Imunohistoquimica

75.346 visualizações

Publicada em

Aula sobre Imunohistoquimica da disciplina Imunologia I

Publicada em: Saúde e medicina
1 comentário
21 gostaram
Estatísticas
Notas
Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
75.346
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
334
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
1.897
Comentários
1
Gostaram
21
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide

Imunohistoquimica

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045<br />IMUNOHISTOQUÍMICA<br />Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Patrícia Meira, sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.<br />
  2. 2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br />
  3. 3. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br />A imunohistoquímica combina técnicas histológicas, imunológicas e bioquímicas objetivando identificar componentes celulares ou tissulares (denominados antígenos) através da reação com anticorpos específicos, em uma secção histológica, esfregaço ou suspensão celular.<br />A denominação imunohistoquímica é habitualmente utilizada para a avaliação de fragmentos tissulares. Imunocitoquímica, por sua vez, se refere à avaliação a nível celular.<br />
  4. 4. Essa técnica imunológica possibilita visualizar distribuição e localização de componentes celulares específicos na célula/tecido. Para tal, o antígeno deve permanecer insolúvel e sua estrutura terciária deve estar preservada, permitindo a ligação com o anticorpo.<br />CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br />
  5. 5. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li>Vantagens
  6. 6. Custo baixo a moderado.
  7. 7. Alta sensibilidade e especificidade.
  8. 8. Permite a análise de 1 ou múltiplos antígenos simultaneamente.
  9. 9. Possibilidade de detecção e localização de proteínas intracelulares, bem como do tráfego intracelular. Para essa finalidade, as membranas celulares são solubilizadas com Triton.
  10. 10. É possível analisar 1 antígeno particular em vários tecidos em uma mesma lâmina.
  11. 11. Aplicável a células vivas.
  12. 12. Padronização e realização simples.
  13. 13. Necessidade de pequenas quantidades de tecido.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li>Desvantagens
  14. 14. Necessidade de mão de obra especializada.
  15. 15. Processamento demorado da amostra.
  16. 16. Não automação.
  17. 17. Preparações não permanentes.
  18. 18. Técnicas especiais para fixação e inclusão de tecidos para imunohistoquímica nem sempre estão presentes.
  19. 19. Necessidade de microscopia especializada (quando usando fluorocromos).
  20. 20. Variabilidade do resultado conforme a leitura realizada pelo observador na imunohistoquímica por fluorescência.</li></li></ul><li>PRINCÍPIOS<br />
  21. 21. PRINCÍPIO DA TÉCNICA<br />O anticorpo de detecção, antígeno-específico, é marcado com uma substância fluorescente, elemento radioativo, ouro coloidal ou enzima. <br />As amostras são, então, incubadas com substratos enzimáticos (quando Ac está marcado com enzima), produzindo um produto que sofre precipitação direta no corte histológico, gerando uma coloração castanha ou vermelha, que reflete a distribuição do antígeno alvo no tecido/célula analisado. <br />
  22. 22. PRINCÍPIO DA TÉCNICA<br />A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação é realizada em microscópio óptico comum ou fluorescente.<br />Frequentemente o anticorpo de detecção é biotinilado (conjugado com biotina, uma vitamina com alta afinidade por estreptoavidina) nos ensaios enzimáticos. Essa metodologia serve para ampliar o sinal gerado, tornando o método mais sensível.<br />
  23. 23. PROPRIEDADES DOS FLUOROCROMOS<br />
  24. 24. ENZIMAS E SEUS CROMÓGENOS<br />
  25. 25. PASSOS DA TÉCNICA<br />
  26. 26. Secções Histológicas<br />Recuperação Antigência<br />Bloqueio Enzima Endógena<br />Bloqueio Background<br />Anticorpo Primário <br />Anticorpo Secundário<br />Substrato Cromógeno<br />Counterstain<br />Montagem<br />Observação (Microscopia)<br />Slide 3 of 23<br />PASSOS DA TÉCNICA<br />
  27. 27. O preparo da amostra a ser analisada deve seguir as etapas normais das histotécnicas habituais:<br />1) Colheita da amostra biológica.<br />2) Preservação por fixação ou congelamento em nitrogênio líquido.<br /><ul><li>Fixadores: formaldeído 4 a 10%, paraformaldeído 4%, periodato-lisina-paraformaldeído (PLP), glutaraldeído, Carnoy (etanol:clorofórmio:ácido acético glacial 7:2:1) etc.</li></ul>PREPARO DA AMOSTRA<br />
  28. 28. PREPARO DA AMOSTRA<br />3) Desidratação<br /> É realizada com álcool absoluto.<br />4) Clareamento<br /> Para tal, é utilizado o xilol. <br /> Os efeitos lesivos causados pelo uso do xilol podem ser revertidos por tripsina.<br />5) Inclusão em blocos de parafina<br /> A temperatura não deve ultrapassar 60 °C.<br />6) Obter secções em micrótomo e re-hidratar com xilol e álcool em diferentes concentrações.<br />
  29. 29. AMOSTRAS<br />Células (pellet)<br />Células em monocamada<br />Secções tissulares com vários tipos celulares e componentes da matriz extracelular<br />
  30. 30. <ul><li>A fixação nas técnicas histológicas rotineiras utiliza formalina, que pode mascarar alguns epítopos antigênicos, fazer ligação cruzada ou destruí-los. Por esse motivo, torna-se necessário realizar o desmascaramento, facilitando o acesso do anticorpo ao epítopo alvo. A recuperação antigênica pode ser feita por diversas técnicas:
  31. 31. Digestão enzimática proteolítica: tripsina, quimotripsina, pepsina, proteinase K.
  32. 32. Pelo calor: microondas, banho-maria, panela de pressão.
  33. 33. Forma combinada: digestão enzimática + calor.</li></ul>RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA<br />
  34. 34. BLOQUEIO DE ENZIMA ENDÓGENA PEROXIDASE<br /><ul><li>Normalmente ocorre atividade de peroxidase em hemácias, granulócitos, hepatócitos, sistema nervoso central e tecidos sensíveis a estrogênio.
  35. 35. As peroxidases endógenas, citocromo oxidase e catalase produzem produtos de reação com a diaminobenzidina (DAB), sendo necessário o bloqueio das mesmas com:
  36. 36. Peróxido de hidrogênio (0,3-0,5%) em metanol.
  37. 37. Azida sódica (0,1%) em H2O2 (0,3%).</li></li></ul><li>BLOQUEIO DE ENZIMA ENDÓGENA FOSFATASE<br /><ul><li>Isoenzimas de fosfatase alcalina são encontradas na mucosa intestinal, túbulos proximais renais, regiões calcificadas, superfície de células endoteliais arteriais e capilares, neutrófilos, linfócitos, etc.
  38. 38. O bloqueio da fosfatase alcalina é realizado com:
  39. 39. Levamizole 1-5mmol/L adicionado na solução substrato da enzima.
  40. 40. A fosfatase ácida é encontrada em muitos tecidos e células como próstata, medula óssea, hemácias e plaquetas. Para o bloqueio desta enzima (não afetada pelo levamizole) é essencial que o pH da solução do substrato apresente pH ≥ 8,0.</li></li></ul><li>BLOQUEIO DE ENZIMA ENDÓGENA BIOTINA<br /><ul><li>A biotina endógena é uma vitamina e coenzima presente em diversos tecidos, particularmente fígado, pulmão, baço, rins, tecido adiposo, glândula mamária e cérebro.
  41. 41. O bloqueio é realizado com:
  42. 42. Tampões alcalinos.
  43. 43. Leite desnatado.
  44. 44. Pré-incubação com avidina.</li></li></ul><li>SISTEMAS USUAIS<br />
  45. 45. <ul><li>Método direto.
  46. 46. Método indireto.
  47. 47. Método da Peroxidase-Antiperoxidase (PAP).
  48. 48. Método do Complexo Avidina-Biotina-Peroxidase (ABC).
  49. 49. Método da Estreptoavidina-Biotina-Peroxidase (ABP).
  50. 50. Método da Estreptoavidina-Fosfatase Alcalina (SAAP).</li></ul>SISTEMAS USUAIS DE IMUNOHISTOQUÍMICA<br />
  51. 51. MÉTODOS<br />
  52. 52. MÉTODO DIRETO<br />Substrato<br />Anticorpo + Enzima<br />Antígeno Tissular/Celular<br />
  53. 53. MÉTODO INDIRETO<br />Substrato<br />Anticorpo secundário (+ Enzima)<br />Anticorpo primário<br />Antígeno Tissular/Celular<br />
  54. 54. MÉTODO PAP (PEROXIDASE ANTI-PEROXIDASE)<br />Anticorpo anti-peroxidase<br />Anticorpo terciário conjugado<br />Anticorpo secundário<br />Anticorpo primário<br />Antígeno Tissular/Celular<br />
  55. 55. PASSO A PASSO<br />Secções Parafinizadas<br />Secções Congeladas<br />Fixação: ar<br />Fixação: acetona<br /><ul><li>Desparafinizar antes do uso.
  56. 56. Pode necessitar de recuperação antigênica.
  57. 57. Bloquear enzimas endógenas.</li></ul>Incubação Ac primário<br />Bloquear enzimas endógenas<br />Incubação Ac secundário<br />Incubação Ac terciário<br />
  58. 58. PROBLEMAS<br />
  59. 59. PROBLEMAS EM IMUNOHISTOQUÍMICA<br />Inativação inadequada de enzimas endógenas.<br />Difusão do Ag investigado do local de síntese para o tecido circundante.<br />Presença de Ag em altas concentrações no plasma perfundindo o tecido anteriormente à sua fixação.<br />Injúria física do tecido por dessecação ou fixação inadequada.<br />Autólise.<br />
  60. 60. PROBLEMAS EM IMUNOHISTOQUÍMICA<br />Pigmentos teciduais coloridos similares ao produto final da reação.<br />Reação cruzada inespecífica do Ac quando o epítopo do Ag a ser corado é partilhado com outras proteínas.<br />Ingestão do Ag por fagócitos, resultando em coloração não normalmente observada nessas células.<br />
  61. 61. APLICAÇÕES<br />
  62. 62. APLICAÇÕES<br /><ul><li>A imunohistoquímica pode ser utilizada:
  63. 63. Em neoplasias</li></ul>Diferenciar uma proliferação celular maligna e benigna.<br />Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente indiferenciadas.<br />Subtipagem de neoplasia para seleção terapêutica.<br />Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas (ex: hormônios).<br />
  64. 64. APLICAÇÕES<br /><ul><li>A imunohistoquímica pode ser utilizada:
  65. 65. Em neoplasias</li></ul>Caracterizar a origem de carcinomas.<br />Identificar micrometástases.<br />Avaliação prognóstica (ex: detecção de receptores hormonais em neoplasia mamária).<br />Orientação terapêutica.<br />
  66. 66. APLICAÇÕES<br /><ul><li>A imunohistoquímica pode ser utilizada:
  67. 67. Para detecção de antígenos:</li></ul>Virais: dengue, febre amarela, citomagalovírus, adenovírus, etc.<br />Bacterianos: micobactérias, leptospiras.<br />De Fungos: Paracoccidioides, Histoplasma, etc.<br />De Protozoários: Toxoplasma, Trypanosoma cruzi, Leishmania sp, Plamodium sp.<br />De Helmintos: Schistosoma.<br />
  68. 68. Imunohistoquímica para CD68 em região de infarto isquêmico em córtex cerebral: identificação de macrófagos no centro necrótico<br />Imunohistoquímica para GFAP em região de infarto isquêmico em córtex cerebral: ausência de astrócitos no centro necrótico e gliose na periferia<br />GAFP = Proteína glial ácida fibrilar<br />
  69. 69. Imunohistoquímica anti- ERB2<br />Imunohistoquímica anti-tirosina hidroxilase em estrutura axonal<br />
  70. 70. Imunohistoquímica: detecção de múltiplos antígenos<br />

×