Parte 14

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Parte 14

  1. 1. ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS 1. INTRODUÇÃO DEFINIÇÃO DE TRANSGÊNICOS: Os Transgênicos (ou organismos geneticamente modificados) são organismos que adquiriram, pelo uso de técnicas modernas de Engenharia Genética, características de outro organismo. O termo geneticamente modificado tem sido utilizado para descrever a aplicação da tecnologia do DNA recombinante para a alteração genética de animais, plantas e microorganismos. HISTÓRICO: O termo Biotecnologia foi utilizado pela primeira vez em 1919 por um engenheiro agrícola da Hungria, porém as primeiras aplicações biotecnológicas datam de meados de 1800 AC, com o uso de leveduras para fermentar vinhos e pães. A Genética é uma ciência do século XX, pois, em 1900 as Leis de Mendel foram redescobertas e começaram a ser aplicadas. Nos primeiros ¾ deste século, a genética mendeliana contribuiu significativamente para a sustentação do crescimento populacional de nosso planeta, produzindo maiores safras de alimentos de origem vegetal, aumentando a produtividade de animais e contribuindo para uma maior longevidade humana. O crescimento acelerado do campo da biotecnologia, entretanto, ocorreu a partir da década de 70 com o desenvolvimento da Engenharia Genética (ou Tecnologia do DNA Recombinante). Com a decifração do código genético e a manipulação do DNA neste último quarto de século, aceleram-se as descobertas científicas e suas aplicações biotecnológicas. Com isso, abriram-se novas perspectivas econômicas nos campos da saúde humana, sanidade animal e produção de alimentos. Surgiram técnicas biotecnológicas como a produção e pesquisa de plantas e animais transgênicos, 59
  2. 2. clonagem de mamíferos, produção de proteínas humanas em microorganismos, plantas e animais, mapeamento do genoma humano, técnicas de detecções e diagnósticos por PCR e Terapia Gênica. Os primeiros experimentos com plantas transgênicas foram conduzidos em 1986, nos E.U.A e na França. Entre 1986 e 1995, 56 culturas foram testadas em mais de 3.5 mil experimentos realizados em mais de 15 mil locais (34 países). Em 1996 e 1997, o número de países que testaram plantas transgênicas aumentou para 45, tendo sido conduzidos somente nestes dois anos mais de 10 mil experimentos. Neste período, as culturas mais testadas foram a do milho, soja, tomate, canola, batata e algodão. Na maioria dos casos as características genéticas introduzidas foram tolerância a herbicidas, resistência a insetos, qualidade do produto e resistência a vírus. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE: O isolamento dos genes de interesse é conduzido por meio de técnicas de clonagem molecular que consiste em induzir um organismo e amplificar a seqüência de DNA de interesse, em sistemas que permitem uma fácil purificação e recuperação do referido fragmento de DNA. Para isso, são utilizados vetores de clonagem (plasmídeos ou vírus) nos quais a seqüência de DNA de interesse é inserida , utilizando a enzima DNA ligase. Quando necessário, o fragmento de DNA de interesse pode ser liberado do vetor por meio de enzimas de restrição. Uma vez isolado o gene de interesse, estes fragmentos de DNA (genes) são incorporados (por meio das técnicas de Engenharia Genética) no Genoma do organismo alvo, resultando em um organismo geneticamente modificado (OGM), cuja característica adquirida passa a ser hereditária. A tecnologia do DNA Recombinante foi desenvolvida em 1973 e permite a transferência do material genético de um organismo para o outro de forma efetiva e eficiente. Ao invés de promover o cruzamento entre organismos relacionados para obter uma característica desejada, cientistas podem identificar e inserir, no 60
  3. 3. genoma de um determinado organismo, um único gene responsável pela característica em particular. O gene inserido artificial ou intencionalmente no genoma de um organismo é denominado transgene. Desta forma, tem-se alteração precisa e previsível. Antes do desenvolvimento da tecnologia do DNA Recombinante, a técnica utilizada era a do Melhoramento Clássico, na qual a transferência de genes se dava por meio de cruzamentos (reprodução sexuada), misturando todo o conjunto de genes dos dois organismos em combinações aleatórias. A técnica exigia uma enorme demanda de tempo e não era precisa. PAPEL DOS TRANSGÊNICOS NA ECONOMIA MUNDIAL: Neste século, é esperado um rápido desenvolvimento na biotecnologia, especificamente, animal e vegetal. O século passado teve um grande desenvolvimento na biotecnologia microbiana, que se iniciou com a Patente concedida a Weizman com o desenvolvimento da fermentação acetona-butanol. A produção direta de trigo rico em lisina é uma das pesquisas em desenvolvimento e deverá resultar em um produto mais economicamente viável que o enriquecimento do trigo com a lisina obtida de microorganismos. Também o leite deverá ser uma fonte mais rica de proteínas humanas que os microorganismos e as vacinas obtidas de plantas seriam bem mais viáveis e baratas que as atuais. A modificação genética de microorganismos continua sendo uma importante complementação para as modificações genéticas de plantas e animais, especialmente para a produção de metabólitos secundários, biofertilizantes e biopesticidas, bioprocessamento, biorremediação e tratamento de águas. De acordo com uma pesquisa sobre a expectativa de comercialização de produtos obtidos de organismos geneticamente modificados nos E.U.A, a agricultura tem um grande potencial de crescimento e uma forte posição nas vendas em volume. 61
  4. 4. Tabela 1: Comercialização de produtos biotecnológicos nos E.U.A (milhões de dólares) Setor Econômico 1996 2001 Perspectiva 2006 Taxa de Crescimento Anual Terapêuticos 7555 13935 25545 13 Diagnósticos 1760 2705 4050 9 Agricultura 285 740 1740 20 Especialidades 275 690 1600 19 Diagnósticos Não- Médicos 225 330 465 8 Total 10100 18400 33400 12 Fonte: Genetic Engeneering News. December,1995, p.6. Já existem sementes manipuladas sendo cultivadas no mundo em uma área de 30 milhões de hectares e seu mercado deverá movimentar cerca de US$ 3 bilhões. No Brasil, muitos alimentos transgênicos importados já são comercializados e o país planeja importar 3 milhões de toneladas de milho da Argentina e E.U.A, onde as lavouras transgênicas são liberadas oficialmente. Na década de 90, os E.U.A aprovaram dezenas de produtos geneticamente modificados e outra grande quantidade apareceu no mercado europeu e o ritmo atual de liberação de Organismos Geneticamente Modificados indica que na primeira década deste século já teremos uma centena de produtos geneticamente modificados nas prateleiras dos supermercados, podendo-se chegar na casa dos milhares em algumas décadas. II. VEGETAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS: A China foi o primeiro país a comercializar plantas transgênicas no início da década de 90, com a introdução do fumo resistente a vírus, seguido pelo tomate resistente a vírus. Em 1994, a Calgene obteve a primeira aprovação nos EUA para 62
  5. 5. comercializar o tomate transgênico “Flavr-Savr”, que apresentava amadurecimento retardado. A área global de culturas transgênicas cresceu de 1.7 para 27.8 milhões de hectares, em 1998 e as duas principais culturas transgênicas cultivadas em oito países foram soja e milho. A maioria dos produtos já liberados para a comercialização contêm transgenes que codificam características que visam minimizar estresses ambientais, incluindo tolerância a herbicidas, resistência a insetos e vírus. No entanto, as características que visam aumentar a qualidade nutricional dos alimentos vêm se tornando progressivamente mais importantes e deverão prevalecer nas próximas gerações de produtos transgênicos. É essencial melhorar a produção e a distribuição de gêneros alimentícios para livrar da fome uma população mundial crescente, enquanto reduzimos os impactos ambientais. Para isso, é necessário utilizar de forma adequada e responsável as novas tecnologias e descobertas científicas. Alimentos produzidos através de tecnologias de modificação genética podem ser mais nutritivos, estáveis quando armazenados e, em princípio, podem promover saúde trazendo benefícios para consumidores, seja em nações industrializadas ou em desenvolvimento. Esforços em conjunto, organizados, devem ser feitos para investigar os efeitos potenciais no meio ambiente (positivos ou negativos) dos vegetais transgênicos em suas aplicações específicas. Esses esforços devem ser avaliados tomando-se como referência os efeitos de tecnologias convencionais da agricultura, que estejam atualmente em uso. 63
  6. 6. BENEFÍCIOS PROMOVIDOS PELOS TRANSGÊNICOS NA AGRICULTURA: A tecnologia dos transgênicos tem sido utilizada para produzir uma variedade de plantas para alimentação, principalmente com características preferidas pelo mercado, algumas tendo se tornado sucessos comerciais. Os desenvolvimentos resultantes em variedades comercialmente produzidas em países como EUA e Canadá têm se centralizado no aumento de vida em prateleiras de frutas e vegetais, dando resistência contra pragas de insetos ou viroses, e produzindo tolerância a determinados herbicidas. Enquanto essas características têm trazido benefícios aos agricultores, os consumidores dificilmente notaram qualquer benefício além de, em casos limitados, um decréscimo no preço devido a custos reduzidos e aumento da facilidade de produção (University of Illinois,1999; Falck-Zepeda et al 1999). Temos a seguir, alguns exemplos que mostram o uso da tecnologia da modificação genética de vegetais aplicada a alguns problemas específicos da agricultura, indicando o potencial para obter benefícios:  Resistência a pragas: Temos como exemplo a papaia que é resistente ao vírus Ringspot e que tem sido comercializada e plantada no Hawai desde 1996 (Gonsalves, 1998). Este exemplo prova a eficiência do uso de modificação genética em vegetais visando obter maior resistência a uma praga específica. Outro benefício paralelo está no fato de que, ao se criar maior resistência a pragas, diminui ou se elimina a necessidade do uso de pesticidas. Temos como exemplo as plantações transgênicas resistentes aos insetos do Bacillus thurringiensis , que permitiu uma redução significativa no uso de inseticidas. Porém, alguns pontos devem ser considerados, como o fato de que as populações de pragas ou organismos causadores de doenças podem vir a se adaptar à planta transgênica, como acontece com o uso de inseticidas. Outro ponto a ser levantado é a diferença no biótipo de pragas no mundo, que faz com que plantações resistentes desenvolvidas para serem utilizadas na América do Norte, 64
  7. 7. possam ser resistentes a pragas que não preocupam nos países africanos, por exemplo. Há necessidade, portanto, de maior pesquisa com plantas transgênicas, que tenham se mostrado resistente a pragas regionais, para verificar sua sustentabilidade em face ao aumento de pressões diante de pragas ainda mais virulentas.  Colheitas mais abundantes: Como exemplo temos as pesquisas que envolvem a produção de alimentos de alto-rendimento. O maior exemplo é o trigo semi-anão que possui genes insensíveis à giberelina. A introdução desses genes faz com que se obtenha uma planta mais baixa, mais forte e que aumenta o rendimento da safra diretamente, uma vez que se reduz o alongamento das células na parte vegetativa, de forma que a planta desenvolva mais sua parte reprodutiva (comestível). Estes genes (NORIN 10) agem da mesma forma quando utilizados para transformar outras espécies de plantas importantes como alimento.  Tolerância a pressões bióticas e abióticas: O desenvolvimento de plantações que tenham uma resistência inata ao stress biótico ou abiótico ajudaria a estabilizar a produção anual. Como exemplo, temos o vírus Mottle Amarelo do arroz (RYMV), que devasta os arrozais africanos. Após o fracasso dos métodos convencionais de cruzamentos entre o arroz selvagem e cultivado, os pesquisadores utilizaram uma técnica de imunização genética, através da criação de plantas de arroz transgênico resistentes ao RYMV. Como exemplo de combate ao stress abiótico temos a produção de ácido cítrico nas raízes e a melhor tolerância ao alumínio em solos ácidos (de La Fuente et al 1997).  Uso de terras marginalizadas: Solos com elevados índices de salinidade e alcalinidade podem ser utilizados caso se consiga obter um transgênico que tenha por característica ser resistente nessas condições. Como exemplo, temos um gene de tolerância em manguezais (Avicennia marina) que foi clonado e transferido para outras plantas e através dele pôde-se observar que as plantas transgênicas mostraram-se mais tolerantes a altas concentrações de sal. 65
  8. 8.  Benefícios nutricionais: Temos o exemplo da introdução de genes de para obter maior produção de beta caroteno, precursor da vitamina A, extremamente necessária e cuja deficiência nos animais causa cegueira. A semente deste transgênico apresenta cor mais amarelada (Ye et al,2000). Também já se desenvolveu o arroz transgênico com elevados níveis de ferro, de forma a combater a anemia. Este arroz foi produzido usando-se genes envolvidos na produção de proteínas capazes de ligar o ferro e de uma enzima que facilita a disponibilidade de ferro na dieta humana (Goto et al, 1999). As plantas transgênicas contêm entre 2 e 4 vezes mais ferro do que normalmente encontrado no arroz convencional.  Vacinas e produtos farmacêuticos derivados de plantas transgênicas: Mesmo já estando disponíveis nos países em desenvolvimento, as vacinas apresentam um custo elevado para produzir e utilizar. Diante disso, muitas vezes as vacinas acabam não chegando até as pessoas que realmente necessitam dessa imunização. Para eliminar este problema, os pesquisadores estão estudando o uso de plantas transgênicas na produção de vacinas e fármacos. Como exemplo, temos as vacinas contra as doenças infecciosas do aparelho gastro-intestinal, que são produzidas em plantas como batatas e bananas (Mason H.S. Amtzen C.J. 1995). Outro exemplo interessante está no anticorpo recentemente identificado em sementes de arroz e trigo, que reconhece células cancerosas do pulmão, mama e cólon e que poderá ser muito importante no diagnóstico ou terapia contra o câncer (Stoger et al 2000). O desenvolvimento de plantas transgênicas, para produzir agentes terapêuticos, tem enorme potencial para auxiliar na solução de problemas com a saúde nos países em desenvolvimento. 66
  9. 9. EXEMPLOS PRÁTICOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS:  Mostarda com alto teor de beta-caroteno: O instituto de pesquisa indiano TEI anunciou recentemente um projeto de desenvolvimento da chamada mostarda dourada, cujo óleo tem alto teor beta-caroteno, precursor da vitamina A, que ajuda a combater diversas doenças, como a cegueira noturna, a xeroftalmia (ressecamento da córnea), diarréias e sarampo. A pesquisa é conjunta com a Universidade de Michigan e a Monsanto. A deficiência em vitamina A atinge cerca de 250 milhões de pessoas no mundo.  Tomates resistentes ao excesso de sal: Segundo a revista “Nature Biotechnology”, graças à injeção de um único gene capaz de absorver um excedente de sal em plantações de tomate, cientistas conseguiram fazer crescer e desenvolver em água contendo forte teor de sódio, tomates perfeitamente comestíveis. O gene introduzido atua sobre uma proteína como um filtro capaz de captar e isolar o sódio excedente. PROCEDIMENTOS PARA A OBTENÇÃO DE VEGETAIS TRANSGÊNICOS: Para obter plantas transgênica são necessários: - um gene de interesse; - uma técnica para transformar células vegetais através da introdução do gene de interesse. - uma técnica para gerar uma planta inteira a partir de uma só célula transformada. Após esta última etapa, teremos uma planta transgênica, porque ela contém, além dos genes naturais, um gene adicional proveniente de outro organismo, que pode ser uma planta, uma bactéria ou até um animal. 67
  10. 10. GENES DE INTERESSE: O genoma de uma bactéria contém em média 5000 genes, o de plantas, entre 40000 e 60000, enquanto o genoma humano consiste de aproximadamente 30.000 genes. Os genes são segmentos de um mesmo tipo de molécula: o ácido desoxirribonucléico (DNA) e é esta característica que permite que genes de um organismo sejam potencialmente funcionais em outro. Uma das possibilidades para isolamento de um gene é a construção de uma “biblioteca genômica” e, para isso, o DNA do organismo contendo o gene de interesse é extraído. Em seguida o DNA é cortado em fragmentos menores utilizando as enzimas de restrição. Estes fragmentos são, então, ligados a outros fragmentos de DNA, mas que podem se replicar em bactérias, onde este material é inserido e replicado por várias vezes. Depois, seleciona-se a colônia de bactérias que contém o fragmento de DNA correspondente ao gene de interesse. Diversos genes de interesse agronômico já foram isolados, entre eles temos: - Gene que codifica uma proteína capaz de modificar herbicidas, inativando-os. Os herbicidas são muito usados no controle de ervas daninhas, entretanto, algumas culturas não sobrevivem à aplicação deste produto. Deste modo, culturas contendo este gene poderiam tornar-se resistentes ao herbicida, facilitando assim o controle das ervas. - Gene que codifica uma proteína de alto valor nutricional, presente na castanha-do-pará. Este gene poderia ser usado para aumentar o valor nutricional de culturas importantes como feijão e soja. - Genes bacterianos que codificam proteínas com propriedades tóxicas para insetos. Os insetos que se alimentassem de plantas expressando este gene morreriam ou se desenvolveriam com menor eficiência, levando ao seu controle na cultura. 68
  11. 11. TRANSFERÊNCIA DOS GENES DE INTERESSE: A transferência dos genes se dá diretamente na célula vegetal, sendo o processo mais utilizado (especialmente para o caso de monocotiledôneas), ou através de agrobactérias. A transferência é alcançada por um dos métodos seguintes: A-) Eletroporação de protoplastos e células vegetais: Protoplastos são células vegetais, desprovidas de parede celular. Para a transformação, são incubados em soluções que contêm os genes a serem transferidos e, em seguida, um choque elétrico de alta voltagem é aplicado por curtíssimo tempo. O choque causa uma alteração da membrana celular, o que permite a penetração e eventual integração dos genes no genoma. B-) Biobalística: Técnica introduzida no início da década de oitenta. Baseia-se na utilização de microprojéteis de ouro ou tungstênio cobertos com os genes de interesse. Os microprojéteis são acelerados com pólvora ou gás em direção aos alvos que, neste caso, são os tecidos vegetais. Os genes entram nas células junto com o projétil de maneira não-letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA é dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular, ocorrendo o processo de integração do gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado. A velocidade alcançada pelos microprojéteis atinge cerca de 1500 Km/h. Uma das vantagens do sistema é que este permite a introdução e expressão gênica em qualquer tipo de célula. Assim, foi permitida a transformação in situ de células diferenciadas sem necessidade de regeneração. Outra importante vantagem está na possibilidade de obtenção de plantas transgênicas através da transformação de células-mãe do meristema apical. A técnica de biobalística 69
  12. 12. mostrou-se bastante eficiente, pois as micropartículas conseguem atingir as três camadas do meristema apical. REGENERAÇÃO DAS PLANTAS A PARTIR DAS CÉLULAS TRANSFORMADAS: Uma vez inserido o gene na célula vegetal, por um dos métodos mencionados acima, esta célula ou grupos delas são estimuladas a gerar uma planta transformada. A transformação de uma célula vegetal é um tipo de manipulação genética que atende ao mesmo princípio da transformação de microrganismos, estabelecido pela primeira vez em 1973, quando Stanley e Cohen, em São Francisco, introduziram o gene proveniente de uma rã em uma bactéria. No entanto, há diferenças conceituais entre a situação com microrganismos e com plantas: nos primeiros, os objetivos finais são mudanças operadas no nível celular, enquanto que em eucariotos superiores, como plantas e animais, as mudanças obtidas no nível celular não são significativas, a não ser que possam ser transferidas para todas as células do organismo. Ou seja, o domínio das técnicas de regeneração de plantas inteiras a partir de uma única célula é condição sine qua non na biotecnologia aplicada para a agricultura. E como cada espécie de planta tem diferentes exigências hormonais, nutricionais e ambientais para a regeneração, esta etapa ainda representa o maior gargalo na criação de plantas transgênicas, embora esta técnica já esteja estabelecida para inúmeras plantas de interesse econômico. III. ANIMAIS TRANSGÊNICOS A manipulação transgênica em animais é uma das questões mais controversas dentro da comunidade científica. A tecnologia pode ser usada para criar animais de fazenda mais produtivos, transformá-lo em “fábrica de remédios” ou desenvolver modelos animais em laboratório para estudo de doenças humanas. 70
  13. 13. Em resumo, um transgene é um fragmento de DNA, em geral a seqüência completa de um gene, artificialmente introduzido no genoma de outro organismo. Para obter um organismo transgênico, primeiro o gene de interesse é identificado e isolado (clonagem gênica). Depois, é preciso montar o transgene, porque nem todo gene é expresso (levando a célula a produzir proteína) em todos os tecidos. Só os glóbulos vermelhos do sangue, por exemplo, expressam a hemoglobina, proteína que transporta o oxigênio aos tecidos. Além disso, a expressão dos genes em cada célula varia de acordo com seu estado funcional. Montagem de um transgene (desenvolvimento de camundongos transgênicos) A expressão gênica depende de uma intrincada rede de controle baseada, entre outras coisas, no reconhecimento de seqüências de DNA denominadas “promotores”. A presença de certo promotor junto ao gene dirige sua expressão para determinado tipo de célula. Como os promotores não codificam proteínas, são alvos preferenciais para manipulação. É possível usar enzimas de restrição para cortar o DNA em locais específicos e também, “emendar” fragmentos de DNA com outras enzimas. Isso levou à idéia de ligar um promotor de função bem conhecida a um transgene. Em tese, um promotor que coordene a expressão do gene de uma proteína da pele pode induzir a expressão de qualquer transgene na pele. Esse é o truque usado para dirigir a expressão de um transgene para determinadas células de um camundongo. Preparado o conjunto promotor-transgene, o passo seguinte é injetá-lo em pró-núcleos de embriões. Estes são transferidos para o útero de fêmeas receptivas (em estado de falsa-prenhez, induzido pelo cruzamento com machos vasectomizados). Os filhotes nascem em 20 dias, mas ainda é necessário examinar o DNA para confirmar se tem o transgene e selecionar os positivos (transgênicos). 71
  14. 14. Por último, a proteína associada ao transgene é identificada nos filhotes e seu nível de expressão é medido em células específicas. Uma linhagem de camundongos transgênicos é com freqüência uma ferramenta poderosa para o estudo in vivo de processos biológicos. Podem-se reproduzir doenças humanas (câncer, diabetes, imunodeficiências e outras) ou alterar vias metabólicas específicas e avaliar em detalhes a atuação celular. Esses animais permitiriam grandes avanços em áreas como imunologia, neurologia, biologia celular e outras. Embora seja um grande avanço tecnológico, a geração de animais transgênicos tem limitações. Por ser aleatória, a integração do transgene ao DNA pode resultar na mutação de outro gene (e não do gene alvo). Também há variações no número de cópias integradas e no nível de expressão do transgene, ou seja, na quantidade produzida da proteína correspondente. Além disso, como o gene-alvo continua intacto, não se sabe a priori como sua expressão será afetada pelo transgene. Isso exige a geração de várias linhagens independentes de animais com o mesmo transgene, para comparar o efeito no organismo de diferentes doses da proteína em estudo. 72

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