cinétique enzymatique
-modèle de base de la cinétique enzymatique Michaelis –Menten
-détermination des constantes cinétiques
-Représentation hyperbolique (Michaelis-Menten )
-Représentation de Lineweaver-Burk
-Inhibitions des réactions enzymatiques
-Inhibition compétitive
-IC50 pour inhibition compétitive
-inhibition non compétitive
-IC50 pour inhibition non compétitive
-inhibition in compétitive
-IC50 pour inhibition in compétitive
- Graphiques de Dixon
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Pr M.SLIMANI

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Pr M.SLIMANI

à t=0, la concentration en substrat est désignée
[S]0
à t=0, la concentration en produit est égale à 0
la concentration en enzyme est désignée [E]T et reste
constante tout au long de la mesure
à t=0, la concentration du complexe enzyme-substrat,
[ES], est égale à 0
E + S E + P
ES
Complexe enzyme-substrat
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état stationnaire
état post-stationnaire
3 états lors de la cinétique
état pré-
stationnaire
Phases de la réaction
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Temps
Concentrations
[S]
[P]
[E]libre
[ES]
état pré-
stationnaire
état
stationnaire
état post-
stationnaire
E +
S
E + P
ES
[S]
[P]
[E]libre
[ES]
d[ES]
dt
=0
Vi
Équation de Michaelis-Menten
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Pr M.SLIMANI

E + S E + P
ES
k1
k-1
k2
vi = k2 [ES]
La vitesse d’apparition du produit P (vitesse de la
réaction catalysée par l’enzyme) dépend de k2 et de
la concentration en ES.
La [ES] dépend de sa vitesse de formation et de sa
vitesse de disparition.
vformation ES = k1 [E] [S]
vdisparition ES = k-1 [ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]
Équation de Michaelis-Menten
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Pr M.SLIMANI
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ES se forme à partir de E + S et se décompose soit en E + S , soit en E +
P
Vitesse de formation de ES: vf = k1·[ E ]·[ S ]
Vitesse de dégradation de ES: vd = (k-1+ k2)·[ ES ]
[ ES ] atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"),
donc vd = vf
(k-1+ k2)·[ ES ] = k1·[ E ]·[ S ]
[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM
KM = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis (-Menten)
Il faut maintenant connaitre la concentration de l'enzyme libre [ E ].
[ E ] = [ E ]T - [ ES ]
où [ E ]T est la concentration totale d'enzyme, libre ou lié. On a donc:

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[ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM - [ ES ]·[ S ] / KM
[ ES ] + [ ES ]·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·( 1 + [ S ] / KM ) = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·(KM + [ S ]) / KM = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·(KM + [ S ]) = [ E ]T·[ S ]
[ ES ] = [ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ])
On peut enfin introduire ce terme dans l'équation pour la vitesse initiale:
vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])
[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM

L’équation de Michaelis-Menten
vi = Vmax
[S]
[S]
KM +
Vitesse
initiale
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Pr M.SLIMANI
vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])

vi = Vmax
[S]
[S]
KM +
Si vi = ½ Vmax
½ Vmax = Vmax
[S]
[S]
KM +
½ (KM + [S]) = [S]
½ KM = [S] - ½ [S]
½ KM = ½ [S]
KM = [S]
KM est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme. Plus
l’affinité est élevée, et moins il faudra de substrat pour que
l’enzyme fonctionne.
Constante de Michaelis-Menten
KM est la concentration en substrat
pour laquelle l’enzyme fonctionne
à la moitié de sa vitesse maximale
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k2 = kcat
kcat
KM
[E]T [S]
vi =
devient
Dans ces conditions [E]T  [E]libre
kcat
KM
[E] [S]
vi =
kcat
KM
est une constante de vitesse apparente d’ordre 2
vi = Vmax
[S]
[S]
KM +
In vivo, la [S] est rarement saturante. Le rapport [S]/KM est
compris entre 0,01 et 1 de sorte qu’au maximum la moitié des
sites actifs est occupée par le substrat.
Prenons une condition où KM >> [S]
:
vi = Vmax
[S]
[S]
KM +
Vmax = k2 [E]T
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Vmax
[S]
[S]
KM+
1 1
vi
=
Si on écrit l’équation en double inverse :
1
Vmax [S]
[S]
KM +
vi
=
Représentations linéaires
Lineweaver - Burk
vi = Vmax
[S]
[S]
KM +
ou
1
Vmax [S]
1
KM
x
vi
=
1
+
Vmax
1
kcat [E]T [S]
1
KM
x
vi
=
1
+
kcat [E]T
En réarrangeant on obtient :
Or Vmax = k2 [E]T = kcat [E]T
[E]T
kA [S]
1
1
x
vi
=
1
+
kcat
ou
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kcat/KM est l’efficacité catalytique de l’enzyme. On l'appelle également
kA.
Lorsqu’un enzyme peut utiliser plusieurs substrats, kcat/KM permet
d’estimer quel sera le substrat le plus utilisé par la protéine.
k2 est appelée constante catalytique ou kcat . Elle est
proportionnelle au nombre de réactions que peut effectuer une
molécule d’enzyme par unité de temps ( le «turn-over number»).
Vmax = kcat [E]T
µmole de P. mL-1.sec-1
sec-1
µmole de E . mL-1
1/Kcat : est la durée , en s de l’acte catalytique
Kcat : donne la mesure de l’efficacité de l’acte catalytique
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Exemple :
On calcule la quantité de produit apparue dans le tube chaque minute :
2 mL x 30 µmoles/mL/min = 60 µmoles/min
Dans le tube il y a une concentration saturante en substrat donc
l’enzyme fonctionne en Vmax.
Il y a donc 60 µmoles de produit fabriquées par min par les 10 nmoles
d’enzyme présentes dans le tube.
Le turn-over number est donc de 6000 réactions/min ou 100 réactions/sec.
Chaque molécule d’enzyme catalyse 100 réactions chaque seconde.
k2 ou kcat est égale à 100 sec-1.
60 µmoles/min / 10 nmoles d’enzyme = 6000 réactions/min
ou 100 réactions/sec
Constante catalytique
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Unités de vitesse : système international
Exemple:
vi = 600 µmoles de P / L / min vi = 600 U / L = 600 UIE / L
correspond à
dans le système international (S.I.), l'unité officielle est le katal (kat) :
quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat
par seconde. Les biochimistes préfèrent utiliser les unités
internationales (U.I. ou U.E.)
1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 μkat = 16,6 nkat
1 U.I = 1 µmol.min-1 ( signifie à ) 16.67 nmol.s-1 =16.67 nkat
vi = 10 µmoles de P / L / sec vi = 10 µkat / L
donc à
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Certains inhibiteurs s'associent de manière réversible à l'enzyme en
interagissant de manière non covalente. D'autres se fixent de manière
Irréversible et sont souvent utilisés pour déterminer les groupes actifs du site
catalytique. Enfin, selon le type d'inhibiteur, l'enzyme peut fixer :
-le substrat ou l'inhibiteur : c'est la fixation exclusive avec formation de
complexes binaires ES ou EI : Inhibiteurs compétitifs: fixation à la
place du substrat
-le substrat et l'inhibiteur : c'est la fixation non-exclusive avec formation de
complexes ternaires (ESI). Si ce complexe ternaire reste encore actif (moins
que le complexe ES), l'inhibition est dite partielle et s'il est totalement inactif,
l'inhibition est dite totale.
Inhibiteurs non-compétitifs: fixation ailleurs qu’au site substrat
empêchant la catalyse d’avoir lieu
Mode d’action des inhibiteurs
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Inhibiteur compétitif : (fixation exclusive)
C'est un mécanisme où la fixation de l'inhibiteur empêche celle du substrat
(et réciproquement) : la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont
donc mutuellement exclusives. En effet, puisque la fixation du substrat et
celle de l'inhibiteur sont mutuellement exclusives, l'addition d'une très forte
concentration de substrat déplace l'équilibre E + S <==> ES en faveur de
ES et donc déplace l'équilibre EI <==> E + I en faveur de E.
Un inhibiteur compétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme libre sa fixation
et celle du substrat étant exclusives l'une de l'autre.
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1/KM
d’où [ ES ] =
k-1 + k2
k1 [E] [S]
=
KM
[E] [S]
On admet que la [ EI ] est rapidement atteinte et que [ EI ]f = [ EI ]d
k3 [E] [I] = k-3 [ EI ]
Vi = k2 [ ES ]
La vitesse d’apparition du produit s’exprime :
En vitesse initiale, les vitesses de formation et de disparition de ES
sont égales :
k1 [E] [S] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ]
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On sait que : [E]T = [E] + [ EI ] + [ ES ]
On peut donc écrire :
[E]T = [E] + +
[E] [I] [E] [S]
Ki KM
[ EI ] =
Ki
[E] [ I ]
On a vu que :
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On définit Ki :comme la constante de dissociation du complexe EI :
[ EI ] =
Ki
[E] [ I ]
[E]T = [E] + +
[E] [I] [E] [S]
Ki KM
[E]T = [E] ( 1 + + )
[I] [S]
Ki KM
[E]T = [E] ( )
KM [I] Ki [S]
Ki x KM
KiKM + +
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On peut également l’écrire :
[E] =
Ki x KM + KM[I] + Ki [S]
x [E]T
Ki x KM
La vitesse de la réaction est donnée par :
Vi = k2 [ES]
[E]T = [E] ( )
KM [I] Ki [S]
Ki x KM
KiKM + +
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Vi = k2
[E] [S]
KM
Si on remplace [E] par sa valeur :
[E] =
Ki x KM + KM [I] + Ki [S]
x [E]T
Ki x KM
On obtient donc :
vi =
x [E]T [S]
k2
x Ki
(Ki x KM + KM [I] + Ki [S])
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x
KM
KM

Comme Vmax = k2 [E]T
vi = Vmax
[S]
KM (1 + ) + [S]
Ki
[I]
Sans inhibiteur :
vi =
x [E]T [S]
k2 x Ki
Ki x KM + KM [I] + Ki [S]
Ki
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Avec inhibiteur :
vi = Vmax
[S]
[S]
KM +

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Inhibition compétitive









I
K
I
Km
]
[
1
.

'
Km
--1/Km -1/K’m

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Inhibiteur non compétitif : (fixation non exclusive)
Un inhibiteur non compétitif classique n'a aucune influence sur la fixation
du substrat (et réciproquement) : les sites de fixation du substrat et de
l'inhibiteur sont distincts.
En conséquence, l'inhibiteur se fixe à l'enzyme libre E et au complexe ES ;
de même, le substrat se fixe à l'enzyme libre E et au complexe EI. Les
inhibiteurs non compétitifs n'ont pas d'homologie structurale avec le
substrat. Un inhibiteur non compétitif au sens large peut se fixer à la fois
sur l'enzyme libre et sur le complexe E-S, avec des constantes d'équilibre
différentes
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Inhibition non compétitive :
1/Vmax

max'
V
I
K
I
V
]
[
1
max

1/V’max

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Inhibiteur incompétitif : (fixation non exclusive) du terme anglo - saxon :
"uncompetitive".
Ce type d'inhibition est aussi appelé inhibition par blocage du complexe
intermédiaire. Cette appellation décrit mieux le mécanisme : l'enzyme et le
substrat forment d'abord le complexe enzyme substrat (le complexe
intermédiaire), puis l'inhibiteur se fixe à ce complexe
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Inhibition incompétitive

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