Ap15 - Tipagem HLA

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Ap15 - Tipagem HLA

  1. 1. Tipagem HLA Aula 15 Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em outubro de 2003
  2. 2. Para aumentar ao máximo o tempo de sobrevida do enxerto, os receptores e os doadores potenciais devem ser histocompatíveis. A tipagem tecidual é feita com o auxílio de uma bateria de anticorpos monoclonais anti-HLA ou com o uso de seqüências de DNA específicas. Assim, é possível determinar as especificidades HLA expressas por cada indivíduo e o grau de compatibilidade entre o receptor e o potencial doador. O ideal é que o receptor não reconheça o tecido a ser enxertado como estranho, não desenvolvendo reação imunológica. Sendo as moléculas HLA os alvos principais da reação de rejeição, a compatibilidade HLA entre receptor e doador, diminui a chance de acontecer rejeição ao enxerto. O grau de compatibilidade mínima necessária entre receptor e doador depende do tipo de transplante.
  3. 3. A probabilidade de encontrar indivíduos HLA-compatíveis é muito maior entre membros de uma mesma família do que entre indivíduos não aparentados. Isto deve-se a uma característica importante do HLA, o polimorfismo. Contudo, ainda que a probabilidade de dois indivíduos não aparentados serem HLA-compatíveis seja muito pequena, ela existe. Assim, pacientes que precisam de um transplante de medula óssea e não encontra um Doador HLA-compatível na família podem encontrar um doador após a busca em um banco de doadores voluntários de medula óssea (quanto maior for este banco, maior será a chance de encontrar um doador). Nos slides a seguir, você será apresentado (ou relembrará) a alguns importantes conceitos e conhecimentos na área dos transplantes.
  4. 4. Transplante Clínico
  5. 5. Barreiras aos Transplantes <ul><li>Autotransplante </li></ul><ul><li>Isotransplantes </li></ul><ul><li> Tolerância </li></ul><ul><li>Alotransplantes </li></ul><ul><li>Xenotranplantes </li></ul><ul><li> Rejeição </li></ul>
  6. 6. 1944 - Medawar,P .: publicação dos resultados de experimentos realizados em animais:  “ A rejeição do enxerto é resultante de uma resposta imunológica, específica e com memória, ao tecido ou órgão transplantado”. Mecanismos de rejeição
  7. 7. Kuby, 2000 Mecanismos Imunológicos da reação de rejeição
  8. 8. Alvos da rejeição: antígenos de histocompatibilidade Antígenos de Histocompatibilidade no Homem <ul><li>HLA - Antígenos Leucocitários Humanos (Dausset e Payne,1960) </li></ul>
  9. 9. A Compatibilidade HLA <ul><li>Glicoproteínas HLA - presentes na membrana de todas as células nucleadas do organismo. </li></ul><ul><li>Pessoas compatíveis - possuem as mesmas moléculas HLA </li></ul>
  10. 10. Moléculas HLA <ul><li>Grupos de proteínas HLA importantes para os transplantes: </li></ul><ul><li>HLA-A / HLA-B / HLA-DR </li></ul><ul><li>Designação numérica. Ex: HLA-A2; HLA-B7; HLA-DR8 </li></ul>
  11. 11. Moléculas HLA <ul><li>Para cada tipo de molécula HLA há várias proteínas diferentes (polimorfismo) </li></ul><ul><li>Veja: </li></ul><ul><li>HLA-A : 124 </li></ul><ul><li>HLA-B: 258 </li></ul><ul><li>HLA-DR: 221 </li></ul>
  12. 12. HLA - Genética <ul><li>Os genes estão localizados no cromossomo N o 6. </li></ul><ul><li>Nós somos diplóides: </li></ul><ul><li> dois cromossomos 6; </li></ul><ul><li>dois conjuntos de genes do HLA </li></ul><ul><li>(dois haplótipos). </li></ul>
  13. 13. Herança do HLA <ul><li>O HLA é herdado em conjunto (haplótipo). </li></ul><ul><li>Um haplótipo do pai e um da mãe. </li></ul><ul><li>Existem portanto um total de 4 combinações diferentes dos haplótipos dos pais. </li></ul>
  14. 14. (0,25) HLA - Herança (0,25) (0,25) (0,25) uma das permutações possíveis
  15. 15. Herança do HLA - Probabilidade <ul><li>Chance que você tem de ter um irmão: </li></ul><ul><li>1. HLA-idêntico = 25% </li></ul><ul><li>2. HLA-distinto = 25% </li></ul><ul><li>3. HLA-haplo-idêntico = 50% </li></ul>
  16. 16. HLA e Rejeição de Enxerto <ul><li>Rejeição: </li></ul><ul><ul><li>Hiperaguda - dentro de 48 h após o enxerto </li></ul></ul><ul><ul><li>Aguda acelerada - até 7 dias após o enxerto </li></ul></ul><ul><ul><li>Aguda - após 7 dias </li></ul></ul><ul><ul><li>Crônica (Doença crônica do enxerto) - vários meses ou anos após o enxerto </li></ul></ul><ul><li>A Rejeição pode ser devida a: </li></ul><ul><ul><li>Pré-sensibilização do receptor a antígenos HLA do doador (transfusão de sangue, gravidez, transplante etc.) </li></ul></ul><ul><ul><li>Ativação primária da resposta imune anti-enxerto após o transplante. </li></ul></ul>
  17. 17. Prevenção da rejeição <ul><li>Provas Cruzadas ( Cross-Match ) </li></ul><ul><li> Previne, principalmente, a “Rejeição hiperaguda e a aguda acelerada”. </li></ul><ul><li>Tipagem tecidual ( Determinação dos antígenos HLA do doador e do receptor ) </li></ul><ul><ul><li> Permite selecionar os pares Receptor-Doador histocompatíveis. </li></ul></ul><ul><li>Imunossupressão inespecífica </li></ul><ul><ul><li> Pode controlar as reações de rejeição. </li></ul></ul><ul><li>Imunossupressão específica </li></ul><ul><ul><li> Reduz as respostas anti-enxerto sem aumentar a susceptibilidade às infecções. </li></ul></ul>
  18. 18. Provas Cruzadas ( Crossmatch ) <ul><li>Indica se o receptor tem anticorpos pré-formados contra o potencial doador. </li></ul><ul><li>Mistura-se uma pequena quantidade de soro do receptor com linfócitos do provável doador e adiciona-se uma fonte de proteínas do sistema complemento. </li></ul><ul><li>Se o paciente tiver anticorpos contra o HLA do doador, a membrana das células do doador será lesada pelo complemento e este crossmatch é chamado de positivo. </li></ul><ul><li>Um crossmatch positivo representa uma forte contra-indicação ao transplante, pois significa que o receptor poderá ter uma forte rejeição ao enxerto (rejeição hiperaguda) </li></ul>
  19. 19. Testes de Histocompatibilidade no Transplante de Órgãos - Provas Cruzadas <ul><li>Soro do receptor </li></ul><ul><li>+ Linf. totais (T+B) do doador </li></ul><ul><li>+ Complemento </li></ul><ul><li>+Corante vital </li></ul><ul><li>+Formol </li></ul>Prova Cruzada (Cross-Match) clássica Teste de Microlinfocitotoxicidade (Terasaki e McClelland)
  20. 20. <ul><li>As células do possível doador são incubadas com o soro do paciente (receptor): </li></ul><ul><ul><li>As células usadas são, normalmente, linfócitos T ou B, obtidos a partir de sangue periférico (doador vivo) ou linfonodos (doador cadáver). </li></ul></ul><ul><ul><li>As células são purificadas por gradiente de densidade e aderência à lã de nylon ou com o uso de esferas magnetizadas contendo anticorpos anti-T ou anti-B. </li></ul></ul>
  21. 21. linfócito teste anti-HLA-A3 Veja a reação de microlinfocitotoxicidade: HLA-A3 linfócito teste HLA-A3 anti-HLA-B5 Complemento (Ativação) Complemento (Não ativação) Corante vital (penetra na célula lesada) Corante não pene- tra na célula intacta Linfócito com membrana lesada Linfócito intacto
  22. 22. Veja o resultado ao microscópio de contraste de fase: a: Linfócitos não lisados (reação de citotoxicidade negativa) b: Linfócitos lisados (reação de citotoxicidade positiva) Kuby, 2000
  23. 23. A reação de microlinfocitotoxicidade é realizada em placas de Terasaki, apresentada a seguir:
  24. 24. <ul><li>Provas mais sensíveis e específicas: </li></ul><ul><ul><li>CM-T (HLA Classe I) </li></ul></ul><ul><ul><li>CM-B (HLA Classe II) </li></ul></ul><ul><ul><li>Tratamento do soro com agente redutor de IgM </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>( Ditiotreitol [DTT] ) </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Adição de Anti-Gamaglobulina ( AGH ) </li></ul></ul><ul><ul><li>Citometria de fluxo... </li></ul></ul><ul><li>Análise da Reatividade contra Painel de Linfócitos ( PRA ) </li></ul>Testes de Histocompatibilidade no Transplante de Órgãos - Provas Cruzadas
  25. 25. Tipagem Molecular Sonda seqüência-específica (PCR-SSO) Envolve a amplificação a amplificação pela “Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)” de um éxon do gene do HLA, utilizando “ primers” de oligonucleotídios que hibridizam com regiões do locus HLA que são conservadas entre diferentes alelos. A seqüência amplificada é então hibridizada com diferentes sondas de oligonucleotídios, cada uma com seqüências específicas de um alelo ou grupo de alelos HLA. <ul><li>Esses ensaios visam a definição das especificidades (baixa resolução) ou dos alelos (alta resolução) HLA de um indivíduo, a partir de amostra de DNA e com o uso de “primers” e sondas específicas. </li></ul><ul><li>Dois desses métodos cada vez mais utilizados: </li></ul>
  26. 26. Amplificação seqüência-específica (PCR-SSP) Esse método consiste em colocar o DNA de uma amostra em diferentes tubos com dois primers PCR. Um dos primers hibridiza uma região conservada do locus HLA que está sendo tipado, sendo adicionado a todos os tubos (ex. HLA-DRB1). O segundo primer PCR hibridiza com uma região polimórfica do locus HLA – cada tubo contém um primer de especificidade diferente. A amplificação do DNA só será observada no tubo contendo um segundo primer específico que corresponde ao alelo (alta resolução) ou grupo de alelos (baixa resolução) do HLA na amostra de DNA O produto gênico amplificado poderá ser detectado em gel de agarose corado com Brometo de Etídio. FIM

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