação, característica essa de grande importância para fins probiótico, pois a sua coagregação em um curto intervalo de tempo contribui a formação da barreira física intestinal, impedindo a colonização de agentes patogênicos (NALLAPAREDDY et al., 2000; LUND & EDLUND, 2001; KÓS et al., 2003). Enterococcus faecium se destaca por apontar uma grande absorção intestinal dos nutrientes e capacidade de colonização no intestino do hospedeiro, a partir dos dias iniciais de suplementação alimentar. Trabalhos utilizando E. faecium para uso probiótico, progridem linearmente na avaliação de diferentes cepas da espécie à suplementação alimentar (MARCIÑÁKOVA et al., 2004; POLLMAN et al., 2005; VAHJEN et al., 2009). Com satisfatórios resultados em distintas aplicações, para variadas espécies animais, Kinouchi (2006) e Sivieri et al. (2007), utilizando fêmeas de camundongos com tumores biologicamente induzidos, obtiveram reação anticarcinogênica, nos tratamentos de indivíduos suplementados com E. faecium, na dieta. Assim como na aquicultura Wang (2007), Merrifield et al. (2010), Kim et al. (2012) e Dias et al. (2007), comprovam a eficácia probiótica na suplementação alimentar de tilápias, linguados, trutas e rãs, utilizando Enterococcus faecium como promotor no desempenho zootécnico e resistência imunológica às espécies. 1.5 BACTERIOSES NA AQUICULTURA As bacterioses são enfermidades no sistema de produção animal responsáveis pelos incalculáveis prejuízos econômicos, comprometendo a saúde e comercialização das espécies (CAMPOS, 2010). Com a expansão da produção aquícola, apontam para limitações em sua cadeia produtiva relacionadas aos aspectos sanitários presentes pela intensificação da atividade, ocasionadas pela elevada densidade de estocagem e negligentes manejos, tornando o ambiente propício ao surgimento de doenças nas espécies produzidas. Sendo as principais causas dessas atribuídas a deterioração da matéria orgânica, resultado de um errôneo manejo alimentar e produtivo, comprometendo a qualidade da água, estresse ocasionado pelo impróprio manejo de transporte e produção, contribuindo a um ambiente susceptível a proliferação dos agentes oportunistas e patogênicos (ALKAHEM, 1994; SAKAI, 1999; FUJIMOTO et al, 2005). Sistemas de produções aquícolas são vulneráveis as enfermidades e condições ambientais. Apontando para surtos parasitários como grandes entraves monetários ao
  19. 19. produtor, podendo impactar na perda parcial ou total de seus recursos produzidos, consequentes da intensa proliferação patogênica bacteriana em curto espaço de tempo (FAO, 2012; PEIXOTO, 2012). As bacterioses mais frequentes que comprometem significativamente a cadeia produtiva da piscicultura continental, se destacam as Pseudomonas aeroginosa, Streptococcus aureus, Enterococcus durans, Micrococcus luteus, Escherichia coli e Aeromonas durans (MARTINS, 2008). Suas transmissões ocorrem de forma horizontal, sendo os seus surtos associados às mudanças climáticas, ambiente sanitário produtivo inadequado, negligentes formas de manejo e transporte (PAVANELLI, 1998; AUSTIN & AUSTIN, 2007; DUNG, 2008). Em implantações aquícolas continentais são causadoras de lesões ulcerativas na derme, equimoses, hemorragias, exoftalmia, acúmulo de secreção nos tecidos nos peixes em confinamento, além de grande causadoras de anemia, sessões nos rins e fígado, baixa imunidade e estresse animal (KIROV et al., 2002). Surtos parasitários ocasionados por micro-organismos patogênicos são denominados como principais entraves na cadeia produtiva aquícola mundialmente, neste senário estas espécies, se encontram com alto grau patogênico em ambientes sanitários de produção piscícola, principalmente as espécies continentais dulcícolas brasileiras, intervindo em drásticas perdas produtivas e comercialização de peixes (ZMYSLOWSKA et al., 2009; CARVALHO et al., 2011). Estes gêneros são considerados de grande patogenicidade, tanto na produção animal, quanto para humanos, micro-organismos gram positivo/negativo autóctone da fauna intestinal de peixes saudáveis, porém organismos oportunistas, que em ambientes sanitários inapropriados e desequilíbrio homeostático do animal desempenham patogenicidade na aquicultura, causadoras da septicemia hemorrágica bacteriana. Apontando como diagnóstico a ruptura dos vasos sanguíneos, lesões na epiderme, descamação, hemorragias ao longo do corpo do animal, despigmentação corpórea, acentuado batimento opercular, anemia, natação errática, exoftalmia, curvatura do corpo e mortalidade (WOO e BRUNO; 2003; DUNG, 2008; SILVA et al., 2012). Espécies classificadas mais vulneráveis nos empreendimentos aquícolas, capazes de produzirem enzimas extracelulares e toxinas: citosinas, hemolisinas e proteases (MARTINS, 2000; KOZINSKA, 2007). 1.6 SELEÇÃO DE PROBIÓTICOS in vitro
  20. 20. A seleção de bactérias in vitro é de grande importância para atenderem as premissas à potencialidade probiótica. Para isto Vine et al. (2004) ressalta, sendo fundamental o isolamento de cepas pertencentes à fauna intestinal do organismo em produção e a realização de ensaios in vitro que instiguem, a não patogenicidade do micro-organismo, resistência às ações fisiológicas do animal, assim como aos efeitos antrópicos e naturais do sistema de produção, como nas medidas profilática com NaCl e as oscilações das variáveis físico-químicas do ambiente, inibição de organismos indesejáveis, a partir de compostos inibitórios, e competição por espaço e nutriente à microbiota patogênica. Com o exposto, apontando como pré-requisito para maior segurança alimentar animal e ação probiótica, ao serem inseridas aos estudos in vivo. Ensaios de tolerâncias das cepas probióticas frente a concentrações salinas condizem à atividade osmótica da parede celular do procarioto, quando expostas aos sais expelidos pela bile , medidas profiláticas e desempenho dos animais em produção e viabilidade produtiva das espécies continentais com organismos marinhos, apontando relevante às análises in vitro para a capacidade de difusão osmótica do probiótico (HILL, 1990; FABREGAT et al., 2006; RIBEIRO, 2011). A atuação do suco gástrico no aparelho digestivo do animal intervém como barreira enzimática com escalas críticas de acidez e ação emulsificante dos sais biliares, letal aos micro-organismos (HILL, 1990; MARTINS et al., 2005; NITHYA & HALAMI, 2013). Assim como também a alcalinidade, podendo intervir tanto, no sistema de produção animal, durante os processos de calagem, quanto à fisiologia de seu intestino posterior (MOMOYAMA, 2004; BALCÁZAR et al., 2008; VINATEA et al., 2010). A ação antagônica dos micro-organismos é conceituada como uma zona de inibição do crescimento formado no entorno de discos embebidos em cultura bacteriana candidatas a probiótico, frente a meios de crescimento bacteriano, semeados com organismo patogênicos (VASEEHARAN & RAMASAMY, 2003). A partir de sua capacidade em produzir compostos como: ácidos orgânicos e bacteriocinas, na inibição de bactérias patogênicas gram positivas e peróxido de hidrogênio, bem como a produção de ácidos orgânicos e ácido acético no combate ao crescimento de procariotos gram negativos (VÁSQUEZ et al., 2005; GILLOR et al., 2008). Na avaliação do potencial de crescimento e tempo de duplicação do probiótico, são de grande importância seus testes in vitro, para eventual viabilidade de produção, manutenção na densidade microbiológica intestinal para perspectivas análise in vivo,
  21. 21. simulando a elevada capacidade em multiplicação para competir por espaço e nutriente, aos agentes patogênicos no hospedeiro (VINE et al., 2004; SANZ, 2007; VELEZ et al., 2007; VASILJEVIC & SHAH, 2008).
  22. 22. 2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALKAHEM, H.F. 1994. The toxicity of nickel and the effects of sublethal levels on haematological parameters and behaviour of the fish, Oreochromis niloticus. Journal of University Kuwait Science. 21: 243-252. AUSTIN, B. & AUSTIN, D.B. 2007. Bacterial fish pathogens in farmed and wild fish. 2nd ed. Ellis Horwood Ltd., Chichester, England, 364p. AVA. 2007. Agri-food & Veterinary Authority in Singapore. Singapore, 72p. BALCÁZAR, J.L.; DE BLAS, I.; RUIZ-ZARZUELA, I.; CUNNINGHAM, D., VENDRELL, D.; MÚZQUIZ, J.L. 2008. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114: 173-186. BALDISSEROTTO, B. & GOMES, L. C. 2010. Espécies nativas para a piscicultura no Brasil. 2. ed. Santa Maria-UFSM. BHARDWAJ, A.; MALIK, R. K.; CHAUHAN, P. 2008. Functional and safety aspects of enterococci in dairy food. Indian J Microbiol. 48(3): 317-325. BYAPPANAHALLI, M. N. 2012. Enterococci in the environment. Microbiol Mol Biol Rev. 76(4): 685-706. CACHO, M. S. R. F.; YAMAMOTO, M. E.; CHELLAPPA, S. 1999. Comportamento reprodutivo do acará-bandeira, Pterophyllum scalare, Cuvier e Valenciennes, 1831 (Osteichthyes: Cichlidae). Revista Brasileira de Zoologia. 16: 653-664. CACHO, M. S. R. F.; CHELLAPPA, S.; YAMAMOTO, M. E. 2007. Efeito da experiência de machos no sucesso reprodutivo em acará bandeira, Pterophyllum scalare Lichtenstein, 1823. Rev. Bras. de Zooc. 9: 41-47. CAMPOS, J.L. 2010. O cultivo do pintado (Pseudoplatystoma corruscans, Spix; Agassiz, 1829), outras espécies do gênero Pseudoplatystoma e seus híbridos. Em: BALDISSEROTO, B.; GOMES, L. C. Espécies nativas para a piscicultura no Brasil. 2 ed. Santa Maria-UFSM.
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  35. 35. CAPÍTULO II
  36. 36. 3 RESUMO A espécie Pterophyllum scalare aponta para expressivos valores monetários em comercialização, sendo exportada principalmente para os países Europeus, Americanos e Asiáticos. Porém com a intensificação do sistema de produção animal, surtos parasitológicos, principalmente atribuídos a bactérias patogênicas, vêm comprometendo a cadeia produtiva ornamental. Para isso, como alternativa segura e eficaz de combate e prevenção a enfermidades, vêm sendo adotado o uso de rações funcionais suplementadas com imunoestimulantes prebióticos e/ou probióticos, que garantam melhores valores de desempenho e resposta imunológica a espécie em produção. Para a eficácia de cepas probióticas, é fundamental o seu isolamento e seleção do animal em produção, exigindo uma série de desafios in vitro que comprovem a sua eficácia, resistindo às barreiras fisiológicas e produtivas a aquícola ornamental do P. scalare. O objetivo do trabalho foi isolar e selecionar in vitro cepas de micro-organismos ácido láctico de potencial uso probiótico do acará bandeira (Pterophyllum scalare), realizando uma série de desafios in vitro fundamentada em múltiplas características. Definindo o melhor ideótipo, por artifício das maiores médias entres as cepas avaliadas frente aos caracteres tolerância ao NaCl (0,5: 1,0: 1,5: 2,0: 2,5 e 3%), pH (4, 5, 6, 8 e 9), sais biliares (5%), halo de inibição contra seis patógenos continentais, velocidade máxima de crescimento, contagem final de células viáveis e das menores médias para o tempo de duplicação dos procariotos. De cinco cepas isoladas do trato gastrointestinal do animal com potencial uso probiótico, identificadas molecularmente como Enterococcus faecium nomeadas nas variedades Probc 1, 2, 3, 4 e 5. Dentre as cepas avaliadas a todas atenderam as premissas para uso probiótico animal, com destaque para a variedade Probc 4 que apontou melhores resultados. Palavras-chave: Desempenho zootécnico, piscicultura, ornamental, sanidade.
  37. 37. 3.1 ABSTRACT The specie Pterophyllum scalare was point the signficants monetary values in comercialization, being exported mainly to the Eurpean countries , americans and asiatics. But with a intensification of a animal production system, pathologics outbreak, mainly attribute to pathogenics bacteria, was compromising the ornamental production chain. For this as safe and effective alternative to combat and prevent the diseases, have been adopted using functional ration supplemented with probiotics immunostimulants and/or probiotics, that ensure better values of performances and imunes response to species production. To the effectiveness of probiotics strains, it is fundamental to their isolation and selection of animal production, resisting physiological barriers to productive and ornamental aquaculture of P. scalare . The objective of this research was isolate and select in vitro micro-organism acid lactic of potential probiotic use for acara-bandeira (Pterophyllum scalare), to carring a challenge series in vitro unfounded in multiple characters. Defining the best ideotype, by artificie of biggest measure between the strains to value in charge the tolerate characters to NaCl (0,5 ; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 and 3%), pH (4, 5, 6, 8 and 9) biliar salts (5%) halo of inhibition against six continental pathogens, maximum velocity of growth, countdown to feasibles cells and the smallest measures to the time of duplication of prochariotics. The five strains isolated in the gastrointestinal tract animal with a potential use probiotics identified by the molecules as Enterococcus faecium mentioned in varieties Probc 1,2,3,4 and 5. Between the strains was valued to served the premise to the use of animal probiotic, with prominent to the variety Probc 4 that was point better results. Keyboards: Zootechnic performance, fishculture, ornamental, sanity.
  38. 38. 4 INTRODUÇÃO A produção de peixes com potencial ornamental cresce linearmente no mercado internacional, apontando para valores monetários de aproximadamente US$ 200 milhões em comercialização, com 60% deste capital oriundo da economia de países em desenvolvimento (FAO, 2007). Na América Latina, o Brasil se destaca apresentando grande variedade da ictiofauna ornamental proveniente de suas bacias hídricas continentais, estando catalogadas mais de 2.500 espécies com distintos fenótipos em cores, tamanhos e formas. Entre essas regiões destacam-se os Estados do Baixo Amazonas, que contribuem para que o País ocupe a décima oitava posição no ranking dos países exportadores de peixes ornamentais do mundo (ALBUQUERQUE-FILHO, 2003; GODINHO, 2007; CARDOSO e IGARASHI, 2009; RIBEIRO, 2009). As espécies ornamentais nativas como o acará-bandeira (Pterophyllum scalare Liechtenstein, 1823), acará-disco (Simphysodon aequifasciatus Pellegrin, 1904), apaiari (Astronotus ocellatus Agassiz, 1831) e o cardinal (Paracheirodon axelrodi Schultz, 1956), estão classificadas entre as espécies de maior exportação comercial (CHAPMAN et al., 2000; GODINHO, 2007). P. scalare é um ornamental com grande potencial de comércio no mercado nacional e internacional, apontando para atrativas características morfológicas no mercado da aquariofilia e fácil adaptação aos diversos sistemas de produção animal (LIMA, 2003; PRANG, 2007). A intensificação dos sistemas de criação de peixes vem acarretando aumento de enfermidades podendo ocasionar em mortalidades e consequentes prejuízos econômicos à cadeia produtiva (SAKAI, 1999). A responsabilidade por essa problemática é atribuída principalmente às bactérias patogênicas, de característica oportunista a ambientes sanitários inadequados, alta densidade de estocagem, manejo alimentar inapropriado, estresse animal, dentre outros fatores (ALKAHEM, 1994). Para prevenir e combater as enfermidades bacterianas na piscicultura comumente são administrados antibióticos, em sua maioria, de forma negligente e errônea, podendo fornecer resistência aos micro-organismos patogênicos (VÁSQUEZ et al., 2005; DIAS et al., 2011), além do que em ambientes aquícolas esse efluente pode ser fonte de poluição (BOYD e MASSAUNT, 1999). Como medida alternativa ao uso de antibióticos nos últimos anos vem sendo adotado o fornecimento de rações funcionais suplementadas com imunoestimulantes, prebióticos e/ou probióticos, aumentando os lucros e reduzindo os impactos ao corpo
  39. 39. hídrico. Essa estratégia produtiva aponta para a prevenção de surtos de micro- organismos patogênicos no sistema de produção (OLIVEIRA et al., 2002). Os probióticos são micro-organismos com potencialidades antagônicas aos agentes patogênicos, através da colonização destes no trato digestivo do animal, competindo desta forma por nutrientes e produzindo metabólicos inibidores, aplicados em diversas áreas médicas, na agricultura e na produção animal, tendo aplicação na aquicultura a partir da década de 80, contribuindo significativamente na sanidade animal, a partir do estímulo de seu sistema imunológico (KOZASA, 1986; RAMIREZ, 2006; VINE et al., 2006; BALCAZR et al., 2008; GATESOUPE, 2008; TINH et al., 2008). Em produções aquícolas os probióticos são definidos como células microbianas que ao serem inseridas no sistema de criação colonizam o trato digestório dos animais, contribuindo com o desempenho e resposta imune do animal através do estímulo produtivo de vitaminas, ácidos graxos de curta cadeia, minerais e lipídeos, além de melhorar o aproveitamento proteico, otimizando a digestibilidade e assimilação dos nutrientes essenciais, ocasionado pelo aumento da viscosidade intestinal, melhorando, com isso, o desempenho zootécnico do indivíduo (GATESOUPE, 1999; SUGITA e ITO, 2006; KESARCODI-WATSON et al., 2008; SOUZA et al., 2010). Dentre os micro-organismos utilizados como probióticos, destacam-se as bactérias ácido lácticas, por apontarem fácil crescimento, produção de compostos antimicrobianos (ácido láctico, peróxido de hidrogênio, ácidos orgânicos e bactericidas) e estímulos à resposta imune não especifica em seu hospedeiro (RINGO e GATESOUPE, 1998; GATESOUPE, 2008). A eficácia dos probióticos é comprovada quando inseridos nos sistemas de produção aquícola, de acordo com MORIARTY (1998), ao suplementar a dieta com micro-organismos probióticos, obtendo melhorias nas variáveis da água e na sanidade de espécies aquáticas, assim como BOYD e MASSAUT (1999) comprovou seu efeito biorremediador na decomposição da matéria orgânica e na qualidade da água na aquicultura, promovendo redução nas taxas de fósforo e dos compostos nitrogenados, amônia, nitrito e nitrato. Assim, o isolamento de bactérias com interesse probiótico do trato gastrointestinal da espécie em produção é fundamental para a sua eficiência, porém este processo está associado ao isolamento de centenas de micro-organismos para este fim, entretanto a abundância dessas bactérias inviabiliza a realização de ensaios com todas as
  40. 40. cepas com este potencial, sendo a produção desse suplemento alimentar exige a realização de uma série de desafios de seleção “in vitro”, para inibição de agentes patogênicos, conhecer a cinética de crescimento, a resistência a sais biliares e os efeitos naturais e antrópicos que possam estar presentes no sistema de produção animal (ALY et al., 2008; BALCAZAR et al., 2008; EH-RHMAN et al., 2009). Um micro-organismo que atenda as premissas de um probiótico deve apontar para o maior número de características específicas, que garantam a sua eficiência como: não ser patogênico, ausente de genes que resistam a antibióticos, tolerante aos sais biliares e pH, aderência à mucosa intestinal, elevado crescimento e reprodução, capacidade de colonizar a superfície do epitélio intestinal, registro como aditivo alimentar, boa atividade antagônica aos patógenos com grande expressão de surtos a espécie produzida, especificidade ao hospedeiro, preferencialmente de origem autóctone do animal (MERRIFIELD, 2010). Portanto, o objetivo deste trabalho é isolar e selecionar “in vitro” cepas de micro-organismos ácido lácticos de potencial probiótico do peixe ornamental amazônico acará bandeira Pterophyllum scalare baseada em múltiplos desafios.
  41. 41. 5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Isolar e selecionar a bactéria com potencial probiótico, obtida do trato gastrointestinal do peixe ornamental amazônico acará bandeira Pterophyllum scalare. 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Isolar bactérias ácido lácticas do trato gastrointestinal do acará bandeira Pterophyllum scalare;  Avaliar “in vitro” as cepas isoladas submetidas a desafios com NaCl, pH, sais biliares, inibição de patógenos;  Cinética de crescimento; velocidade máxima de crescimento e tempo de duplicação;  Identificar as cepas com potencial probiótico.
  42. 42. 6 MATERIAL E MÉTODOS 6.1 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS COM POTENCIAL PROBÓTICO. As cepas das bactérias com potencial probiótico foram isoladas do trato digestório de dez juvenis saudáveis do peixe ornamental amazônico acará-bandeira Pterophyllum scalare, obtidos a partir de reprodução natural em cativeiro, com valores zootécnicos de 38,77 ± 0,58mm, 21,95 ± 0,17 mm, 32,63 ± 0,26 mm e 775,71 ± 0,15 mg para comprimento total, comprimento padrão, altura e peso, respectivamente, mensurados com o auxílio de paquímetro e balança de precisão. Os organismos foram submetidos a jejum de 24 horas, para esvaziamento intestinal. Os peixes foram eutanasiados com secção na medula espinhal, desinfetados externamente com solução de álcool 70%, e eviscerados, realizando a excisão do intestino do animal em condição estéril, com peso de 0,1g, utilizando bisturi, tesoura e placa de petri previamente esterilizados. Após coletado, o material foi macerado em solução salina de NaCl a 2%, utilizando gral e pistilo de porcelana, posteriormente transferidos para tubos Falcon contendo 9 ml de meio de cultura em caldo para Lactobacillus Man Rogosa Sharpe (MRS), meio exclusivo para o crescimento de bactérias lácticas, homogeneizado com agitador de tubos vortex e incubados por 24 horas a 35°C. Após incubada, a solução foi novamente homogeneizada e semeada em placas de petri com volume de 15 ml de meio de cultura agar Man Rogosa Sharpe (MRSA) em duplicata, homogeneizadas com esferas de micropérolas, contendo 10% de azul de anilina como indicador de cepas probióticas (RAMIREZ et al. 2006) e incubadas por um período de 48 horas a 35 °C em estufa esterilizada. Os meios de cultura foram elaborados em soluções contendo água destilada e concentrações de soluto coerente às instruções do fabricante. Esterilizados em autoclave a temperatura de 120 °C durante 20 minutos. Após o processo, os meios de cultura foram transferidos para a capela de fluxo laminar, até atingirem a temperatura ambiente, a seguir esterilizados com luz ultra violeta por 20 minutos, para posteriormente serem semeadas as cepas em meios de cultura em caldo e placa (BULLER, 2004). As colônias de interesse (bacilos e cocos gram-positivas), foram isoladas por esgotamento de estrias em meio agar MRS e avaliadas quanto à produção de catalase,
  43. 43. descartando para as etapas de inibição in vitro as cepas catalase positivas (JATOBÁ et al., 2008). Após o isolamento em estrias as colônias desenvolvidas no meio de cultura foram reconhecidas e classificadas utilizando o método de Gram. As colônias com relevância para uso probiótico, cocos e bacilos gram-positivas, foram semeadas em um novo meio de cultura Ágar MRS para esgotamento em placa. 6.2 IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE O material genético para identificação das cepas, foi extraído de isolados puros mantidos em meio semissólido, no Laboratório de Probióticos da Universidade Federal do Pará. Onde cada cepa foi semeada com o auxílio de uma alça de platina estéril em meio caldo MRS com 10 ml, incubados a 35 °C após 24 horas de crescimento bacteriano. Para a extração do DNA dos procariotos seguiu a metodologia de Sambrook et al. (1989), adaptado por Jin (2006), sendo após o cultivo das cepas, 1,4 ml de cada cultura foi centrifugada a 12000g durante 2 minutos, sendo o pellet ressuspenso em 530 µl de TE (100mM de Tris e 1 mM de EDTA), posteriormente adicionada um alíquota de 28 µl de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 20%, e 2 µl de proteinase K (2mg/ml). Mantidas em estufa a 37 °C por duas horas sem agitação, para posterior extração, utilizando 500µl de feno/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). Em seguida o sobrenadante foi retirados e 500µl expelidos em um novo micro túbulo com capacidade de 1,5 ml, adicionado 10 µl de NaCl a 5 M, para uma concentração final de 10 mM, no precipitado com duplicata de etanol absoluto gelado. Após esses procedimentos o DNA foi congelado à -20 °C durante duas horas, para posterior centrifugação á 12000g em dez minutos, sendo o precipitado lavado com solução de álcool a 70% e ressuspenso em 100 µl de TE e tratado com 2 µl de RNAse H (10 mg.ml-1 ). Para posterior análise de 4 µl por eletroforese em gel de agarose a 1 % para quantificação. A quantificação do DNA extraído foi realizada pela metodologia de fluorescência (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). Uma vez quantificado o material genético das cepas de bactérias com potencial probiótico, prosseguiu o processo de amplificação dos genes selecionados para sequenciamento e posterior identificação dos isolados do trato-gastrointestinal do acará bandeira. A região foi isolada e amplificada via PCR phenylalanyl-tRNA synthase (pheS), utilizando os seguintes iniciadores: pheS- 21-F (5' CAYCCNGCHCGYGAYATGC 3') e pheS-23-R (5'
  44. 44. GGRTGRACCATVCCNGCHCC 3'), eficaz para analise taxonômica de procariotos ácido lácticos (NAESER et al. (2007). Em seguida foi realizada a amplificação do fragmento de DNA a partir da técnica de Reação de Polimerização em Cadeia (PCR). As reações foram conduzidas com um volume de 15 µL, sendo 2,4 µL de DNTPs (1,25 mM), 1,5 µL de tampão (200 Mm Tris-Hcl- PH 8, 500 Mm KCl), 0,6 µL de MgCl2 (50 Mm), 0,6 µL de cada um dos iniciadores (50 ng/ µL), aproximadamente 50 ng de DNA molde, 0,1 µL de Taq Polimerase (5 U/ µL ) e água ultrapura para completar o volume da reação. Após o resultado de PCR o sequenciamento das amostras foi efetuado pelo método de dideoxiterninal (SANGER et al., 1977), no sequenciador automático ABI 3500 XL, utilizando reagentes do kit BigDye (ABI Prism TM Dye Terminator Cycle Sequencing Reading Raction – PE Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). As sequências foram alinhadas e editadas com o auxílio do programa BioEdit (HALL, 1999). Após sequenciado o material genético foi extraído em um arquivo individual para cada cepas em formato FASTA, para leitura no programa Basic Local Alignment Search Tool-BLAST. A identificação das cepas foi realizada inicialmente pela comparação com sequências depositadas no acervo mundial de sequências GenBank (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/), sendo a busca realizada com o algoritmo MEGABLAST. Posteriormente, as relações filogenéticas foram estimadas com construção de uma árvore de agrupamento de vizinhos, utilizando 1000 pseudo-réplicas de booststrap, sendo estas análises conduzidas no MEGA v. 6.05 (TAMURA et al., 2013). 6.3 SELEÇÃO in vitro Para os testes in vitro as cepas das bactérias com potencial probiótico isoladas foram semeadas em tubos Falcon esterilizados contendo volume de 9ml de meio de cultura caldo MRS, produzidos com distintas concentrações salinas de (0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3%), pH (4, 5, 6, 7, 8 e 9), sais biliares, 5% (p/v), semeados com um ml de cultura crescida de cada cepa e conduzidas para estufa a 35 °C durante o período de 24 horas com quatro repetições. Em seguida, realizou-se leitura de 1 (um) ml de cada cultura em cubetas para análises no espectrofotômetro a 630 nm de absorbância. Sendo a resposta de cada cepa isolada sobre distintas concentrações de NaCl, pH e sais biliares
  45. 45. definidas pelo percentual de redução da absorbância em comparação ao meio de cultura controle com 0% de NaCl, pH (7) e sem adição de sais biliares. 6.4 INIBIÇÃO DE PATÓGENOS A inibição de patógenos foi aplicada a capacidade antibacteriana das cepas ácido lácticas frente aos agentes patogênicos, analisado pelo halo de inibição, denominado pelo diâmetro da zona inibitória das cepas probióticas (HJELM et al., 2004), realizado pelo método de Ramirez et al. (2006). Com isto as cepas ácido lácteas crescidas em tubos de ensaio com meio de cultura caldo MRS, mantidos por 24 horas incubadas em estufa a 35°C, posteriormente semeadas em placas de petri contendo meio de cultura agar MRS e incubadas a 35°C durante 48 horas. Onde quatro discos com diâmetro de 0,8 cm foram retirados de placa Agar com cepas de bactérias ácido lácticas e então sobrepostas em meio de cultura Agar Triptona de Soja (TSA), recém semeadas com os patógenos: Aeromona hydrophyla, Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus durans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Micrococcus luteus incubados a 30 °C por 48 horas. A inibição do crescimento dos patógenos foi determinada, pelo diâmetro do halo de inibição de crescimento bacteriano produzido nas extremidades do disco Agar MRS. As bactérias utilizadas como probióticos apresentam como característica a competição por nutrientes e espaço com os microrganismos patogênicos do trato gastrointestinal de seu hospedeiro, tornando de fundamental importância uma elevada taxa de crescimento da cepa utilizada para tal fim (KESARCODI-WATSON et al., 2008; VINE et al., 2006). 6.5 CINÉTICA DE CRESCIMENTO As análises para determinarem a cinética de crescimento bacteriano foi realizada a um intervalo de duas horas, retirando uma amostra de 1 ml do meio de cultura para leitura em espectrofotômetro a 630 nm de absorbância. Para análise dos dados as concentrações dos inóculos foram convertidas para unidades formadoras de colônia UFC/ml. Após 24 horas de crescimento em meio de cultura líquido, uma alíquota de 100 µl de todos os frascos foram semeados em meio de cultura agar MRS, pela técnica de diluição seriada e inoculadas a 35 °C durante 48 horas, para então serem estimadas as unidades formadoras de colônia UFC/ml.
  46. 46. Para estes resultados, foram calculadas a velocidade máxima de crescimento (µmax) e tempo de duplicação (tdup) das respectivas cepas, seguindo a equação de JATOBÁ et al. (2008): Velocidade máxima de crescimento; Onde; µmax = Velocidade máxima de crescimento Z = Concentração (UFC/ml) Z0 = Concentração inicial do inóculo (UFC/ml) dt = Tempo de cultivo (horas) Tempo de duplicação; Onde; tdup = Tempo de duplicação (horas) µmax = Velocidade máxima de crescimento. 6.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA As contagens microbiológicas foram transformadas em log10(x+1), antes de serem submetidas aos testes estatísticos. Sendo os dados obtidos em cada desafio submetidos à Análise de Variância (ANOVA), com significância (p<0,05) e a diferença das médias avaliadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, analisados com o auxilio do programa estatístico ESTAT.
  47. 47. 7. RESULTADOS E DISCUSSÃO A importância na aquisição de um probiótico deve seguir o isolamento de bactérias endógenas intestinais do próprio hospedeiro, garantindo uma maior segurança como suplemento alimentar, não patogênica, habilidade em resistir ação dos sais biliares, valores estremos de pH e proteases no aparelho digestivo do indivíduo. Assim como testes antagônicos, para comprovar a produção de compostos inibitórios na competição por nutrientes, dos probióticos frente à microbiota patogênica (VINE et al., 2004). Identificação da espécie Como resultado das cepas ácido lácticas com potencial probiótico isoladas do trato intestinal do acará bandeira Pterophyllum scalare, de 16 morfotipos selecionados, cinco apontaram catalase negativa e prosseguiram aos demais ensaios in vitro, identificados molecularmente como Enterococcus faecium. Das variedades analisadas todas apontaram para uma vasta variabilidade fenotípica, para todos os caracteres avaliados neste trabalho. Os resultados da comparação do sequenciamento molecular obtidos da ferramenta BLAST do banco de dados GenBank, apontaram para os iniciadores específicos ao gene pheS eficaz na amplificação dos nucleotídeos das amostras, sendo possível identificar a espécie trabalhada, com nítida leitura cromatográfica e similaridade de identidade igual a 100%, das cinco cepas, com amostras identificadas como Enterococcus faecium, sendo que estes resultados corroboram com o filograma (Fig. 1), onde existe um elevado suporte estatístico para o arranjo contendo sequências das cinco cepas, das analisadas e sequencias previamente identificadas com E. faecium. No isolamento e seleção de cepas com potencial probiótico estudos que ao identificarem esses isolados de animais em produção, deparam-se com cepas de mesmas espécie, porém com variedades distintas. Vieira et al. (2008) ao isolarem bactérias probióticas da carcinocultura marinha, identificadas bioquimicamente com galerias API 50 CHL, como resposta a melhor cepa que suprisse o perfil probiótico, a espécie Lactobacillus plantarum com a variedade denominada L. plantarium 1, apresentou melhor índices de avaliação a seriados testes in vitro.
  48. 48. Figura1. Fenograma das cepas probióticas isoladas do acará bandeira com as sequências do gene pheS (aproximadamente 334 pares de base). Assim como Roselet (2008) ao isolar e identificar molecularmente micro- organismo com potencialidade probiótica, verificou que uma espécie pode apresentar comportamentos distintos frete a desafios in vitro. Dosta et al. (2012) ao isolar diferentes morfótipos com potencial probiótico de juvenis de Pterophyllum scalare, identificou molecularmente três cepas que apontam melhores resultado de seleção in vitro, utilizando o gene 16S, resultados que classificaram as cepas pertencentes ao gênero Bacillus sp., com a variedade Bsp2 como melhor respostas as análises, não sendo possível, averiguar agrupamento genético de similaridade à identificação taxonômica de espécie. Estudos comprovam a eficácia de Enterococcus faecium com uso probiótico como promotor do desempenho zootécnico, imunológico e flora predominante no trato gastrointestinal de animais (BENYACOUB , 2003; TARASOVA, 2010; SUN et al., 2010). Desempenho probiótica do Enterococcus faecium foi relatado por Wang (2007), ao suplementar na dieta de tilápias nilóticas, obtiveram melhores respostas de desempenho no ganho de peso animal, quando comparadas com os indivíduos controle, não suplementados com o probiótico. Ao utilizarem Enterococcus faecium na ranicultura de Rana catesbeiana, Dias et al. (2007) obteve prósperos índices
  49. 49. zootécnicos, na menor conversão alimentar e efeito imunomodulador durante 28 dias experimentais, evidenciando a eficácia do probiótico. Entretanto Kim et al. (2012), apontaram maior concentração de lisozima e resposta imunológica de linguado (Paralichthys olivaceus), durante duas semanas de suplementação com o mesmo probiótico. Assim, para trutas alimentadas com ração contendo o probiótico E. faecium, indicou para melhores respostas imunológicas, na interação do probiótico com as células do sistema imune, a partir da observação celular no epitélio intestinal do animal, induzindo a sua maior produção (MERRIFIELD et al, 2010). Para a eventual potencialidade das cinco cepas ácido lácticas isoladas de P. escalare, todas identificadas molecularmente pertencentes à espécie Enterococcus faecium, a exigência dos testes in vitro à denominação da melhor variedade, torna-se relevante na avaliação da resistência de cada cepa, aos fatores que possam intervir, no sistema produtivo e fisiológico do animal. Classificando a melhor variedade para eventuais viabilidades de produção e segurança a serem inseridas na cadeia produtiva do ornamental. Tolerância ao NaCl Os sais expelidos pelo suco gástrico e das atividades enzimáticas do intestino dos animais apresentam uma concentração que varia de 0,5-1% (p/v). Essa secreção salina, compromete a passagem do procarioto probiótico, consequente da difusão osmótica, até a suposta colonização no intestino do hospedeiro (HILL, 1990). Para o desafio de resistência osmótica das bactérias com potencial probiótico isolados de Pterophyllum scalare, todas demostraram viabilidade de resistência frente a distintas concentrações de NaCl, com estatística significativa (p<0,05) para todas as concentrações analisadas, expostas durante 24 horas ao desafio (Tab. 1).
  50. 50. Tabela 1. Redução em porcentagem de absorbância na avaliação in vitro das bactérias ácidos lácticas isoladas do trato digestório do ornamental Pterophyllum scalare submetidos aos desafios frente a concentrações de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3% de NaCl, escalas de 4, 5, 6, 8 e 9 de pH e 5% de sais biliares. Cepas NaCl0,5 (%) NaCl1,0 (%) NaCl1,5 (%) NaCl2,0 (%) NaCl2,5 (%) NaCl3,0 (%) pH4 (%) pH5 (%) pH6 (%) pH8 (%) pH9 (%) SB (%) Probc1 57,91 ± 3,58B 58,12 ± 7,83B 57,34 ± 6,99B 41,25 ± 6,05 C 56,56 ± 7,00B 68,53 ± 5,96A 0,0 ± 0,0B 0,0 ± 0,0B 17,57 ± 1,89BC 16,47 ± 1,66C 0,0 ± 0,0C 10,80 ± 0,18C Probc2 34,07 ± 6,91C 28,88 ± 2,69C 24,73 ± 3,73C 21,94 ± 3,00 D 15,99 ± 3,65D 14,51 ± 3,62C 0,0 ± 0,0B 0,0 ± 0,0B 19,10 ± 2,89B 23, 80 ± 2,73B 8,82 ± 1,02B 11,17 ± 0,78C Probc3 80,26 ± 3,04A 72,79 ± 1,64A 74,29 ± 6,28A 68,69 ± 4,85 A 69,89 ± 1,57A 59,64 ± 4,67A 0,0 ± 0,0B 23,3 ± 2,40A 13,22 ± 0,59CD 1,07 ± 0,69D 7,1 ± 2,92B 17,05 ± 0,42BC Probc4 34,43 ± 4,56C 32,37 ± 1,54C 33,57 ± 3,11C 28,33 ± 2,45 CD 26,71 ± 1,99C 23,63 ± 1,53C 25,92 ± 0,32A 15,83 ± 2,24A 46,06 ± 1,00A 36,55 ± 3,75A 34,45 ± 1,39A 62,96 ± 6,88A Probc5 66,69 ± 4,94B 70,64 ± 4,78A 67,09 ± 8,61AB 57,31 ± 8,05 B 51,02 ± 6,21B 44,84 ± 8,42B 0,0 ± 0,0B 22,80 ± 9,50A 10,35 ± 2,58D 26,25 ± 2,20B 7,1 ± 1,37B 23,20 ± 1,31B F ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** CV(%) 8,78 8,37 11,88 11,63 8,99 12,17 35,21 28,05 9,4 11,7 14,27 17,36 Letras distintas indicam diferença significativa entre os tratamentos na coluna pelo teste de Tukey (p<0,05). Os resultados explanaram crescimento bacteriano, em todas as concentrações (Tab. 2), sendo o seu tempo de exposição bem mais elevado, comparado à fisiologia animal, cuja ação do NaCl e sais biliares apontam para atividades que variam entre duas e seis horas, indicando à aptidão de todas as cepas isoladas, em bombear cátions de H+ transportado para o interior celular, tanto em condições hipertônicas quanto ação ácida do meio, através da ação enzimática das F0F1-ATPase, fornecendo as cepas condições para resistirem em ambientes salobros e as barreiras fisiológicas química de 0,85% de NaCl do suco gástrico animal, durante longos períodos de exposição (COCORAN et al., 2005). Na seleção de cepas com potencial probiótico Vieira et al. (2008) obtiveram menor perda na densidade ótica bacteriana, submetidas a desafio com 3% de NaCl, a espécie Weissella confusa. Assim como, demais autorias apontam a perda na absorbância de crescimento de micro-organismos probióticos in vitro, as concentrações elevadas de NaCl, utilizando Lactobacillus plantarum e Weissella cibaria (PAPAMANOLI et al., 2003; RICCIARDI et al., 2009). Resultados estes que corroboram aos obtidos neste trabalho, com cepas probióticas isoladas do ciclídeo acará
  51. 51. bandeira, sendo todos os isolados para este fim, apontaram para progressivos resultados frente ao desafio salobro. Resposta ao desafio às concentrações de NaCl das cepas isoladas de P. scalare, apontaram para atividade microbiana de crescimento destas, podendo contribuir para quando inseridas no sistema de produção animal, resistam à ação antrópica de criação, como no policultivo da espécie ornamental estudada com o camarão marinho Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931) em baixas salinidades, se torna uma estratégia de criação com relevância econômica para ambas as espécies de acordo com RIBEIRO (2011). E resistir às medidas profiláticas da aquicultura ornamental, como Fabregat et al., (2006) ao utilizarem concentrações de NaCl, avaliaram a resistência das larvas de Pterophyllum scalare constataram boa resistência da espécie quando submetida ao NaCl, proporcionando melhores valores de desempenho zootécnico e medida profilática contra agentes patogênicos. Resistência esta catalogada também à cepa probiótica, Lactobacillus plantarum à salinidade no sistema de produção e atividade antagônica da bactéria ácido láctica, alterando a microbiota intestinal de espécies em produção (RAMIREZ et al., 2006; GATESOUPE, 2008; VIEIRA et al., 2008). Na suplementação probiótica em policultivo de camarão marinho com tilápia do Nilo, em sistema de produção com água salinizada, Bezerra (2008) obteve redução na contagem de bactérias totais, principalmente para Vibrios sp e Pseudomonas sp, para os camarões e peixes, respectivamente, ação probiótica que também pode intervir como biocontrole quando inseridas na criação de organismos aquáticos. O policultivo de espécies dulcícolas com organismos marinhos, com destaque à produção de camarões, vem contribuindo para resultados otimistas na viabilidade econômica de produção, taxas de desempenho e redução de agentes patogênicos no meio produtivo. Hipótese comprovada no policultivo de tilápia com camarão marinho, que apontou para resultados sanitários otimistas, na diminuição às contagens de Vibrio harveyi na água, reduzindo a contaminação horizontal, comparado com monocultivo do crustáceo, micro-organismo de elevada patogenicidade na cadeia produtiva do camarão marinho Litopenaeus vannamei (TORRANS & LOWELL, 1987; GRIMON, 2003; VIEIRIA et al., 2007; VIEIRIA et al., 2008). A escala produtiva das espécies de água doce em ambientes salobros visa reduzir surtos patológicos em fazendas de camarão, técnica esta exercida com êxito no Equador e Brasil (GRIMÓN, 2003; MELLO & FARIAS, 2007). O policultivo de crustáceos
  52. 52. marinhos com peixes apontam para bons índices zootécnicos dos camarões, que estaria associado aos peixes reduzirem o excesso de matéria orgânica em suspensão, colaborando no manejo de um ambiente de produção equilibrado na carcinocultura (GRIMON, 2003; CANDIDO et al., 2005; MUANGKEOW et al., 2008). Sendo de grande relevância a via de administração do probiótico na produção animal, premissas que apontam resistência das cepas isoladas de P. escalare, para eventuais criações salobras, de policultivo ou media profilática. Tolerância ao pH No aparelho digestivo dos animais a atuação do suco gástrico intervém, como barreira enzimática com escala crítica de acidez, letal aos micro-organismos (HILL, 1990; MARTINS et al., 2005). Os resultados obtidos para esta variável apontaram diferença estatística significativa (p<0,05), pelo teste de Tukey, para todas as escalas de pH. Apontando para maior resistência nas escalas extrema de acidez e alcalinidade a cepa Probc4, com menor percentual de perda em absorbância após 24 horas (Tab. 1), submetidas ao desafio. Ocorrendo separação das médias as escalas de pH 5, 6 e 8, com crescimento microbiológico às cepas Probc2 e Probc5 (Tab. 1). Para as culturas probióticas exercerem atividades benéficas no aparelho gastrintestinal do hospedeiro, as cepas com esse potencial devem resistir às escalas de acidez e alcalinidade que interferem tanto, no sistema de produção animal, quanto à sua fisiologia. O suco gástrico expelido no aparelho digestivo das espécies, apontam para uma escala de pH com carácter extremamente ácido. Sendo de suma importância a resistência da cepa probiótica a tolerar escalas extremas de acidez (NITHYA & HALAMI, 2013). Já o potencial hidrogeniônico em sistemas de produção aquícolas, é uma variável de intensa oscilação, atingindo valores ácidos e alcalinos, dependendo da eutrofização e pluviosidade nos tanques em produções superintensivas (MOMOYAMA, 2004; VINATEA et al., 2010). Sendo de suma importância a resistência da cepa probiótica a uma ampla faixa de pH. A água do sistema de produção é apontada como uma das barreiras físico- químicas que podem intervir no crescimento microbiano de bactérias com potencial probiótico, dentre suas variáveis o pH é crítico para o desempenho das bactérias, tanto no meio produtivo, cujo pode alcançar valores extremos de acidez e alcalinidade, como também na fisiologia intestinal do animal (MARTINS et al., 2005).
  53. 53. Para a produção de compostos lácticos suplementados com probiótico, o pH dentre as escalas de 4-5, são utilizados à garantia microbiológica do produto durante o seu período útil estocado (HELLER, 2001). Sendo de fundamental importância das cepas probióticas, resistirem a escalas ácidas de pH, para eventual suplementação na ração animal durante o processo de industrialização. Realizando testes in vitro na resistência de 70 cepas do gênero de Enterococcus frente a diversas escalas de pH, MORANDI et al. (2005), constataram que a espécie Enterococcus faecium, é uma cepa resistente às oscilações dessa variável, que quando expostas em curtos períodos, se é mantido o seu ciclo logarítmico, resultados que corroboram aos obtidos no trabalho supracitado, apontando para significativa resistência das cepas de E. faecium isoladas do ornamental acará bandeira, expostas durante 24 horas em diferentes concentrações de pH. Realizando teste in vitro sobre diferentes concentrações de pH, na classificação de micro-organismos probióticos, Lactobacillus plantarum, apontou reduzida perda de viabilidade em meios contendo pH ácidos (PAPAMANOLI et al., 2003). Vieira et al. (2008), avaliando cepas probióticas em escalas de pH ácido, não obteve êxito no crescimento bacteriano, porém em escalas alcalinas suas espécies apresentaram tolerância a essa escala, com valores significativamente maiores para a espécie Weissella confusa, apontando para maior cinética bacteriana e efeito probiótico da espécie em escalas mais elevadas de pH. Resultados que corroboram aos alcançados na seleção de cepas probióticas de Pterophyllum scalare, entre as cinco variedades isoladas e identificadas, a cepa Probc 4 mostrou maior resistência às escalas extremas de acidez e alcalinidade, podendo exercer atividade probiótica na água e no intestino do animal, de acordo com a sua via de aplicação. Assim, a resistência das bactérias probióticas a ação ácida do suco gástrico do animal, são fundamentais para o êxito desta tecnologia e atenda as definições de GATESOUPE (1999), para a colonização do micro-organismo na mucosa intestinal do animal. CHAVES et al. (1999) obteve êxito em testes in vitro quando submetido o probiótico Lactobacillus acidophilus a concentração ácida de pH, com crescimento bacteriano de 55,61, 26,14 e 11,70%, da cepa exposta durante 1, 2 e 3 horas, respectivamente. Para este trabalho os resultados apontam que a variedade Probc3, Probc 4 e Probc 5 das cepas isoladas, crescem em meio ácido e alcalino durante os períodos de exposição testados no desafio, 24 horas. Característica essa que colabora à potencialidade do probiótico a resistir às condições ácidas, tanto na fisiologia animal

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